miR-320a靶向FOXQ1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的分子機(jī)制

湯增秋，熊小亮

(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，江西南昌330006)

miR-320a靶向FOXQ1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的分子機(jī)制

湯增秋，熊小亮

(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，江西南昌330006)

目的探討miR-320a在人結(jié)腸癌細(xì)胞中的生物學(xué)行為，并初步闡明miR-320a對(duì)癌基因FOXQ1的靶向調(diào)控機(jī)制。方法采用qRT-PCR檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-320a和FOXQ1的表達(dá)；用miR-320a mimics轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞株HTC-116；采用CCK-8法、克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)miR-320a對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響，采用Transwell小室分析miR-320a對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響；雙熒光素酶報(bào)告基因和Western Bloting驗(yàn)證miR-320a對(duì)FOXQ1的靶向調(diào)控作用。結(jié)果QRT-PCR結(jié)果顯示miR-320a mimics明顯上調(diào)miR-320a在HCT-116細(xì)胞中的表達(dá)；CCK-8法和克隆形成試驗(yàn)顯示上調(diào)miR-320a表達(dá)顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖；Transwell試驗(yàn)表明上調(diào)miR-320a可抑制HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲；蛋白印跡實(shí)驗(yàn)顯示上調(diào)miR-320a降低FOXQ1蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)miR-320a可以調(diào)控FOXQ1的表達(dá)。結(jié)論過表達(dá)miR-320a可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲，這種抑制作用是通過靶向調(diào)控FOXQ1來實(shí)現(xiàn)的。

miR-320a；結(jié)腸癌；FOXQ1

結(jié)腸癌屬常見的消化道惡性腫瘤，其在我國的發(fā)生率仍然呈明顯的增高趨勢(shì)[1]。過去30年來，結(jié)腸癌患者的5年生存率有所提高[2]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)腸癌5年生存率為74%，根治手術(shù)率為85%[3]。然而，至今為止，結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，影響結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍有待闡明。

miRNAs是19~24核苷酸長度的小片段非編碼RNA，通過直接靶向作用mRNA的3’UTR端抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄或促進(jìn)靶基因的降解[4]。許多研究表明，多種miRNAs在大腸癌中異常表達(dá)[5-8]，參與調(diào)節(jié)大腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為[9，10]，這其中包括miR-320家族成員[11]。miR-320a是新近發(fā)現(xiàn)的miRNA，其在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其調(diào)控的靶基因罕見報(bào)道。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-320a在結(jié)腸癌組織和結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)[12]，通過上調(diào)miR-320a的表達(dá)可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[13，14]，但其作用的機(jī)制尚不清楚。

FOXQ1屬于叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，在細(xì)胞生長、代謝、凋亡及癌變等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[15，16]。研究顯示，F(xiàn)OXQ1與人類腫瘤關(guān)系密切，在結(jié)直腸癌[17，18]、乳腺癌[19]、卵巢癌[20]、肺癌[21]、肝癌[22]等不同腫瘤中都出現(xiàn)高表達(dá)，并增強(qiáng)腫瘤的生長、遷移[17，19，20，23].在結(jié)直腸癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)可能存在幾種不同的調(diào)控FOXQ1表達(dá)的方式，例如Wnt信號(hào)通路[18，24]、TGF-β[24]、miR-342[25]，F(xiàn)OXQ1的激活進(jìn)一步影響其下游靶基因如Fra-1[26]、p21[27]、Twist1[28]，從而促進(jìn)腫瘤血管生成、腫瘤再生、腫瘤微環(huán)境改變以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。上述研究表明，F(xiàn)OXQ1在結(jié)直腸癌中受到多種因子的調(diào)控，但是在結(jié)腸癌中，miR-320a是否是FOXQ1另一個(gè)調(diào)控因子，尚不清楚。

生物信息學(xué)軟件提示，miR-320a在FOXQ1 3’端非翻譯區(qū)存在潛在結(jié)合位點(diǎn)。因此，我們首次提出miR-320a在結(jié)腸癌中下調(diào)FOXQ1表達(dá)的假設(shè)，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一假設(shè)。

1 材料與方法

1.1 材料McCoy’s 5A培養(yǎng)基（武漢博士德公司），胎牛血清（北京全式金公司），Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司），雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（美國Promega公司），Transwell小室（美國Corning公司），結(jié)晶紫（上海高創(chuàng)公司），F(xiàn)OXQ1（美國Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞株的培養(yǎng)及傳代實(shí)驗(yàn)選用人HCT116細(xì)胞株，人HCT116細(xì)胞株為南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研中心提供。HCT116細(xì)胞株用含10%胎牛血清及1%青霉素和1%鏈霉素雙抗的McCoys’5A培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度約80%-90%時(shí)，用EDTA胰酶進(jìn)行消化，適時(shí)加入血清終止消化，常規(guī)傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)選對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染人miR-320a mimics及陰性對(duì)照小干擾RNA購于上海吉馬公司。按照脂質(zhì)體2000試劑使用說明操作，將miR-320a mimics轉(zhuǎn)染miR-320a低表達(dá)的HCT116細(xì)胞，并設(shè)立NC轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染后6h更換為完全培養(yǎng)基。

1.2.3 QRT-PCR檢測(cè)標(biāo)本中miR-320a表達(dá)常規(guī)TRIzol試劑抽提總RNA，使用cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用qPCR SuperMix進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，U6和GAPDH分別作為檢測(cè)miR-320a和FOXQ1的指標(biāo)。用目的基因表達(dá)量=2-△△Ct公式計(jì)算各樣本中miR-320a和FOXQ1的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blot檢測(cè)miRNA轉(zhuǎn)染后靶基因蛋白表達(dá)分別提取處理后各組細(xì)胞的總蛋白，并用10%SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白分離。通過濕法轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上，接著用5%的脫脂奶粉將膜封閉。按試劑盒說明書配置FOXQ1的一抗和二抗，先加入一抗4℃水平搖床過夜，然后加入二抗水平搖床反應(yīng)60min。用化學(xué)發(fā)光試劑盒行化學(xué)發(fā)光顯色。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染24h后，取HCT116細(xì)胞接種于96孔板。每孔加入溶液，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，用CCK-8法測(cè)細(xì)胞活力。

1.2.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長期HCT116細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)，調(diào)整成103個(gè)細(xì)胞接種于6cm2培養(yǎng)皿中，約2周后用甲醇固定并用1g/L結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)肉眼可見的克隆形成數(shù)，克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)24h后，常規(guī)消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種于Transwell小室中，上室加入200μl無血清的McCoy’5A培養(yǎng)基，下室加入含10%FBS的McCoy’5A培養(yǎng)基500μl，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞，并計(jì)數(shù)取平均值。

1.2.8 熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)利用引物和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增與miR-320a有潛在結(jié)合位點(diǎn)的FOXQ1 3’非翻譯區(qū)序列。通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離并回收PCR產(chǎn)物，后將FOXQ1 3’UTR片段植入psiCHECK-2質(zhì)粒中構(gòu)建構(gòu)建psiCHECK-2-FOXQ1-3’UTR表達(dá)載體，并驗(yàn)證重組克隆片段的序列信息。將細(xì)胞均勻接種于96孔板中（每1個(gè)孔2×104個(gè)細(xì)胞/100μl），第2d分別轉(zhuǎn)染miR-320a mimics及陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48h后，細(xì)胞經(jīng)雙蒸水稀釋后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入80μl的細(xì)胞裂解液，振蕩裂解細(xì)胞1h，12，000r/min離心1min沉淀雜質(zhì)。吸出上清液，加入不透明96孔板中，并依次加入螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶底物。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，記錄并分析數(shù)據(jù)。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 miR－320a對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響轉(zhuǎn)染24h后，采用qRT－PCR檢測(cè)miR－320a表達(dá)，結(jié)果提示miR－320a mimics顯著提升了HCT116細(xì)胞中miR－320a的水平，見圖1a。CCK－8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果分別顯示轉(zhuǎn)染miR－320a mimics后的HCT116細(xì)胞活力明顯下降，且其細(xì)胞克隆數(shù)較陰性對(duì)照組也明顯減少，兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．5）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，miR－320a mimics抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。綜上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明上調(diào)miR－320a的表達(dá)顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。

圖1 上調(diào)miR-320a顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的增殖

2．2 miR－320a對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響轉(zhuǎn)染后48h，Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果顯示，上調(diào)miR－320a的水平HCT116細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)在侵襲實(shí)驗(yàn)中明顯降低，見圖2。上述結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

圖2 過表達(dá)miR-320a抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的侵襲（熒光× 200）

2．3 miR－320a在結(jié)腸癌細(xì)胞中與FOXQ1之間的相互關(guān)系為了驗(yàn)證FOXQ1是否是miR－320a的直接靶基因，行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR－320a mimics組熒光酶活性降低，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見圖3a。進(jìn)一步，Western blot實(shí)驗(yàn)表明miR－320a可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控FOXQ1的表達(dá)，見圖3b。上述結(jié)果提示，在結(jié)腸癌細(xì)胞中，F(xiàn)OXQ1是miR－320a的直接靶標(biāo)。

圖3 miR-320a靶向調(diào)控FOXQ1的表達(dá)

3 討論

研究顯示miR－320a在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種癌癥中表達(dá)下調(diào)[26]，也有一些實(shí)驗(yàn)探究了miR－320a在結(jié)腸癌中的潛在功能。例如，Zhang Y等[27]發(fā)現(xiàn)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者中miR－320a的表達(dá)水平明顯降低，miR－320a通過直接結(jié)合于神經(jīng)菌毛素1的3’UTR抑制結(jié)腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的遷移和侵襲能力。Hur K等[13]人多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，也認(rèn)為miR－320a可以作為檢測(cè)結(jié)腸癌患者癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)指標(biāo)。Sun JY等[28]人報(bào)道了miR－320a還可以靶向作用β－catenin抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。這些研究顯示，miR－320a可以多通路多角度地抑制結(jié)腸癌的發(fā)展進(jìn)程。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR－320a可以抑制HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了miR－320a在結(jié)腸癌中的生物學(xué)功能。但是在miR－320a調(diào)控機(jī)制上，本研究結(jié)果首次顯示miR－320a通過靶向癌基因FOXQ1抑制結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

FOXQ1基因定位在6p25．3，作為一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可通過識(shí)別并結(jié)合相關(guān)下游靶基因的近端或遠(yuǎn)端順式作用元件，實(shí)現(xiàn)對(duì)眾多下游靶基因表達(dá)水平的正向或負(fù)向調(diào)控。研究人員已經(jīng)證明，F(xiàn)OXQ1可能在人類腫瘤發(fā)生中起作用，尤其是在消化道腫瘤中的作用已成為近年研究的熱點(diǎn)。Kaneda H等[17]發(fā)現(xiàn)FOXQ1在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤形成、生成、血管生成和抗凋亡。Peng X等[24]也證實(shí)，F(xiàn)OXQ1在結(jié)直腸癌中過表達(dá)，并與結(jié)直腸癌臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)FOXQ1作為下游靶基因被多種分子調(diào)控。在結(jié)直腸癌中，F(xiàn)OXQ1被發(fā)現(xiàn)是Wnt信號(hào)通路的新靶基因[18]，也可以靶向作用TGF-β信號(hào)因子[24]。此外，有研究報(bào)道提示某些miRNA可以直接靶向FOXQ1影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)過程。最近的一項(xiàng)研究顯示，在結(jié)直腸癌中，miR-342是FOXQ1的調(diào)控因子，過表達(dá)或抑制miR-342水平能調(diào)控FOXQ1基因的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞表型的變化[29]。生物學(xué)信息分析提示，miR-320a與FOXQ1存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)，因此，我們篩選出miR-320a做進(jìn)一步的研究。本研究中，通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明，miR-320a直接與FOXQ1的3’非編碼區(qū)結(jié)合抑制FOXQ1的轉(zhuǎn)錄，通過蛋白印劑實(shí)驗(yàn)證明，miR-320a可以抑制FOXQ1的蛋白表達(dá)。我們的研究結(jié)果顯示miR-320a通過靶向FOXQ1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲，為miR-320a在腸癌中的作用增添了新的機(jī)制。

總之，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-320a可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，其抑制作用是通過靶向癌基因FOXQ1來實(shí)現(xiàn)的，闡明了miR-320a通過FOXQ1介導(dǎo)抑制結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展，為結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制和診斷治療的研究提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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miR-320a inhibits cell proliferation and invasion in colon cancer by targeting FOXQ1

TANG Zengqiu，XIONG Xiaoliang. Department of Pathology and Pathophysiology，Medical College of Nanchang University，Nanchang 330006，China.

Objective To investigate the effect of miR-320a on colon cancer biological process，and clarify whether FOXQ1 is a direct target of miR-320a in HCT116 cells.Methods The expression of miR-320a and FOXQ1 was detected by Real-time PCR in colon cancer cells.The HTC-116 colon cancer cell line was transfected with miR-320a mimics.The CCK8 and colony formation assay were used to evaluate the cell proliferation.Transwell chamber was utilized to analyze the effects of miR-320a on invasion of HCT116 cells.Western blot and dual luciferase reporter experiments were employed to examine the regulation of miR-320a on FOXQ1.Results The result of Real-time PCR analysis indicated that miR-320a mimics significantly increased miR-320a levels in HCT-116 cells.The CCK8 and colony formation assay results showed miR-320a inhibited the HCT-116 cell proliferation.Up-regulation of miR-320a impaired the invasive abilities of HCT-116 cells.The Western blot results showed miR-320a reduced FOXQ1 protein level and double-luciferase reporter experiments，confirming that miR-320a could directly regulate FOXQ1 expression in colon cancer cells further.Conclusion miR-320a inhibited cell proliferation，migration and invasion by directly targeting FOXQ1.

miR-320a；FOXQ1；Colon cancer

R735.3+5，Q522

A

1674-1129(2017)02-0167-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.009

2017-02-13；

2017-02-14)

湯增秋，男，1988年生，南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)在讀研究生，主要研究法醫(yī)病理學(xué)與法醫(yī)DNA。

熊小亮，男，1970年生，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究病理學(xué)與病理生理學(xué)。