血管內(nèi)皮生長因子和水通道蛋白1在肺挫傷肺組織和血清中的表達及意義*

孫大為 肖家榮 張 波 胡基平 陳 敏 騰 寅

(1.貴陽市第一人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550002；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001；3.貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001)

血管內(nèi)皮生長因子和水通道蛋白1在肺挫傷肺組織和血清中的表達及意義*

孫大為1肖家榮2張 波3胡基平1陳 敏1騰 寅2

(1.貴陽市第一人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550002；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001；3.貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001)

目的 探究血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和水通道蛋白1(AQP1)在肺挫傷模型大鼠肺組織和血清中的表達及意義。方法 選取90只SD大鼠，雌雄不拘，隨機分為實驗組和對照組各45只，兩組大鼠均禁食12 h，實驗組麻醉后采用胸部撞擊器撞擊右胸前壁，制作肺挫傷模型，對照組單純麻醉后處死，自模型制作或麻醉1 h后進行取材，兩組大鼠均部分切取挫傷區(qū)域肺組織或全肺組織，剪開腹腔暴露腹主動脈，用預(yù)先吸有1ml肝素鈉的注射器經(jīng)腹主動脈取3 ml外周血，分別對肺組織、血清中的VEGF、AQP1水平進行測定。結(jié)果 兩組大鼠肺組織HE染色結(jié)果顯示：實驗組病理學(xué)表現(xiàn)為不同程度的肺泡萎縮、肺泡水腫和肺間質(zhì)水腫，肺泡腔可見大量紅細胞，肺間質(zhì)炎性浸潤，有炎性細胞附著在毛細血管上，與對照組相比VEGF、AQP1表達增加(P<0.05)；外周血清檢測結(jié)果顯示，實驗組大鼠血清VEGF含量明顯增高，與對照組相比存在顯著差異(P<0.05)，但兩組大鼠外周血中的AQP1水平對比并無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論 肺挫傷模型大鼠肺組織中VEGF、AQP1表達增加，外周血中VEGF表達增加，但外周血中水通道蛋白1的表達并無顯著變化。

肺挫傷；大鼠；血管內(nèi)皮生長因子；水通道蛋白1；表達

胸外傷是臨床常見的意外傷之一，胸外傷患者多合并有不同程度的肺挫傷。近年來的研究顯示[1]，肺挫傷是肺實質(zhì)炎性反應(yīng)的結(jié)果，常伴隨有凝血功能和炎性反應(yīng)的異常，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是近年來發(fā)現(xiàn)的具有高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，組織缺血缺氧是誘導(dǎo)其分泌的主要原因，因此肺挫傷后機體可能表現(xiàn)出VEGF表達的異常變化[2]。而肺挫傷后必然伴隨不同程度的肺水腫，水通道蛋白(Aquaporin，AQP)-1是一種對水特異性通透的膜蛋白，近年來的研究表明其表達與肺水轉(zhuǎn)運有著顯著的相關(guān)性，因此AQP1的檢測能夠一定程度上為肺水腫的評估提供依據(jù)[3]。本研究就VEGF、AQP1在肺挫傷模型大鼠肺組織、血清中的表達情況進行了研究分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及分組

選取90只SD大鼠，均由xxx醫(yī)院動物中心提供，雌雄不拘，體重300～400 g，隨機分為實驗組和對照組各45只，兩組大鼠基本條件一致。

1.2 動物模型制備

對照組大鼠按照0.3 ml/100 g的劑量腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，麻醉1 h后剪開腹腔暴露腹主動脈，用預(yù)先吸有1 ml肝素鈉的注射器經(jīng)腹主動脈取3 ml外周血保留備用，之后斷頭處死，取全肺組織或與實驗組對應(yīng)的挫傷區(qū)肺組織備用；實驗組大鼠按照對照組方案進行麻醉，采用胸部撞擊器打擊大鼠右側(cè)胸部3～6肋骨，打擊部位直徑1.9 cm，打擊物與大鼠胸廓垂直距離20.0 cm，注意控制撞擊模式，避免肋骨骨折、血氣胸、心包積液等情況影響實驗結(jié)果，在撞擊完成取標(biāo)本前先探查動物胸腔，排除上述并發(fā)癥后取標(biāo)本，模型制作完成1h后與對照組同樣方法剪開腹腔，取3 ml外周血備用，斷頭處死，取挫傷區(qū)肺組織或全肺組織備用。

1.3 實驗方法

采用Westen-Blot法測定大鼠肺組織內(nèi)VEGF蛋白及AQP1表達情況，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作，用胞漿染色呈棕黃色的細胞作為陽性細胞，觀察高倍鏡下計數(shù)100個細胞中的陽性細胞。采用雙抗體夾心ABC-EILSA法進行VEGF、AQP1水平測定，每個樣本做3個復(fù)孔，調(diào)節(jié)樣本濃度與吸光度成正比，將標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，各濃度在酶標(biāo)儀上測出的吸光度作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線進行對比，獲得檢測數(shù)值。應(yīng)用常規(guī)HE染色、透射電鏡對挫傷肺組織周圍形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)進行觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 肺組織表達

兩組大鼠肺組織HE染色結(jié)果顯示，實驗組病理學(xué)表現(xiàn)為不同程度的肺泡萎縮、肺泡水腫和肺間質(zhì)水腫，肺泡腔可見大量紅細胞，肺間質(zhì)炎性浸潤，有炎性細胞附著在毛細血管上，與對照組相比VEGF、AQP1表達增加(P<0.05)。見表1。

表1 兩組肺挫傷模型大鼠肺組織中VEGF、AQP1表達結(jié)果對比

2.2 血清表達

實驗組大鼠血清VEGF含量明顯增高，與對照組相比存在顯著差異(P<0.05)，但兩組大鼠外周血中的AQP1水平對比并無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 兩組肺挫傷模型大鼠外周血VEGF、AQP1表達結(jié)果對比

3 討 論

肺挫傷后由于肺實質(zhì)受到損傷，發(fā)生炎性反應(yīng)，引起組織出血、水腫。肺挫傷的嚴(yán)重程度直接受到外力大小的影響，同樣也受到胸部柔韌性、彈性的影響[4]，因此本次實驗并未選擇自由落體撞擊模型，而是采用胸部撞擊器進行大鼠肺挫傷模型的制作，確保打擊力度均勻，兩組大鼠肺挫傷前后均未應(yīng)用呼吸機，很好地模擬了肺挫傷的實際發(fā)病過程，在模型建立前，所有大鼠呼吸正常，無口鼻分泌物，模型建立后大鼠呼吸次數(shù)增加，出現(xiàn)淺快呼吸，心率加速，少數(shù)大鼠口鼻溢出血性液體，兩組大鼠基本表現(xiàn)一致，以上實驗結(jié)果說明模型建立成功。

VEGF是血管內(nèi)皮細胞分泌的一種糖蛋白，廣泛存在于各個組織中，目前已知作用包括[5-6]：①促血管內(nèi)皮細胞增殖；②增加血管通透性；③趨化作用，加速單核細胞、中性粒細胞的遷移；④凝血調(diào)節(jié)作用，能夠促進血小板VEGF的釋放，引起局部高凝，但可以促進血管內(nèi)皮細胞損傷的修復(fù)，內(nèi)膜內(nèi)皮化，減少血栓的形成；⑤血管內(nèi)皮細胞保護作用，可有效對抗細胞凋亡。肺是VEGF的主要來源，正常情況下VEGF載肺泡II型上皮細胞和間質(zhì)中都有少量表達，但當(dāng)肺挫傷發(fā)生后，VEGF主要作為前炎性因子表達上調(diào)，從本次研究結(jié)果來看，實驗組大鼠肺組織中的VEGF過量表達，說明VEGF參與了肺挫傷后肺水代謝的異常過程，VEGF引起肺水腫的機制可能是通過炎性活化的有絲分裂原蛋白激酶信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，重新排列內(nèi)皮細胞鈣黏蛋白，使微循環(huán)內(nèi)蛋白和肺內(nèi)液體通過細胞旁通路進入肺泡和肺間隙，從而導(dǎo)致肺水腫的形成，該數(shù)據(jù)可認(rèn)為肺挫傷后VEGF表達上調(diào)可能促進了肺水腫的形成。此外，VEGF在肺挫傷模型大鼠的外周血中出現(xiàn)高表達，考慮可能與以下因素有關(guān)：①.肺挫傷導(dǎo)致肺組織缺氧缺血，刺激血管內(nèi)皮細胞分泌VEGF；②肺挫傷后大鼠肺泡毛細血管的屏障功能遭到破壞，VEGF從肺內(nèi)向血漿中釋放和轉(zhuǎn)移；③中性粒細胞也會分泌一定的VEGF，是炎性反應(yīng)早期的主要來源，兩者相互影響。但本文并未進行長時間的動態(tài)觀察，而Gangemi等[7]的研究顯示，肺挫傷患者發(fā)病早期VEGF表達上調(diào)，但隨著治療進展VEGF水平逐漸回落，指出肺缺氧條件是導(dǎo)致VEGF增加的重要因素。

AQP1是近年來肺水代謝疾病中研究較多的一種水特異性通透糖蛋白，相關(guān)研究表明[8]，肺挫傷后在瀑布式炎性級聯(lián)反應(yīng)的影響下，大鼠出現(xiàn)肺水腫，相應(yīng)的AQP1水平上調(diào)，因此肺挫傷模型大鼠肺組織中可檢測到AQP1明顯上升；但也有學(xué)者的研究顯示[9]大鼠肺挫傷模型建立后1 h內(nèi)肺組織AQP1水平降低。從本研究數(shù)據(jù)來看，實驗組大鼠肺組織中的AQP1水平明顯增加，可認(rèn)為AQP1的上調(diào)增加了肺泡毛細血管的通透性，導(dǎo)致肺內(nèi)液體在滲透壓差的驅(qū)動下，經(jīng)由毛細血管進入肺間質(zhì)，促進了肺水腫的形成；而肺內(nèi)的低氧環(huán)境會引起VEGF的高表達，VEGF的升高又會進一步通過多種途徑引起緊密連接蛋白occludin等結(jié)構(gòu)磷酸化，使其重新分布，改變血管內(nèi)皮的屏障功能，導(dǎo)致血管通透性升高，因此可以認(rèn)為VEGF和AQP1表達上調(diào)是導(dǎo)致肺水腫形成的共同因素。但AQP1的變化并未在大鼠外周血中體現(xiàn)，說明雖然肺挫傷模型大鼠肺組織出現(xiàn)AQP1表達水平改變，但主要局限在肺部，并未像VEGF一樣體現(xiàn)在外周血中。

綜上所述，肺挫傷模型大鼠肺組織中VEGF、AQP1表達增加，外周血中VEGF表達增加，但外周血中水通道蛋白1的表達并無顯著變化。

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Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Aquaporin 1 in lung tissue and pulmonary contusion serum

SUN Da-wei1XIAO Jia-rong2ZHANG Bo3HU Ji-ping1CHEN Min1TENG Yan2

(1.The First People's Hospital in Guiyang,Guiyang 550002,China;2.The Affiliated Hospital of Guizhou medical university,Guiyang 550001,China;3.The First Affiliated Hospital of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guiyang,550001,China)

Objective:To explore the vascular endothelial growth factor(VEGF) and aquaporin 1(AQP1) in rat lung tissue and pulmonary contusion model of Expression and significance of serum.Methods: 90 SD rats of either sex were randomly divided into experimental and control group 45, two groups of rats were fasted for 12h, the experimental group after anesthesia using right chest chest striker hit the front wall, making pulmonary contusion model, after the control group were anesthetized and sacrificed, from model-making or anesthesia 1h after drawn, two groups of rats were cut out part or all of the lung tissue contusion regional lung tissue, cut the abdominal cavity exposed the abdominal aorta with 1ml heparin has previously sucked the abdominal aorta 3ml syringe peripheral blood, respectively, lung, serum VEGF, AQP1 levels were measured.Results: The rat lung tissue HE staining showed that the experimental group showed different degrees of pathological alveolar atrophy, interstitial and alveolar edema, pulmonary edema, alveolar space seen a large number of red blood cells, interstitial lung inflammatory infiltration with inflammatory cells attached to the capillary, as compared with the control group, VEGF, AQP1 expression increased(P<0.05); peripheral serum test results show, VEGF serum content was significantly higher in the experimental group, there were significant differences compared with the control group(P<0.05), but the two groups of rats in the peripheral blood levels of AQP1 contrast there was no significant difference(P>0.05).Conclusion:The rat lung tissue pulmonary contusion model of VEGF, AQP1 increased expression, increased expression of VEGF in peripheral blood, peripheral blood but there was no significant change in the expression of aquaporin 1.

pulmonary contusion; rats; vascular endothelial growth factor; aquaporin 1; Expression

貴陽市衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)計劃項目(編號：2014 筑衛(wèi)科技合同字第 021 號)。

孫大為(1981—)，男，貴州貴陽人，主治醫(yī)師，本科，主要從事胸外科微創(chuàng)工作。

肖家榮(1962—)，男，貴州貴陽人，主任醫(yī)師，本科，主要研究方向：局部晚期肺癌的手術(shù)治療。

R655.3

A

1004-7115(2017)02-142-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.02.007

2016-11-26)