HPLC－DAD法同時測定蘸料和火鍋底料中的3種合成色素

龐秀清，馬瑩，邱紅燕，伍曦，趙麗，李澤夏瓊

（貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴陽 550004）

HPLC－DAD法同時測定蘸料和火鍋底料中的3種合成色素

龐秀清，馬瑩，邱紅燕，伍曦，趙麗，李澤夏瓊

（貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴陽 550004）

目的：建立蘸料和火鍋底料中胭脂紅、誘惑紅和赤蘚紅含量測定的HPLC－DAD方法。方法：采用Agilent Eclipse XDB－C18色譜柱，以0.02mol／L乙酸銨溶液（含0.2%三乙胺，冰醋酸調(diào)pH至4.0）＋甲醇為流動相，梯度洗脫。制備模擬陽性樣品并進(jìn)行方法學(xué)考察，用石油醚對樣品進(jìn)行脫脂，以無水乙醇－2%氨水－水（7∶2∶1）為溶劑提取樣品中的色素，用聚酰胺及固相萃取小柱除雜質(zhì)、提純，用3種色素的光譜確認(rèn)疑似物質(zhì)。結(jié)果：3種色素質(zhì)量分別在50.02～400.12，53.24～425.96，51.90～415.22ng范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，蘸料及火鍋底料中3種色素的加樣回收率均高于97%，RSD均低于2.0%。方法的最低檢出限為胭脂紅0.1ng，誘惑紅0.1ng，赤蘚紅0.2ng。結(jié)論：該方法精密度高，重現(xiàn)性好，定量準(zhǔn)確，可對蘸料和火鍋底料中添加的3種合成色素進(jìn)行有效監(jiān)控。

HPLC－DAD；蘸料；火鍋底料；合成色素；固相萃取

蘸料種類繁多，通常與火鍋、燒烤、素菜等食物一起被食用，是我國居民餐桌上重要的佐餐食品；火鍋底料是制作火鍋所用湯底和作料等的混合物，在全國范圍內(nèi)同樣被廣泛食用。辣椒是蘸料和火鍋底料的重要組成部分及原料。為了使蘸料及火鍋底料色彩更鮮艷，部分餐飲企業(yè)或食品加工企業(yè)可能向其中添加過多的合成色素。大量食用合成色素會對人體造成危害［1］。本文擬建立蘸料及火鍋底料中3種合成色素的HPLC含量測定方法，以完善對蘸料及火鍋底料的質(zhì)量安全監(jiān)控。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，Waters 2998二極管陣列（DAD）檢測器，Empower色譜工作站；Agilent Eclipse XDB－C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；Phenomenex C18預(yù)柱（4mm×0.3mm）；JYL－C020勻漿機(jī)（九陽股份有限公司）；TALBOYS渦旋震蕩器（Henry Troemner LLC）；TDL－5－A離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；GM－0.33A隔膜真空泵（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；G3垂熔玻璃漏斗。

1.2 材料

色素對照品由德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司提供，胭脂紅批號91120，含量70.0%；誘惑紅批號80917，含量83.0%；赤蘚紅批號90825，含量91.7%；蘸料和火鍋底料樣品為市場抽取樣品（經(jīng)HPLC檢測不含上述3種色素）；聚酰胺粉（100～200目）由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，批號F20110104；Sep－Pak Plus QMA固相萃取小柱，規(guī)格360mg，顆粒度37～50μm；HPLC流動相所用甲醇為色譜純，水為實(shí)驗(yàn)室自制去離子水，其余試劑、試藥均為分析純。

2 方法與結(jié)果［2－6］

2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取胭脂紅、誘惑紅、赤蘚紅對照品0.01429，0.01283，0.01132g，分別置于25mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為3種色素的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；分別精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液各5mL，置同一20mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，作為混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液；精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液1mL，置于10mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其中胭脂紅濃度為10.00μg／mL，誘惑紅濃度為10.65μg／mL，赤蘚紅濃度為10.38μg／mL。

2.2 樣品分類及預(yù)處理

需要檢測色素的蘸料樣品一般分為兩類：固體類（辣椒面等）和固液混合類（辣椒蘸水）。固體類樣品直接取樣，固液混合類樣品混勻后取樣，在70℃水浴中揮干水分，進(jìn)行前處理。火鍋底料樣品一般為油水混合物，先將樣品冷藏過夜，然后將凝固的油脂取出稱重，再將剩下的水層稱重，取水層在80℃水浴中揮干水分，進(jìn)行前處理，如檢出色素，則將油脂重量代入，計算火鍋底料中色素的含量。

2.3 模擬陽性樣品及供試品溶液的制備

2.3.1 胭脂紅及誘惑紅供試品溶液的制備

取上述樣品適量，混勻，取2g，精密稱定，置于50mL具塞離心管中，加入石油醚（60～90℃）15mL，置渦旋機(jī)上，渦旋振蕩5min，再置離心機(jī)中，離心（5000r／min）5min，棄去石油醚，按上述方法反復(fù)脫脂3次。脫脂后的樣品置70℃水浴中揮干殘留的石油醚，加入無水乙醇－2%氨水－水（7∶2∶1）15mL，置渦旋機(jī)上，渦旋振蕩5min，再置離心機(jī)中，離心（5000r／min）5min，將提取液倒入50mL燒杯中。按上述方法反復(fù)提取色素6次，至提取液無色或近無色，合并提取液。將上述提取液置70℃水浴中揮至無氨味，繼續(xù)揮至約10mL，依次加入10%硫酸溶液1mL和10%鎢酸鈉溶液1mL，攪勻，靜置20min，將溶液及沉淀全部轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，并用60℃的水約15mL少量多次清洗蒸發(fā)皿，清洗液并入離心管中，離心（5000r／min）5min，上清液倒入50mL燒杯中，沉淀再加水約5mL，渦旋振蕩5min，離心（5000r／min）5min，上清液合并入燒杯。

將上述燒杯置于80℃水浴中，提取液蒸至無氨味，繼續(xù)蒸至約10mL，將聚酰胺粉1g倒入溶液中，攪勻，靜置20min，趁熱將溶液和聚酰胺粉全部轉(zhuǎn)移至G3垂熔漏斗中，抽濾，用pH 6的水清洗聚酰胺粉5次，每次5mL，再用甲醇－甲酸（3∶2）清洗聚酰胺粉6次，每次5mL，至洗出液無色或近無色，再用水清洗聚酰胺粉至洗出液呈中性。用無水乙醇－2%氨水－水（7∶2∶1）洗脫色素6次，每次5mL，至洗出液無色或近無色，合并洗脫液，置蒸發(fā)皿中，置80℃水浴中揮至近干，轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，用水清洗蒸發(fā)皿，合并入量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻，離心（5000r／min）5min，取上清液作為胭脂紅、誘惑紅供試品溶液。

2.3.2 赤蘚紅供試品溶液的制備

取上述樣品適量，按2.3.1中的方法處理至蛋白質(zhì)沉淀步驟（……，上清液合并入燒杯。）將上述燒杯置于80℃水浴中，提取液蒸至無氨味，繼續(xù)蒸至約2mL，將濃縮的提取液全部吸入5mL一次性注射器中，接上處理好的固相萃取小柱（臨用前依次用5mL甲醇和5mL水預(yù)處理，保持柱體濕潤），將提取液注入固相萃取小柱，然后依次用pH 8的水5mL及pH 8的甲醇－水（1∶1）5mL洗脫雜質(zhì)，棄去洗脫液，再用鹽酸－乙醇溶液（1∶9）4.5mL洗脫色素，洗脫液置于5mL量瓶中，用氨水調(diào)pH至中性，加水至刻度，搖勻，作為赤蘚紅供試品溶液。

2.4 HPLC系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

流動相：以0.02mol／L乙酸銨溶液（含0.2%三乙胺，冰醋酸調(diào)pH至4.0）為流動相A，甲醇為流動相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫。柱溫30℃，檢測波長254nm，DAD檢測器波長范圍210～700nm。分別取對照品混合溶液、模擬陽性樣品供試品溶液和不含色素的陰性樣品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。各色素峰與相鄰色譜峰分離完全，陰性樣品溶液色譜在與對照品色譜相應(yīng)位置處無色譜峰出現(xiàn)，詳見圖1～圖7。

表1 梯度洗脫條件

圖1 混合對照品色譜

圖2 模擬陽性樣品色譜（聚酰胺純化）

圖3 模擬陽性樣品色譜（SPE小柱純化）

圖4 陰性樣品色譜

圖5 胭脂紅光譜

圖6 誘惑紅光譜

圖7 赤蘚紅光譜

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取3種色素的標(biāo)準(zhǔn)貯備液各2μL注入液相色譜儀，按2.4中的條件測定，記錄各色素峰保留時間。取2.1中的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密吸取5，10，20，30，40μL注入液相色譜儀，測定、記錄各色素峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，色素質(zhì)量（ng）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸方程。線性回歸方程分別為Y＝3099.4X－7859.9，r＝1.00（胭脂紅）；Y＝1880.7X－3491.9，r＝1.00（誘惑紅）；Y＝1965.9X－5512.0，r＝1.00（赤蘚紅）。表明3種色素質(zhì)量分別在50.02～400.12，53.24～425.96，51.90～415.22ng范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5.2 檢出限的測定

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液1mL，置于25mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10mL，置于25mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成檢出限供試溶液。胭脂紅濃度為0.1600μg／mL，誘惑紅濃度為0.1704μg／mL，赤蘚紅濃度為0.1661μg／mL。精密吸取供試溶液0.5，0.8，1.0，1.5，2.0μL及混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL注入液相色譜儀，按2.4中的色譜條件進(jìn)行測定，記錄相應(yīng)保留時間處3種色素的峰高，與噪音峰高相比，記錄信噪比為3∶1時的進(jìn)樣量，計算檢出限。結(jié)果胭脂紅、誘惑紅進(jìn)樣量為0.8μL，赤蘚紅進(jìn)樣量為1.0μL時信噪比約為3∶1，得出胭脂紅的檢出限為0.1ng，誘惑紅的檢出限為0.1ng，赤蘚紅的檢出限為0.2ng。本方法的最低檢出濃度為胭脂紅0.03mg／kg，誘惑紅0.04mg／kg，赤蘚紅0.04mg／kg。

2.5.3 精密度試驗(yàn)

取蘸料及火鍋底料的模擬陽性供試品各2g，分別按2.3.1或2.3.2中的方法制備1份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10μL，測定峰面積，各色素峰面積的RSD分別為0.58%（胭脂紅）、0.70%（誘惑紅）、1.1%（赤蘚紅），表明方法及儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取蘸料及火鍋底料的模擬陽性供試品6份各2g，精密稱定，按2.3.1或2.3.2中的方法平行處理6份供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，測定峰面積，按外標(biāo)一點(diǎn)法計算模擬陽性樣品中3種色素的含量，結(jié)果蘸料樣品中胭脂紅含量為21.24mg／kg（RSD＝0.77%），誘惑紅含量為25.55mg／kg（RSD＝0.98%），赤蘚紅含量為12.05mg／kg（RSD＝2.0%）；火鍋底料樣品中胭脂紅含量為16.16mg／kg（RSD＝2.0%），誘惑紅含量為19.19mg／kg（RSD＝4.0%），赤蘚紅含量為18.90mg／kg（RSD＝1.2%），表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 回收率試驗(yàn)

根據(jù)模擬陽性樣品的含量制備加標(biāo)溶液。精密稱取胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)品0.01394g、誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)品0.01718g，同置于100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取2mL，置于10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為蘸料中胭脂紅、誘惑紅回收率加標(biāo)溶液；精密稱取赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)品0.01405g，置于100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1mL，置于10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為蘸料中赤蘚紅回收率加標(biāo)溶液。精密稱取胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)品0.01786g、誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)品0.01549g、赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)品0.01690g，同置于100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1mL，置于10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為火鍋底料回收率加標(biāo)溶液。取勻漿后的蘸料模擬陽性樣品9份各2g、火鍋底料模擬陽性樣品9份各1g，精密稱定，分別精密加入各回收率加標(biāo)溶液0.8，1.0，1.2mL，按2.3.1或2.3.2中的方法制備回收率供試溶液，測定各色素的含量（μg），計算回收率，結(jié)果見表2和表3。

表2 蘸料中3種色素的回收率（n＝9）

表3 火鍋底料中3種色素的回收率（n＝9）

3 結(jié)論

經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法精密度高，定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可操作性強(qiáng)，方法可靠，能夠?qū)φ毫虾突疱伒琢现猩鲜?種合成色素進(jìn)行較準(zhǔn)確的測定，可用于蘸料和火鍋底料中人為添加合成色素的檢測，以對其質(zhì)量及安全做出有效控制。

4 討論

市售蘸料和火鍋底料多為紅色或類紅色，故選取胭脂紅、誘惑紅、赤蘚紅3種色素作為監(jiān)測指標(biāo)。

蘸料與火鍋底料種類多樣，且存在固體、液體、水、油等多種形態(tài)，故樣品前處理中，須嚴(yán)格進(jìn)行脫脂、混勻等過程，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

胭脂紅和誘惑紅在酸性條件下能與聚酰胺牢固吸附，并能在堿性條件下輕易洗脫，故選用聚酰胺純化樣品中的胭脂紅和誘惑紅；而赤蘚紅不能與聚酰胺良好吸附，故選用SPE小柱純化樣品中的赤蘚紅。

樣品前處理經(jīng)過多次試驗(yàn)，證明聚酰胺或SPE小柱除雜質(zhì)、提純?yōu)楸匦璨襟E，否則供試品色譜中雜質(zhì)峰過多，對色素峰的檢測影響較大；供試品溶液最后不可用濾紙或微孔濾膜過濾，否則提取出的色素將被吸附，影響最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

流動相中加入三乙胺改變色譜柱性質(zhì)，可明顯改善色譜峰拖尾現(xiàn)象。

參考相關(guān)文獻(xiàn)，選取紫外區(qū)254nm作為3種色素的共同檢測波長，也可根據(jù)3種色素的特征光譜，分別選取可見區(qū)最大吸收波長作為其檢測波長。

蘸料和火鍋底料中雜質(zhì)較多，樣品色譜中可能出現(xiàn)雜質(zhì)峰，如果樣品色譜與3種色素對照品色譜相同，保留時間處出現(xiàn)色譜峰，可用3種色素的特征光譜進(jìn)行確認(rèn)。查看該物質(zhì)的光譜，與相應(yīng)對照品光譜比對，如光譜一致，則確認(rèn)檢出色素，反之則可以排除。

［1］葛宇.食品中人工合成色素使用法規(guī)及檢測標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展［J］.質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)化，2011（9）：31－35.

［2］GB／T 5009.35－2003，食品中合成著色劑的測定［S］.

［3］GB／T 21916－2008，水果罐頭中合成著色劑的測定高效液相色譜法［S］.

［4］張?zhí)m天，王紅，王利軍，等.高效薄層色譜法同時快速檢測飲料中26種人工色素的研究［J］.食品工業(yè)，2014，35（8）：238－242.

［5］李曉芹，徐振東.固相萃取－高效液相色譜法在食品中合成著色劑檢測中的應(yīng)用［J］.食品工業(yè)，2014，35（6）：56－58.

［6］顧宇翔，葛宇，印杰，等.飲料和糖果中32種水溶性色素的HPLC篩選性檢測［J］.食品工業(yè)，2012，33（8）：142－145.

Simultaneous HPLC－DAD Determination of 3 Synthetic Pigments in Dip and Hotpot Condiment

PANG Xiu－qing，MA Ying，QIU Hong－yan，WU Xi，ZHAO Li，LI Zexiaqiong
（Guizhou Institute for Food and Drug Control，Guiyang 550004，China）

Objective：To establish a HPLC－DAD method to determine the carmine，allura red and erythrosine in dip and hotpot condiment.Methods：Agilent Eclipse XDB－C18column is used，with 0.02mol／L ammonium acetate solution（containing 0.2%triethylamine，adjust glacial acetic acid pH to 4.0）and methanol as the mobile phase，gradient eluting.The HPLC－DAD method is applied.Simulated positive samples are prepared and methodology investigation is implemented.Petroleum ether is used to defat the samples，and anhydrous ethanol－2%ammonia－water（7∶2∶1）is used as the extracting agent to extract the pigments from the samples，and then the polyamide and SPE column are used for impurity removal and purification.The spectra of 3kinds of pigments are used to confirm suspected substances.Results：The mass of the pigments shows good linear relation with the peak area in the scope of 50.02～400.12，53.24～425.96，51.90～415.22ng.The recoveries of the pigments in dip and hotpot condiment are all above 97%，and theRSDs are all below 2.0%.The lowest detection limits of the method are 0.1ng for carmine，0.1ng for allura red and 0.2ng for erythrosine.Conclusion：This method is precise，reproducible，accurate，and could effectively monitor 3kinds of pigments added in dip and hotpot condiment.

HPLC－DAD；dip；hotpot condiment；synthetic pigment；solid－phase extraction（SPE）

TS264.4

A

10.3969／j.issn.1000－9973.2017.04.034

1000－9973（2017）04－0149－05

2016－10－16

貴州省食品、保健食品、化妝品監(jiān)測檢測平臺（黔科平臺［2012］4001）

龐秀清（1987－），女，四川達(dá)州人，主管藥師，碩士，研究方向：食品、藥品、化妝品檢驗(yàn)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。