慢性阻塞性肺疾病大鼠血清和肺組織中IL-10、TNF-α及IFN-γ的表達及意義

鄭少強 劉德綱

(南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 廣州 510630)

慢性阻塞性肺疾病大鼠血清和肺組織中IL-10、TNF-α及IFN-γ的表達及意義

鄭少強 劉德綱1

(南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 廣州 510630)

目的 研究慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠血清和肺組織中白細胞介素(IL)-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α及γ-干擾素(IFN-γ)的表達及意義。方法 8周齡SD大鼠70只，根據(jù)數(shù)字隨機表法分成觀察組以及對照組各35只，將觀察組大鼠制成COPD模型，對照組則常規(guī)預處理，對比兩組血清以及肺組織的IL-10、TNF-α及IFN-γ水平，檢測肺平均內(nèi)襯間隔(MLI)和平均肺泡數(shù)(MAN)、肺泡腔的面積與總面積的比值(PAA)氣道阻力和肺順應性等肺功能指標。結果 觀察組的血清和肺組織的IL-10及IFN-γ水平均明顯低于對照組，TNF-α水平明顯高于對照組(P<0.05)。觀察組的MLI、PAA及氣道阻力水平明顯高于對照組，MAN及肺順應性水平明顯低于對照組(P<0.05)；COPD大鼠的IL-10和IFN-γ分別與MLI、PAA及氣道阻力呈負相關，與MAN及肺順應性呈正相關；TNF-α分別與MAN及肺順應性呈負相關，與MLI、PAA及氣道阻力呈正相關(均P<0.05)。結論 COPD大鼠的血清及肺組織的IL-10及IFN-γ水平明顯降低，而TNF-α水平明顯上升，炎癥反應與肺功能之間具有十分緊密的關聯(lián)。

慢性阻塞性肺疾??；IL-10；TNF-α；IFN-γ

慢性阻塞性肺疾病(COPD)為以氣流阻塞作為疾病特征的慢性支氣管炎以及肺氣腫，如未得到有效治療，可發(fā)展成肺心病甚至呼吸衰竭的一種臨床高發(fā)慢性病。臨床研究發(fā)現(xiàn)，該病和有害性氣體以及有害性顆粒等引起的異常炎癥反應密切相關〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，COPD整個病情發(fā)展過程中，患者外周氣道以及肺實質中腫瘤壞死因子(TNF)-α及γ-干擾素(IFN-γ)等水平均出現(xiàn)異常表達，說明炎性因子可能和患者氣道內(nèi)炎癥反應有一定關聯(lián)，進而影響到肺功能〔2，3〕。本研究擬分析COPD大鼠血清和肺組織中白細胞介素(IL)-10、TNF-α及IFN-γ的表達及意義。

1 材料和方法

1.1 材料 選擇2016年9月1～30日在我院實驗室喂養(yǎng)的8周齡SD大鼠70只作為研究對象，均為雄性，體重180～230 g，平均(212.58±15.74)g。大鼠所在實驗室內(nèi)的環(huán)境參數(shù)設置：(1)恒溫22℃～26℃；(2)恒濕40%～70%；(3)換氣次數(shù)為10～20次/h；(4)正向的梯度壓差為20～50 Pa；(5)工作照度為150～300 Lux；(6)動物照度為15～20 Lux；(7)實驗室內(nèi)噪聲值<60 DB。根據(jù)數(shù)字隨機表法將大鼠分成觀察組以及對照組各35只，其中觀察組大鼠體重180～220 g，平均(211.97±10.26)g。對照組大鼠體重190～230 g，平均(213.05±12.52)g。兩組大鼠的性別及體重數(shù)據(jù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 建立實驗模型 分組后為觀察組大鼠建立COPD模型，分別于實驗開始后第1天及第15天，對兩組大鼠應用濃度為10%的水合氯醛(產(chǎn)自廣州化學試劑廠)進行腹腔注射式麻醉，并對觀察組大鼠氣道中緩慢注射0.2 ml脂多糖(產(chǎn)自美國的Sigma公司，生產(chǎn)批號為L2880)，其含量為200 μg，而對照組僅給予注射0.2 ml生理鹽水。操作完成后需將兩組大鼠均各自放回飼養(yǎng)籠內(nèi)，給予正常食水飼養(yǎng)。在對觀察組進行手術當天不對該組大鼠進行煙熏，其他時間需將觀察組大鼠放置在自行設計制作的染箱內(nèi)，每天9：00-10：30以及15：00～16：30兩個時間段實施被動吸煙操作，每次燃燒香煙量為5支，單次煙熏時間需持續(xù)半小時，待20 min后殘留煙霧散去后進行再次被動吸煙。煙熏后需將大鼠放置回原飼養(yǎng)籠，并進行正常食水飼養(yǎng)，持續(xù)4 w。對照組大鼠則不接受煙熏處理，僅正常飼養(yǎng)。

1.2.2 大鼠肺功能及炎癥因子等指標的檢測 在煙熏結束后的次日，對實驗大鼠行4 ml/kg 10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，而后備皮并暴露出氣管，通過產(chǎn)自美國Buxco公司的RC肺功能檢測系統(tǒng)對兩組大鼠的氣道阻力及肺順應性進行測定。檢測完成后提取大鼠的下腔靜脈血約3 ml，并置于真空抗凝管內(nèi)保存，而后給予3 000 r/min離心15 min，提取血清，檢測白IL-10、TNF-α以及IFN-γ水平。再稱取大鼠約100 mg的肺組織，置入玻璃研磨器內(nèi)，添加9倍4℃下的PBS液，待充分勻漿之后將其制作成10%的勻漿液，再放于4℃下進行10 min 3 000 r/min的低溫離心，提取上清液檢測肺組織的IL-10、TNF-α以及IFN-γ的水平。

1.2.3 MLI、MAN及PAA的檢測 提取大鼠右下葉肺組織，經(jīng)10%甲醛固定之后，制成石蠟包埋切片，利用顯微鏡在相同放大倍數(shù)(10×20)和電壓下觀察，為每張切片選擇上、中、下、左、右等視野，通過Spot Cool CCD軟件實施圖像采集，而后利用IMAGE-Pro plus 4.1圖像分析系統(tǒng)分別檢測肺平均內(nèi)襯間隔(MLI)和平均肺泡數(shù)(MAN)以及肺泡腔的面積與總面積的比值(PAA)。

1.3 觀察指標 對比兩組血清以及肺組織的IL-10、TNF-α及IFN-γ水平，MLI、MAN、PAA及氣道阻力和肺順應性等肺功能指標，分析COPD大鼠的IL-10、TNF-α及IFN-γ與MLI、MAN、PAA及肺功能的相關性。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS21.0軟件行χ2檢驗、t檢驗。相關性分析應用Spearman法進行評價。

2 結 果

2.1 兩組IL-10、TNF-α及IFN-γ水平對比 觀察組血清和肺組織的IL-10及IFN-γ水平均明顯低于對照組，TNF-α水平明顯高于對照組(P<0.05)，見表1。

2.2 兩組MLI、MAN、PAA及肺功能的對比 觀察組的MLI、PAA及氣道阻力水平明顯高于對照組(P<0.05)，MAN及肺順應性水平明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

組名IL-10(ng/L)血清肺組織TNF-α(pg/ml)血清肺組織IFN-γ(ng/L)血清肺組織觀察組43.84±9.2163.72±9.19112.52±30.47142.84±17.65645.76±21.54671.69±25.77對照組76.88±10.2394.12±8.5570.84±10.2580.29±9.42906.82±138.53982.51±126.90t/P值14.200/0.00014.328/0.0007.670/0.00018.497/0.00011.016/0.00014.201/0.000

組名MLI(×10-6m)MAN(×106個/m2)PAA(%)氣道阻力(kPa·ml-1·s-1)肺順應性(ml/cmH2O)觀察組97.84±11.2695.87±14.8664.29±5.630.49±0.060.37±0.05對照組47.18±2.96164.38±9.3244.17±2.510.29±0.430.53±0.04T值25.74323.10719.3102.72514.783P值0.0000.0000.0000.0080.000

2.3 相關性分析 依照Spearman法分析相關性可知，COPD大鼠的IL-10和IFN-γ分別與MLI、PAA及氣道阻力呈負相關(rIL-10=-0.724、-0.617、-0.633；rIFN-γ=-0.588、-0.625、-0.720；均P<0.05)，與MAN及肺順應性呈正相關(rIL-10=-0.679、0.705，rIFN-γ=0.636、0.683，均P<0.05)；TNF-α分別與MAN及肺順應性呈負相關(r=-0.712、-0.598，均P<0.05)，與MLI、PAA及氣道阻力呈正相關(r=0.654、0.731，均P<0.05)。

3 討 論

臨床研究已證實，COPD為能夠預防與治療的一種臨床常見病，其氣流受限癥狀呈進行性發(fā)展，且和氣道以及肺等因有毒性氣體或者顆粒等而發(fā)生的慢性炎癥反應強烈程度相關。且目前已經(jīng)公認吸煙為導致COPD的最重要危險因素，且吸煙和人體氣道高反應性以及免疫能力受損、感染等頻率直接相關，長期吸煙會誘發(fā)COPD〔4～6〕。整個COPD病程中，炎性細胞發(fā)生聚集并產(chǎn)生活化作用起到重要意義。究其原因發(fā)現(xiàn)，活化的炎性因子會對氣道造成損傷，并有發(fā)展成肺部疾病的危險，因此，部分吸煙者會出現(xiàn)呼吸道中炎性因子水平上升情況〔7，8〕。

本文研究結果符合黃炎明等〔9，10〕的報道，提示COPD大鼠存在較為明顯的炎癥反應。原因可能與COPD本身就屬于以氣流阻塞為主要特征的一類慢性支氣管炎或肺氣腫等因素有關。其中IL-10可發(fā)揮較好的抑制促炎因子的效果，可抑制呼吸道內(nèi)中性粒細胞及巨噬細胞對炎性因子的分泌，進而對氣道的炎癥反應產(chǎn)生抑制，促使中性粒細胞不斷凋亡，最終加快了呼吸道炎癥物質的清除。IFN-γ對氣道炎癥的調控具有重要的作用，其可阻滯氣道炎癥導致的肺纖維化進程。TNF-α則主要參與到氣道炎癥形成時的有關中性粒細胞活化進程，致使氣道黏膜中出現(xiàn)大量的中性粒細胞，最終加重炎癥癥狀，甚至致使氣道結構重塑〔11〕。同時，觀察組的MLI、PAA及氣道阻力水平明顯升高，MAN及肺順應性水平明顯降低，符合汪新龍等人〔12，13〕的報道，提示COPD大鼠的肺泡及肺功能已出現(xiàn)一定程度的異常。筆者認為原因可能與COPD的發(fā)病機制有關。其中MLI可反映肺泡的平均直徑，PAA可反映出肺泡腔面積的占比情況，MAN則可反映出肺泡密度，而氣道阻力及肺順應性則能較好地呈現(xiàn)出大鼠的肺功能狀態(tài)〔14〕。COPD大鼠的炎癥反應與其肺功能之間具有十分緊密的關聯(lián)，筆者認為，可能由于COPD中炎癥反應及肺功能損害變過程之間必然存在著較大聯(lián)系，這和荊晶等〔15，16〕的結論類似。

1 朱錦琪，彭毅強，陳 垣，等.血必凈干預對慢性阻塞性肺疾病大鼠體內(nèi)炎癥因子的影響〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2014；14(6)：1048-52.

2 Abd El-Kader SM，Al-Jiffri OH，Al-Shreef FM.Plasma inflammatory biomarkers response to aerobic versus resisted exercise training for chronic obstructive pulmonary disease patients〔J〕.Afr Health Sci，2016；16(2)：507-15.

3 于倩倩，劉 穎，藺紅靜，等.霧化吸入糖皮質激素對慢性阻塞性肺疾病急性加重期炎癥介質IL-8和TNF-α水平的影響〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(1)：45-6.

4 Li J，Wu S，Tang H，etal.Long-term effects of acupuncture treatment on airway smooth muscle in a rat model of smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Acupunct Med，2016；34(2)：107-13.

5 強麗霞，李香順，趙婷婷，等.Abhd2與慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能和氣道炎癥的相關性研究〔J〕.國際呼吸雜志，2016；36(2)：104-7.

6 Kuzubova NA，Lebedeva ES，Dvorakovskaya IV，etal.Modulating effect of peptide therapy on the morphofunctional state of bronchial epithelium in rats with obstructive lung pathology〔J〕.Bull Exp Biol Med，2015；159(5)：685-8.

7 陳艷蓉，肖 瑤，劉 彥，等.調節(jié)性T細胞及輔助性T細胞在慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的表達及臨床意義〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(9)：2078-80.

8 Wei J，F(xiàn)an G，Zhao H，etal.Heme oxygenase-1 attenuates inflammation and oxidative damage in a rat model of smoke-induced emphysema〔J〕.Int J Mol Med，2015；36(5)：1384-92.

9 黃炎明，熊 萍，左萬里，等.辛伐他汀對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部及系統(tǒng)性炎癥反應的影響〔J〕.中國臨床研究，2016；29(6)：730-3.

10 吳建軍，姜良鐸，張 偉，等.安肺益腎方對COPD大鼠血清IL-2、IFN-γ、IgA、IgG及脾淋巴細胞增殖的影響〔J〕.中國中醫(yī)藥科技，2013；20(4)：357-8.

11 祁海燕，封繼宏，李美鳳，等.肺寧顆粒對COPD急性期大鼠的肺組織病理和血清中TNF-α、MIP-2水平的影響〔J〕.陜西中醫(yī)，2016；37(8)：1094-7.

12 汪新龍，劉朝暉，梁志科，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道炎癥與白細胞介素10的相關性研究〔J〕.中國呼吸與危重監(jiān)護雜志，2014；13(2)：143-4.

13 李飛飛，張愛珍，段鵬鵬.加味六君子湯對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠外周血腫瘤壞死因子-α白細胞介素-8含量及肺組織病理變化的影響〔J〕.中國藥物與臨床，2016；16(4)：492-4.

14 陳 燕，熊 英，李 玲，等.慢性阻塞性肺疾病模型大鼠細胞因子水平變化的研究〔J〕.中華疾病控制雜志，2015；19(8)：839-42.

15 荊 晶，高 振，李 爭，等.寒燥環(huán)境對慢阻肺大鼠氣道杯狀細胞分布及肺組織病理變化影響探討〔J〕.臨床心身疾病雜志，2016；22(z1)：413-4.

16 Matsson H，S?derh?ll C，Einarsdottir E，etal.Targeted high-throughput sequencing of candidate genes for chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.BMC Pulm Med，2016；16(1)：146.

〔2016-09-27修回〕

(編輯 李相軍)

1 南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院心胸外科

劉德綱(1985-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胸部腫瘤方面的研究。

鄭少強(1985-)，男，碩士，住院醫(yī)師，主要從事肺部感染性疾病和慢性阻塞性肺疾病方面的研究。

R56

A

1005-9202(2017)07-1613-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.019