基于SSR標記的豫西棗品種與酸棗的群體遺傳結構與基因流分析

李娟　倫涵寧　李曼　付鵬程

【摘 要】為在分子水平上研究豫西棗品種遺傳結構，揭示品種分化與野生種的親緣關系，本研究選取豫西兩個棗品種和一個野生酸棗群體共48份種質(zhì)為材料，采用20對SSR引物，研究野生酸棗與品種的遺傳結構。三個群體在遺傳組成上被分為3組，群體間的界限清晰。野生酸棗與兩個棗品種間的基因流是不對稱的，主要是酸棗和灰棗流向扁核酸。扁核酸雖然遺傳多樣性低，但與其他群體的基因交流頻繁。本研究所用SSR標記及方法可用于不同棗品種的遺傳結構分析，為研究酸棗與棗種質(zhì)資源間的群體進化提供了借鑒。

【關鍵詞】酸棗；棗品種；基因流

0 前言

棗Ziziphus jujuba Mill.和酸棗Z.acidojujuba C.Y.Cheng et M.J.Liu[1]同為鼠李科棗屬植物，為該屬棗組中僅有的兩個種。棗在我國具有至少3000年的栽培歷史，其果實營養(yǎng)豐富，是我國重要的果樹，同時還能防風固沙、保持水土，是優(yōu)良的生態(tài)經(jīng)濟型樹種[2]。酸棗原產(chǎn)我國，為栽培棗的原生種。棗與酸棗的種質(zhì)資源極為豐富，分布廣泛，已知的棗品種有800多個，以及眾多的酸棗品種[2-3]。

棗和酸棗間的親緣關系研究由來已久。對棗及其近緣種酸棗的形態(tài)學、花粉學及同工酶譜等多方面的比較研究，結合化石、出土文物和古文獻考證及實地調(diào)查，認為棗和酸棗均原產(chǎn)我國，黃河中下游一帶是棗的原產(chǎn)地和最早的栽培中心[4]。另外，鑒于自然界存在有酸棗向棗連續(xù)演進的過渡型如大酸棗等，支持棗起源于野生酸棗，是我國古代人民經(jīng)過長期人工選種和栽培逐漸演化而來[2，5]。

微衛(wèi)星（SSR）因為具有多態(tài)性高、共顯性、可靠性高等優(yōu)點，已越來越多的用于物種形成與演化的研究[6]，對種性復雜的棗樹更是良好的分子標記。目前針對棗已開發(fā)了大量的SSR標記用于棗品種的系統(tǒng)發(fā)育關系重建[7-12]。此外，酸棗的遺傳多樣性和遺傳結構已有研究[13]，但缺少酸棗與棗演化關系的研究。

為進一步闡明棗品種分化與野生種的親緣關系，本研究以豫西部分棗品種為例，揭示野生酸棗與棗品種的遺傳結構與基因流，為棗親緣關系研究及資源利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在洛陽及周邊地區(qū)采集酸棗、灰棗和扁核酸樣本，每株分別取幼葉用硅膠干燥，共采集酸棗14個，灰棗和扁核酸各17個。

1.2 DNA提取、PCR擴增與毛細管電泳

針對棗葉片中多糖含量高等特點，采用改良的CTAB法從葉片中提取總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。使用20對SSR熒光引物[14]對樣品進行PCR擴增，擴增體系與擴增條件與Fu et al.[14]中描述相同。PCR擴增產(chǎn)物在武漢擎科生物技術有限公司A3730xl測序儀上進行毛細管電泳，在軟件Gene Marker v1.71中讀取條帶數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 遺傳多樣性

用Micro-Checker 2.2.3[15]檢查數(shù)據(jù)的正確性，糾正讀帶錯誤，消除回聲斑（stuttering），同時檢測無效等位位點（null alleles）。用Genepop 4.0.10.[16]計算等位基因數(shù)目、期望雜合度Ho（Expected heterozygosity）、觀測雜合度He（observed heterozygosities），并檢測哈迪溫伯格平衡（Hardy-Weinberg test）與連鎖不平衡（linkage disequilibrium）（1，000次重復）。

1.3.2 遺傳分組

采用軟件STRUCTURE v2.3.2[17]對所有個體進行遺傳分組。STRUCTURE采用貝葉斯聚類方法，可以評估不同類群間基因流的方向，并為同域分布居群的混合提供證據(jù)。運算棗群體數(shù)據(jù)時，將分組數(shù)K值設置為1-5，每個K值運行10次重復，每個重復運行1000，000代，前100，000代（10%）作為burn-in舍棄。最佳K值通過Ln值（Pritchard et al.，2000）與ΔK值[18]的變化曲線確定，拐點處對應的K值即為最佳K值。然后將最佳K值對應的10次重復運行的結果在軟件CLUMPP 1.1.2[19]中計算平均值，計算采用Greedy比對方法，運行10，000次重復。隨后在軟件DISTRUCT 1.1[20]中將分組結果畫圖。

2 實驗結果

2.1 遺傳多樣性

在酸棗群體中，20個SSR位點的均等位基因數(shù)為8.7，在扁核酸群體平均等位基因數(shù)為4.3，灰棗群體平均等位基因數(shù)為5.3。酸棗群體的觀測雜合度與期望雜合度均最高，灰棗次之，扁核酸最低。酸棗、扁核酸和灰棗群體中分別有3、13和13個位點偏離哈迪-溫伯格平衡（P<0.01）。

2.2 遺傳分化

用STRUCTURE分組后，Ln值隨著K值的變化在K=3時出現(xiàn)拐點，ΔK值隨著K值的變化也在K=3時出現(xiàn)明顯的拐點（圖1），因此將棗群體分為3組；并據(jù)此將所有個體按STRUCTURE結果進行分組，結果如圖2。三個群體整體上可以被分開，群體間的界限清晰，僅在一個居群中存在錯位。在三組分類的基礎上，一些混合的個體可以解釋為滲入。野生酸棗與兩個棗品種間的滲入是不對稱的，均為酸棗流向棗品種，且流向扁核酸的大于灰棗。兩個棗品種間的滲入也是不對稱的，更多的是從灰棗向扁核酸滲入。

3 討論

經(jīng)過長期的人工選育，棗品種已形成了獨特而穩(wěn)定的遺傳組成，本研究中野生酸棗、扁核酸和灰棗三者間存在明顯的遺傳聚類。基于ISSR分子標記對河南主栽棗品種進行了遺傳關系分析表明灰棗與扁核酸聚為一類，親緣關系較近[21]。從遺傳分組結果看，扁核酸在遺傳組成上比灰棗保留了更多的酸棗痕跡，說明與灰棗相比，扁核酸與酸棗的親緣關系更近。如果遵循栽培棗由野生酸棗馴化而來的假說，扁核酸有可能是在灰棗之前被選育的。

本研究的結果表明，酸棗、灰棗與扁核酸間存在一定的基因流。雖然有研究表明河南棗主栽品種與灰棗的總群體間分化程度較高，群體間基因交流較少[22]，但基因流的方向未知。本研究基于SSR標記的結果表明，灰棗與扁核酸間的基因流方向是不對稱，主要是由灰棗流向扁核酸，這種基因交流能提高扁核酸群體的遺傳多樣性，但同時也會減少不同棗群體間的遺傳分化，增加不同棗種質(zhì)資源的相似程度。已有研究表明不同地理環(huán)境在棗品種的群體進化中發(fā)揮了較重要的作用，但有些品種由不同區(qū)域間品種經(jīng)過頻繁的基因交流和重組選育而來，沒有明顯區(qū)域特征[12]。雖然三個群體中扁核酸的遺傳多樣性是最低的，由于基因流的作用，其遺傳組成中外來成分的比例是最高的。

本研究所用SSR標記可以對不同棗品種進行清晰的遺傳聚類，為棗的群體進化提供了可選工具。此外，本研究所用SSR標記及方法可用于不同棗品種的遺傳結構分析，為研究酸棗與棗種質(zhì)資源間的演化關系提供了借鑒。

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[責任編輯：田吉捷]