人參三七配伍對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠血腦屏障通透性及腦組織炎癥反應(yīng)的影響

張 楠 黃 鑫 戴雨霖 越 皓 于 洋 劉淑瑩

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117)

人參三七配伍對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠血腦屏障通透性及腦組織炎癥反應(yīng)的影響

張 楠 黃 鑫 戴雨霖 越 皓 于 洋 劉淑瑩

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117)

目的 觀察人參和三七配伍提取物對(duì)腦缺血再灌注損傷(CIRI)小鼠血腦屏障(BBB)通透性及腦組織炎癥反應(yīng)的影響。方法 通過(guò)結(jié)扎小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈制備CIRI模型。用紅四氮唑(TTC)染色測(cè)定CIRI小鼠腦梗死比和腦組織含水量，通過(guò)測(cè)定滲出腦血管外的伊文思藍(lán)含量，分析人參三七配伍對(duì)CIRI小鼠BBB 通透性的影響；光學(xué)顯微鏡下觀察CIRI小鼠腦組織病理形態(tài)，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)小鼠腦組織中白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達(dá)水平。結(jié)果 人參和三七配伍的提取物可明顯減少CIRI小鼠腦梗死比及腦組織含水量、降低小鼠腦組織中伊文思藍(lán)含量、改善BBB通透性和腦組織病理狀態(tài)、降低腦組織IL-1β和TNF-α 的表達(dá)水平、增加腦組織 IL-10的表達(dá)水平。結(jié)論 人參和三七配伍提取物對(duì)CIRI小鼠具有顯著保護(hù)作用，其機(jī)制與降低CIRI小鼠BBB通透性及腦組織炎癥反應(yīng)有關(guān)。

人參；三七；血腦屏障；腦缺血再灌注損傷；炎癥

腦缺血再灌注損傷(CIRI)的發(fā)生是一個(gè)十分復(fù)雜的病理生理過(guò)程，諸多種生物活性因子和多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與其中〔1,2〕。研究表明，腦缺血再灌注早期的血腦屏障(BBB)損傷過(guò)程與炎癥反應(yīng)相關(guān)，其損傷導(dǎo)致血液系統(tǒng)成分滲入腦組織內(nèi), 引起血管源性腦水腫〔3〕；腦缺血再灌注發(fā)生后，中性粒細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞等炎癥細(xì)胞被激活，白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α等細(xì)胞因子參與其炎癥反應(yīng)〔4,5〕。占穎等〔6〕研究結(jié)果顯示，益氣活血通過(guò)降低血漿血管性血友病因子(vWF)和血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)抗CIRI。近年來(lái)，許多天然藥物被用于CIRI的研究，如人參、三七、黃芪等〔7～10〕。在中醫(yī)臨床用藥中，人參性微溫，多作為扶正固表的“氣分藥”，三七性溫，多作為散瘀止血和消腫定痛的“血分藥”〔11〕。本研究以益氣活血為配伍基本原則，采用結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈制作CIRI小鼠模型，探討人參和三七配伍提取物對(duì)CIRI小鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性昆明小鼠240只，體重25～30 g，購(gòu)自吉林大學(xué)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK-(吉)2008-0005。

1.2 人參、三七 人參和三七飲片均購(gòu)于吉林省長(zhǎng)春市同仁堂大藥房，分別為五加科植物人參Panax ginsengC.A.Mey的干燥根莖和五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen的干燥根莖的炮制后飲片。

1.3 試劑和主要儀器 依達(dá)拉奉注射液購(gòu)自南京先聲東元制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào):20150508；水合氯醛購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)，生產(chǎn)批號(hào)：20151106；紅四氮唑(TTC)購(gòu)自上海瑞永生物科技有限公司,生產(chǎn)批號(hào):S0022；伊文思藍(lán)(EB)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,生產(chǎn)批號(hào):20130110；白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)分別為20151002、20150908、20151105。電子分析天平購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；M200PRO型酶標(biāo)儀為帝肯公司產(chǎn)品；1-14小型臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；IDA-2000數(shù)字醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)為北京空?？萍及l(fā)展有限公司提供。

1.4 人參、三七及人參和三七配伍組方提取物的制備 分別稱(chēng)取人參飲片15 g(人參單味組)、三七飲片15 g(三七單味組)、人參飲片20 g和三七飲片10 g(配伍組)于圓底燒瓶中，分別加入飲片10倍量的70%乙醇浸泡30 min后，將圓底燒瓶置水浴鍋上加熱回流提取90 min，即刻用循環(huán)水式真空泵和布氏漏斗進(jìn)行減壓抽濾；同法對(duì)藥渣再次煎煮60 min，合并2次濾液；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器，型號(hào)N1100)對(duì)濾液進(jìn)行減壓回收乙醇后,置真空冷凍干燥機(jī)(日本東京理化EYELA公司，型號(hào)FDU-1100)中進(jìn)行冷凍干燥48 h，得到人參、三七及人參和三七配伍提取凍干物。

1.5 動(dòng)物分組和給藥 隨機(jī)分為6組：模型組、人參單味組、三七單味組、配伍組、陽(yáng)性藥(依達(dá)拉奉注射液)組及假手術(shù)組，每組40只；在造模前14 d，人參、三七單味組及配伍組分別持續(xù)灌胃，給藥量分別為127、81.9、160 mg/kg，灌胃體積均0.1 ml/10 g，1次/d；于造模前1 h再各給藥1次；模型組和假手術(shù)組同期灌胃等體積的生理鹽水。

1.6 CIRI小鼠模型的制備 于小鼠腹腔注入5%水合氯醛(0.1 ml/10 g)進(jìn)行麻醉，麻醉后，于小鼠頸正中切口，分離小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，用小動(dòng)脈夾夾閉小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈20 min后，打開(kāi)動(dòng)脈夾，再灌注24 h，斷頭處死每組小鼠。假手術(shù)組只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，不夾閉。

1.7 小鼠腦梗死比和腦含水量的測(cè)定 再灌注24 h后，各組取8只小鼠斷頭處死，去掉小腦和腦干，電子分析天平稱(chēng)量大腦重量(濕重)，分別于腦前級(jí)、視交叉中點(diǎn)、視交叉、漏斗部切2 mm厚冠狀腦切片；將各腦切片置0.5% TTC溶液中，于37℃孵育染色10 min后，分離各腦切片白色區(qū)域(梗死區(qū))和紅色區(qū)域(正常區(qū))，稱(chēng)小鼠腦切片白色區(qū)域質(zhì)量，按下面公式計(jì)算小鼠腦梗死比；將各腦切片置100℃烘箱內(nèi)烘烤24 h后，取出稱(chēng)干燥后腦切片總質(zhì)量，按下面公式計(jì)算小鼠腦含水量〔12〕。小鼠腦梗死比(%)= 腦切片梗死區(qū)質(zhì)量/腦切片總質(zhì)量×100%。小鼠腦含水量(%)=(大腦濕重-腦切片干重)/大腦濕重×100%。

1.8 小鼠腦組織病理形態(tài)的觀察 再灌注24 h后，各組取6只小鼠斷頭處死，去除小腦和腦干后，置10%中性甲醛固定液中充分固定24 h，常規(guī)病理脫水、包埋、切片、HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠腦組織形態(tài)變化。

1.9 小鼠血腦屏障(BBB)通透性的測(cè)定 再灌注24 h后，經(jīng)小鼠右側(cè)股靜脈注入2% EB生理鹽水溶液(4 ml/kg)進(jìn)行麻醉，麻醉后，打開(kāi)胸腔暴露心臟，剪開(kāi)右心耳，經(jīng)左心室灌注生理鹽水清除血管內(nèi)血液和伊文思藍(lán)至右心耳流出液體清亮為止；斷頭取腦，用電子分析天平稱(chēng)量腦組織濕重(g)，將腦組織置甲酰胺水溶液中充分研磨(每100 mg腦組織加入1 ml甲酰胺)后，置60℃水浴中；24 h后取出，5 000 r/min離心10 min；取上清液200 μl，加入96孔酶標(biāo)板中，在酶標(biāo)儀上測(cè)定630 nm處A630 值。腦組織EB含量(μg/g)=待測(cè)樣品EB含量(μg/ml)×甲酰胺量( ml) /腦組織濕重(g) ，待測(cè)樣品EB含量通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得。

1.10 小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-10表達(dá)水平的檢測(cè) 分別于小鼠腦缺血再灌注0、6、24 h后，斷頭開(kāi)顱取腦，去掉小腦及腦干；用4℃生理鹽水將大腦部分制成10%勻漿液，3 000 r/min離心15 min，取上清液，ELISA法檢測(cè)小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-10的表達(dá)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 人參和三七配伍對(duì)CIRI小鼠腦梗死比例和腦含水量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組腦梗死比、腦含水量明顯升高(均P<0.01)；與模型組比較，人參單味組可減輕小鼠腦含水量(P<0.05)，配伍組同時(shí)顯著減輕腦含水量和腦梗死比(均P<0.01)；與人參單味組、三七單味組比較，配伍組可顯著降低腦組織腦梗死比(均P<0.01)；與三七單味組比較，配伍組能顯著降低腦組織含水量P<0.01)；與人參單味組比較，配伍組可有效降低腦組織含水量(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 人參和三七配伍對(duì)CIRI小鼠腦組織病理形態(tài)的影響 光鏡顯微鏡觀察結(jié)果顯示：假手術(shù)組組織結(jié)構(gòu)致密,細(xì)胞胞漿豐富,核膜清楚；模型組組織結(jié)構(gòu)疏松,呈篩網(wǎng)狀,形態(tài)模糊,炎癥細(xì)胞增多；依達(dá)拉奉組組織結(jié)構(gòu)致密,細(xì)胞胞漿豐富,核膜清楚，炎癥細(xì)胞較少。與假手術(shù)組相比，配伍組組織結(jié)構(gòu)致密,細(xì)胞質(zhì)豐富,核膜清楚，炎癥細(xì)胞較少；人參、三七單味組組織結(jié)構(gòu)也較配伍組疏松,呈篩網(wǎng)狀,形態(tài)模糊,且炎癥細(xì)胞增多。見(jiàn)圖1。

2.3 人參和三七配伍對(duì)CIRI小鼠BBB通透性的影響 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織EB含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，人參單味組可有效降低小鼠腦組織EB含量(P<0.05)，配伍組能顯著降低小鼠腦組織EB含量(P<0.01)；與三七單味組比較，配伍組能顯著降低小鼠EB腦含量(P<0.01)；與人參單味組比較，配伍組可有效降低小鼠腦組織EB含量(P<0.05)。見(jiàn)表1。

組別腦梗死比(%)腦含水量(%)腦組織EB含量(μg/g)假手術(shù)組0.00±0.001)77.56±0.171)4.58±0.831)模型組24.77±2.511)85.39±1.528.51±1.36依達(dá)拉奉組14.35±1.901)78.62±3.521)4.93±0.951)人參單味組21.62±2.53)80.65±0.992)4)6.07±1.122)4)三七單味組22.65±1.563)82.02±1.363)7.65±0.893)配伍組13.25±2.881)79.05±1.421)5.12±0.891)

與模型組比較：1)P<0.01,2)P<0.05;與配伍組比較：3)P<0.01,4)P<0.05；下表同

圖1 各組小鼠腦組織病理形態(tài)變化(HE，×400)

2.4 人參和三七配伍對(duì)CIRI小鼠腦組織中促炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β)表達(dá)水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組腦缺血再灌注0 h和6 h后，腦組織中TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)；在腦缺血再灌注24 h后，細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平開(kāi)始下降。與模型組比較，在腦缺血再灌注0 h和6 h后，配伍組和依達(dá)拉奉組IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平顯著降低(均P<0.01)；與人參、三七單味組比較，在腦缺血再灌注0 h和6 h后，配伍組可明顯降低IL-1β表達(dá)水平(P<0.05，P<0.01)；與人參單味組比較，在腦缺血再灌注0 h和6 h后，配伍組可顯著降低TNF-α表達(dá)水平(均P<0.01)；與三七單味組比較，在腦缺血再灌注0 h、6 h后，配伍組可明顯降低TNF-α表達(dá)水平(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.5 人參和三七配伍對(duì)腦組織中抗炎癥細(xì)胞因子(IL-10)含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組腦缺血再灌注的0、6、24 h后，腦組織中IL-10含量顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，在腦缺血再灌注6、24 h后，配伍組可以顯著增加IL-10含量(P<0.05，P<0.01)；與人參、三七單味組比較，在腦缺血再灌注24 h后，配伍組可顯著增加IL-10含量(P<0.01)。見(jiàn)表2。

組別IL-1β0h6h24hTNF-α0h6h24hIL-100h6h24h假手術(shù)組12.77±1.231)12.08±1.121)12.12±1.334.83±0.731)4.89±0.871)4.93±0.7910.25±0.931)10.31±1.021)10.13±0.951)模型組18.83±1.0526.52±0.9813.41±1.6913.87±1.0512.95±0.985.89±1.697.69±1.057.73±0.557.82±0.69人參單味組16.88±0.984)23.27±0.993)12.69±0.9811.55±0.953)11.86±0.873)5.69±0.898.51±0.988.74±0.789.08±1.083)三七單味組17.85±0.584)25.39±1.533)13.56±0.8810.49±0.582)3)9.08±1.461)4)5.28±0.829.32±0.799.85±0.869.33±0.813)配伍組14.13±1.851)17.61±1.471)12.58±1.046.91±0.841)7.25±1.071)5.26±1.149.52±0.8110.99±0.642)13.86±1.601)依達(dá)拉奉組13.98±0.871)16.59±2.091)12.49±0.996.23±0.971)6.96±1.291)5.39±0.9310.84±0.822)13.58±0.831)15.67±1.361)

3 討 論

CIRI的發(fā)生機(jī)制及防治一直受到國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注〔2,13～15〕，許多用于CIRI的臨床治療藥物被研制出來(lái)或處于臨床前研發(fā)階段〔16～20〕。但因CIRI的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，能夠達(dá)到預(yù)期治療效果的藥物并不多。研究表明，腦組織中炎癥細(xì)胞因子參與的炎癥反應(yīng)是CIRI發(fā)生的重要原因之一〔21〕；腦缺血時(shí)血液中的炎癥細(xì)胞向腦組織內(nèi)浸潤(rùn)，激活腦組織中的膠質(zhì)細(xì)胞，腦組織中促炎癥細(xì)胞因子增多，炎癥反應(yīng)失控，從而加重CIRI〔22〕。近年來(lái)，許多天然藥物被用于治療CIRI的研究〔6～11〕。劉俊偉等〔7〕研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1對(duì)大鼠CIRI的保護(hù)作用與其抑制炎癥因子IL-1β蛋白表達(dá)有關(guān)；王昊等〔23～25〕研究結(jié)果顯示，人參水煎液能夠使免疫低下小鼠血清中IL-4、干擾素(IFN)-γ表達(dá)水平恢復(fù)到正常水平，可提高正常小鼠及免疫抑制小鼠體內(nèi)淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞活性及血清中IL-2表達(dá)水平。唐映紅等〔26〕研究結(jié)果顯示，三七總皂苷具有改善BBB通透性、 清除自由基、抗炎、抗氧化等作用；王金翠等〔9〕研究結(jié)果顯示，血三七水煎液對(duì)大鼠局灶性CIRI有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其減少自由基的產(chǎn)生，抑制 NO 生成有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，與人參和三七單味用藥效果比較，人參和三七配伍的提取物通過(guò)降低CIRI小鼠BBB通透性及腦組織炎癥反應(yīng)，可明顯減少CIRI小鼠腦梗死面積及腦組織含水量、降低該小鼠腦組織中EB含量、改善CIRI小鼠BBB通透性、降低CIRI小鼠腦組織中促炎癥因子 IL-1β 和 TNF-α 的表達(dá)水平、提高CIRI小鼠腦組織中抗炎癥因子 IL-10的表達(dá)水平，對(duì)CIRI后小鼠具有顯著的保護(hù)作用。

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25 付 旋.三地人參對(duì)免疫抑制小鼠體液免疫影響的研究〔D〕.沈陽(yáng)：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

26 唐映紅，黃小平，譚 華，等.三七總皂苷對(duì)腦缺血再灌注后MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響〔J〕.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010;30(5)：29-32.

〔2016-12-09修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(21475012)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(20130311106)

劉淑瑩(1943-)，女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物分析研究。

張 楠(1983-)，女，講師，碩士，主要從事中藥有效成分研究。

R28

A

1005-9202(2017)07-1580-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.007