黃花菜無(wú)菌播種試驗(yàn)

褚煥寧，侯非凡，賈焱，李芳芳，李曉琳，李森，亢秀萍，邢國(guó)明

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801）

黃花菜無(wú)菌播種試驗(yàn)

褚煥寧，侯非凡，賈焱，李芳芳，李曉琳，李森，亢秀萍，邢國(guó)明

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801）

黃花菜（Hemerocallis citrina Baroni）兼具食用、觀賞和藥用價(jià)值，為了提升雜交育種后代的繁殖速度，試驗(yàn)以黃花菜種子為材料，經(jīng)過(guò)不同的預(yù)處理和消毒處理后接種于MS培養(yǎng)基上進(jìn)行無(wú)菌萌發(fā)，培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計(jì)種子的污染率和發(fā)芽率；分不同生理苗齡建立適宜的煉苗體系。結(jié)果表明，浸泡24 h后剝?nèi)ズ谏镔|(zhì)外種皮和茸毛狀內(nèi)種皮，露出白色胚乳的預(yù)處理方式種子的污染率最低，為6%，萌發(fā)率最高，為80%；70%酒精30 s＋0.1%升汞消毒處理5，10 min，種子的污染率均較低，分別為8%和6%，消毒10 min種子的萌發(fā)率低于5 min；植株自然高度在6 cm以上的，移栽20 d后統(tǒng)計(jì)的成活率為100%。試驗(yàn)可為萱草屬植物雜交后代的快速繁殖提供理論基礎(chǔ)。

黃花菜；種子；無(wú)菌播種；幼苗；煉苗

黃花菜（Hemerocallis citrina Baroni）為百合科萱草屬宿根草本植物[1]，又叫金針菜、忘憂草，是我國(guó)的一種特產(chǎn)蔬菜[2]。全屬約14種，原產(chǎn)于中國(guó)、日本、朝鮮等地，其中，原產(chǎn)于我國(guó)的有11種，在我國(guó)有著悠久的栽培歷史[3-4]。黃花菜資源非常豐富，應(yīng)用廣泛，觀為花，食為菜，用為藥。因其花型美麗可愛(ài)，群體花期長(zhǎng)，葉叢優(yōu)美，既可觀花又可觀葉，又因其對(duì)環(huán)境條件要求不嚴(yán)格，管理粗放，因此，可種植于疏林草地作地被觀賞，種植于庭院、公園作花壇、花境等進(jìn)行觀賞，還可植于道路兩旁及隔離帶，具有很高的綠化和觀賞價(jià)值[5-9]。黃花菜又是我國(guó)特產(chǎn)蔬菜，既可鮮食又可制成干菜食用，美味可口[10]。另外，黃花菜中含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、糖和鈣、磷等礦物質(zhì)，具有抗衰老、消炎解毒，健腦、安神、明目等功效[11]。

黃花菜的繁殖方式多為分株繁殖。分株繁殖在較短時(shí)間內(nèi)可獲得具有開(kāi)花能力的植株，并能保持品種特性，但繁殖系數(shù)低，易攜帶病蟲(chóng)草害，種苗成本高等[12]，難以滿足種苗規(guī)?；a(chǎn)的需求。種子繁殖得到的實(shí)生苗根系發(fā)達(dá)，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，但繁殖生產(chǎn)周期長(zhǎng)，一般適用于雜交育種[13]。在雜交育種中，由于存在雜交不親和現(xiàn)象，獲得較少的雜交種子時(shí)，為提高種子的發(fā)芽率，同時(shí)加快種子成苗，會(huì)借助無(wú)菌播種，即將種子消毒處理后接種在培養(yǎng)基上萌發(fā)，成苗后煉苗移栽，在短時(shí)間內(nèi)可獲得大量實(shí)生苗[14-15]。這是培育黃花菜新品種采用的主要措施。

在前期試驗(yàn)黃花菜種子穴盤播種育苗的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，黃花菜種子播種后萌發(fā)時(shí)間長(zhǎng)、萌發(fā)率低。本試驗(yàn)采用無(wú)菌播種的方法，研究不同預(yù)處理方式和消毒方式對(duì)種子萌發(fā)時(shí)間、發(fā)芽率和污染率的影響，以期縮短黃花菜種子的發(fā)芽時(shí)間，提高種子的發(fā)芽率，建立種子的無(wú)菌播種體系，從而提高雜交后代的繁殖速度，縮短育種周期[15]，為萱草屬植物雜交后代的快速繁殖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)黃花菜種質(zhì)資源圃收集的地方品種茄子花1號(hào)（2n＝22）。于2015年9—10月收集種子，并在陰涼通風(fēng)處晾干。

1.2 方法

選取大小一致飽滿的種子，接種前對(duì)種子進(jìn)行洗滌、蒸餾水浸泡、0.1%高錳酸鉀浸泡、剝皮、熱水浸種預(yù)處理；預(yù)處理后在超凈工作臺(tái)對(duì)種子進(jìn)行表面消毒、浸泡消毒；將已消毒的種子接種到MS培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種2粒，每個(gè)處理接種25瓶。將接種好的培養(yǎng)瓶置于25℃、相對(duì)濕度60%～70%的組織培養(yǎng)室中進(jìn)行暗培養(yǎng)。種子萌發(fā)后進(jìn)行光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2 500 lx，每天光照16 h。

無(wú)菌播種7 d后統(tǒng)計(jì)種子的污染數(shù)和萌發(fā)數(shù)，并記錄進(jìn)行分析。

1.2.1 傳統(tǒng)催芽播種對(duì)黃花菜種子萌發(fā)的影響將種子放在培養(yǎng)皿中，上下覆蓋浸濕蒸餾水的紗布，在25℃、相對(duì)濕度60%～70%的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽，定期更換蒸餾水，清洗發(fā)霉種子，觀察種子萌發(fā)情況，將露白種子拿到溫室進(jìn)行播種，播種基質(zhì)V草炭∶V珍珠巖＝2∶1。每天觀察記錄種子的萌發(fā)情況。

1.2.2 不同預(yù)處理方式對(duì)黃花菜種子萌發(fā)的影響

分別設(shè)置不同方式的預(yù)處理：A1.洗潔精洗滌，流動(dòng)自來(lái)水沖洗干凈，蒸餾水浸泡種子24 h；A2.洗潔精洗滌，0.1%高錳酸鉀浸泡30 min，蒸餾水浸泡24 h；A3.蒸餾水浸泡24 h后剝?nèi)ズ谏镔|(zhì)外種皮，露出里面茸毛狀內(nèi)種皮，50℃熱水處理后攪拌冷卻；A4.蒸餾水浸泡24 h后剝?nèi)ズ谏镔|(zhì)外種皮和茸毛狀內(nèi)種皮，露出白色胚乳，沖洗干凈。

預(yù)處理后在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行消毒處理，70%酒精30 s＋0.1%HgCl25 min，接種到蔗糖濃度為3%的MS培養(yǎng)基上。

1.2.3 不同消毒方式對(duì)黃花菜種子萌發(fā)的影響將茄子花1號(hào)種子用蒸餾水浸泡24 h后剝?nèi)ズ谏镔|(zhì)外種皮和茸毛狀內(nèi)種皮，露出白色胚乳，沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行不同方式的消毒處理：B.70%酒精消毒30 s，2，5 min，分別編碼為B1，B2，B3；C.70%酒精30 s＋6%NaClO消毒3，10，15 min，分別編碼為C1，C2，C3；D.70%酒精30 s＋0.1% HgCl2消毒3，5，10 min，分別編碼為D1，D2，D3。

消毒處理后接種到蔗糖濃度為3%的MS培養(yǎng)基上。

1.2.4 煉苗移栽無(wú)菌播種種子萌發(fā)后統(tǒng)一煉苗：種子剛露白（E1）；植株自然高度1～3 cm（E2）；植株自然高度4～6 cm（E3）；植株自然高度6 cm以上（E4），將4個(gè)生長(zhǎng)階段的幼苗種植到溫室進(jìn)行煉苗處理，基質(zhì)V草炭∶V珍珠巖＝2∶1，前7 d在陰涼處煉苗，而后逐漸見(jiàn)光。

每7d觀察統(tǒng)計(jì)苗子的成活率和生長(zhǎng)狀況。長(zhǎng)勢(shì)程度分為：良好（葉色深綠，葉片挺拔，長(zhǎng)勢(shì)旺盛）、一般（葉色淺綠，葉片卷曲，長(zhǎng)勢(shì)較弱）、較差（葉片發(fā)黃，葉片萎蔫，長(zhǎng)勢(shì)很弱）。

茄子花1號(hào)種子無(wú)菌發(fā)芽及煉苗過(guò)程如圖1所示。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)催芽播種對(duì)黃花菜種子萌發(fā)的影響

茄子花1號(hào)種子催芽過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，催芽第5天種子開(kāi)始露白，第5～12天大部分種子露白，歷時(shí)8 d，7個(gè)種子發(fā)霉腐爛，11個(gè)種子到第40天仍無(wú)出芽跡象。種子催芽萌發(fā)率為64%，播種成苗率為81.25%（表1）。

表1 傳統(tǒng)催芽播種對(duì)黃花菜種子萌發(fā)的影響

2.2 不同預(yù)處理方式對(duì)黃花菜種子萌發(fā)的影響

本試驗(yàn)對(duì)茄子花1號(hào)種子進(jìn)行了4種不同預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅用蒸餾水或高錳酸鉀浸泡，種子污染嚴(yán)重，發(fā)芽率很低，無(wú)法進(jìn)行種子的繁殖，對(duì)種子進(jìn)行剝皮處理后，污染率極顯著降低，同時(shí)剝?nèi)?nèi)外種皮，萌發(fā)率極顯著升高。由表2可知，不對(duì)種子進(jìn)行剝皮預(yù)處理，污染率高達(dá)90%～96%，萌發(fā)率僅為4%～8%；而剝掉外面黑色革質(zhì)外種皮，污染率極顯著降到10%，萌發(fā)率為8%；同時(shí)剝掉黑色革質(zhì)外種皮和茸毛狀內(nèi)種皮，污染率降為6%，顯著低于只剝掉黑色革質(zhì)外種皮，發(fā)芽率為80%，極顯著高于其他處理。因此，無(wú)菌萌發(fā)過(guò)程中剝?nèi)シN子內(nèi)外種皮，可極顯著降低污染率，同時(shí)極顯著提高種子的萌發(fā)率。

表2 不同預(yù)處理方式對(duì)黃花菜種子無(wú)菌萌發(fā)的影響

2.3 不同消毒方式對(duì)黃花菜種子萌發(fā)的影響

本試驗(yàn)選用了3種組織培養(yǎng)中常用的消毒劑：70%酒精，5%NaClO，0.1%HgCl2。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，污染率隨著消毒劑強(qiáng)度的增大而降低，萌發(fā)率卻有隨消毒劑強(qiáng)度增大而降低的趨勢(shì)。由表3可知，僅用酒精消毒，污染率高達(dá)90%以上，萌發(fā)率為70%～90%；70%酒精結(jié)合5%NaClO消毒，污染率為30%～34%，萌發(fā)率為76%～90%，效果略好；70%酒精結(jié)合0.1%升汞消毒，效果最好，污染率極顯著降低，僅為6%～12%，萌發(fā)率為62%～82%。綜合污染率和萌發(fā)率考慮，僅用酒精和酒精結(jié)合NaClO消毒處理的萌發(fā)率雖較高，但是污染率也很高，不適合對(duì)種子進(jìn)行消毒；酒精結(jié)合升汞對(duì)種子滅菌10 min，污染率降到了最低，但萌發(fā)率也隨之降低，也不適合進(jìn)行無(wú)菌萌發(fā)種子的消毒；酒精結(jié)合升汞消毒3，5 min，污染率分別為6%和4%，萌發(fā)率分別為82%和78%，較適宜進(jìn)行種子的消毒處理。

表3 不同消毒方式對(duì)黃花菜種子無(wú)菌萌發(fā)的影響

2.4 煉苗移栽

由表4可知，4個(gè)不同生長(zhǎng)階段的煉苗成活率差異達(dá)極顯著水平。其中，剛露白種子（E1）移栽到穴盤里，成苗率最低；植株自然高度為1～3 cm（E2），20 d后成活率為12.5%，長(zhǎng)勢(shì)較差；植株自然高度為3～6 cm（E3），20 d后成活率為75%，長(zhǎng)勢(shì)一般；植株自然高度在6 cm以上（E4），20 d后成活率為100%，長(zhǎng)勢(shì)良好。

表4 煉苗情況

3 結(jié)論與討論

茄子花1號(hào)種子傳統(tǒng)恒溫培養(yǎng)箱催芽播種過(guò)程中，種子集中露白時(shí)間為第5～12天，歷時(shí)8 d，種子的發(fā)芽率為64%，成苗率為81.25%；無(wú)菌播種過(guò)程中，種子露白時(shí)間集中在前7 d，種子發(fā)芽率可達(dá)到82%且發(fā)芽后在培養(yǎng)基生長(zhǎng)較快，待植株自然高度達(dá)到6 cm以上煉苗移栽，成苗率為100%。因此，無(wú)菌播種縮短了發(fā)芽和生根長(zhǎng)葉時(shí)間，經(jīng)后期煉苗移栽成活率高達(dá)100%，有利于萱草屬植物種子的快速繁殖。

在種子萌發(fā)試驗(yàn)中，僅對(duì)種子進(jìn)行簡(jiǎn)單的蒸餾水浸泡預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，種子的污染率高達(dá)90%以上且發(fā)芽率很低，在排除種子質(zhì)量、環(huán)境等問(wèn)題造成的污染率較高、萌發(fā)率較低的基礎(chǔ)上，對(duì)種子進(jìn)行熱水浸泡、高錳酸鉀浸泡、剝皮等處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，污染率降低，發(fā)芽率提高。對(duì)于種子無(wú)菌發(fā)芽，預(yù)處理除菌方式很多。張文蓮等[16]通過(guò)萱草種子無(wú)菌培養(yǎng)研究其快繁技術(shù)的試驗(yàn)中，采用0.3%高錳酸鉀溶液對(duì)萱草種子浸泡30 min進(jìn)行消毒，本試驗(yàn)借鑒此消毒方法；徐永清等[17]采用70℃干熱處理，48 h冷卻后沖洗的方法對(duì)月見(jiàn)草種子進(jìn)行除菌，結(jié)果表明，種子經(jīng)干熱處理后污染率由原來(lái)的85%降低到12.5%，因此，干熱處理可以起到除菌作用。

本試驗(yàn)采用蒸餾水浸泡24 h后剝?nèi)ズ谏镔|(zhì)外種皮和茸毛狀內(nèi)種皮，露出白色胚乳的種子接種到培養(yǎng)基上，污染率最低，為6%，萌發(fā)率最高，為80%；剝?nèi)シN皮種子的萌發(fā)率顯著高于未剝?nèi)シN皮種子的萌發(fā)率，且剝?nèi)シN皮后種子萌發(fā)較快而且整齊，這與周曉杰等[18]在百合遠(yuǎn)緣雜交種子快繁方法中的研究結(jié)果一致。張日清等[19]對(duì)櫸樹(shù)種子進(jìn)行剝殼預(yù)處理后，種子萌動(dòng)時(shí)間由60 d縮短到10 d。

對(duì)于萱草種子形狀不規(guī)則，外種皮革質(zhì)，致密光滑，內(nèi)種皮茸毛狀，不剝皮消毒污染率極高，剝?nèi)ネ夥N皮和內(nèi)種皮，再進(jìn)行消毒處理能顯著降低污染率，可能是由種子內(nèi)部有真菌感染所導(dǎo)致的。70%酒精＋0.1%升汞消毒處理，污染率最低，為6%～12%，但隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，種子的萌發(fā)率隨之降低，可能是HgCl2有很強(qiáng)的毒性，經(jīng)過(guò)HgCl2消毒處理后，HgCl2直接與種子的胚乳接觸而將種子殺死，導(dǎo)致其最終發(fā)芽率降低[20]。

常用的外植體消毒劑有70%～75%酒精，2%～10%NaClO，0.1%～1%的HgCl2[21]。本試驗(yàn)使用單一消毒劑和2種消毒劑結(jié)合使用，其中，70%酒精30 s＋0.1%HgCl2結(jié)合使用的消毒效果最佳，其中，70%酒精30 s＋0.1%HgCl210 min，污染率降低到了6%。還可以對(duì)污染的種子進(jìn)行二次消毒，以再次降低污染率。趙玉芬等[15]研究了大花萱草雜交種子試管內(nèi)萌發(fā)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)污染的種子重新消毒可降低污染率。

組培苗的煉苗移栽，盡管植株自然生長(zhǎng)高度在3 cm以上的成活率達(dá)到75%～100%，移栽后植株葉片生長(zhǎng)較快，但葉片發(fā)黃卷曲，植株整體纖細(xì)瘦弱，長(zhǎng)勢(shì)較弱。種子得到的苗子基本無(wú)須根，根量很少且根較長(zhǎng)，導(dǎo)致煉苗時(shí)整體長(zhǎng)勢(shì)較弱。本試驗(yàn)對(duì)此研究不夠深入，今后可在培養(yǎng)基中添加激素誘發(fā)更多根系，同時(shí)選擇可誘發(fā)根系的栽培基質(zhì)進(jìn)行栽培，以得到粗壯、長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)的植株。

［1］吳鐵明，于曉英，馮爽英，等.野生重瓣大花萱草的選育Ⅱ.組織培養(yǎng)快速繁殖[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002（4）：305-307.

［2］蘇承剛，張興國(guó)，張盛林.黃花菜根狀莖組織培養(yǎng)研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，21（5）：427-429.

［3］汪發(fā)贊，唐進(jìn).中國(guó)植物志第十四卷[M].北京：科學(xué)出版社，1980：52-62．

［4］熊治廷，陳心啟，洪德元.中國(guó)萱草屬數(shù)量分類研究[J].植物分類學(xué)報(bào)，1997，35（4）：311-316.

［5］王漢海，程貫召，杜延飛.大花萱草新品種“金娃娃”的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊，2002，38（5）：458.

［6］邵春艷.萱草新品種的引種栽培及抗旱性研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2009.

［7］邱收.幾個(gè)萱草屬植物的耐鹽性研究[D].長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［8］吳躍輝，莊志勇，吉賽群，等.美國(guó)大花萱草引種及生態(tài)適應(yīng)性研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（6）：29-31.

［9］孫徐骉，武榮花.萱草屬植物研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，45（4）：7-11，18.

［10］杜秉健.黃花菜水醇提取物的抗抑郁和促睡眠活性及綜合利用研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

［11］韓志平，張春業(yè)，馬櫻芳，等.黃花菜采后生理與貯藏保鮮技術(shù)研究進(jìn)展[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（1）：103-106.

［12］鐵曼曼，楊峰，譚華強(qiáng)，等.黃花組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（9）：147-151.

［13］趙天榮，徐志豪，黃堅(jiān)，等.大花萱草繁殖技術(shù)研究[J].寧波農(nóng)業(yè)科技，2015（2）：14-17.

［14］郭志海，金立敏，周玉珍.不同品種大花萱草果實(shí)及種子特性比較[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（17）：3768-3770.

［15］趙玉芬，儲(chǔ)博彥，尹新彥，等.大花萱草雜交種子試管內(nèi)萌發(fā)及快繁技術(shù)研究[J].種子，2013，32（1）：121-123.

［16］張文蓮，安娜.萱草種子無(wú)菌培養(yǎng)及快繁技術(shù)研究[J].青海農(nóng)林科技，2008（2）：17-19.

［17］徐永清，李海燕，王光海，等.月見(jiàn)草種子的無(wú)菌萌發(fā)條件[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（33）：18832-18834.

［18］周曉杰，樊金萍，龔束芳，等.百合遠(yuǎn)緣雜交種子快繁方法的研究[J].作物雜志，2009，42（3）：110-113.

［19］張日清，劉海龍，汪靈丹，等.櫸樹(shù)無(wú)菌播種技術(shù)[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2013，31（1）：139-142.

［20］梁毅，王永勤，關(guān)絢麗，等.不同消毒方法在洋蔥組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（21）：223-226.

［21］鞏振輝.園藝植物生物技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2008.

Study on the Aseptic Seeding ofHemerocallis citrinaBaroni

CHUHuanning，HOUFeifan，JIAYan，LI Fangfang，LI Xiaolin，LI Sen，KANGXiuping，XINGGuoming
（College ofHorticulture，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Hemerocallis citrina Baroni have both edible,ornamental and medicinal values.To improve the speed of propagation of filial generation,the paper inoculated the Hemerocallis citrina Baroni seeds on MS culture medium after being pretreated and degermed with different methods,calculated the contamination rate and germination rate 7 days later and established the best suitable acclimatization system according to different physiological stages of seedlings.The results showed that the pretreatment of husking the black epidermis and the trichome internal epidermis to show the white endosperm after being soaked for 24 hours had the lowest contamination rate（6%）and the highest germination rate（80%）.The degerming effect of70%ethanol（30 s）＋0.1%HgCl2（5,10 min）on the surface of seeds had the lower contamination rate,which were 8%and 6%,respectively,but the germination rate of 0.1%HgCl210 min was lower than 5 min.The survival ratio was 100%of the plantlets with the plant natural height above 6 cm.This resech would provide basis for the rapid propagation ofthe Hemerocallis L.filial generation.

Hemerocallis citrina Baroni;seeds;aseptic seeding;seedling;acclimatization

S644.3

A

1002-2481（2017）04-0587-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.04.24

2017-01-11

山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目（2015-065）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20131403110005）

褚煥寧（1991-），女，河北石家莊人，在讀碩士，研究方向：花卉栽培與生理?？盒闫紴橥ㄐ抛髡摺?/p>