OPN與TGF-β1在瘢痕疙瘩中的表達及生物學(xué)功能

王 芳 鐘彬武 聶晶晶 趙自然

(大慶油田總醫(yī)院整形外科，黑龍江 大慶 163001)

OPN與TGF-β1在瘢痕疙瘩中的表達及生物學(xué)功能

王 芳 鐘彬武 聶晶晶 趙自然1

(大慶油田總醫(yī)院整形外科，黑龍江 大慶 163001)

目的 通過研究OPN與TGF-β1在正常皮膚、扁平瘢痕及瘢痕疙瘩三組中的表達規(guī)律，探討兩者在瘢痕疙瘩形成中的意義。方法 應(yīng)用免疫組化法 (SP法)結(jié)合計算機病理圖像分析檢測三組患者中OPN與TGF-β1的表達。分析OPN與TGF-β1在各組中的表達水平差異。結(jié)果 OPN與TGF-β1在瘢痕疙瘩組中的陽性表達率及IOD值與其他兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。OPN與TGF-β1在瘢痕疙瘩中的表達具有正相關(guān)。結(jié)論 OPN與TGF-β1在瘢痕疙瘩中的表達呈正相關(guān)，與瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。

瘢痕疙瘩； OPN；TGF-β1

瘢痕疙瘩一直是外科研究的熱點及難點，瘢痕疙瘩的形成機制不清，導(dǎo)致臨床治療困難。TGF-β1在瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的促進作用。有研究發(fā)現(xiàn)OPN與創(chuàng)面修復(fù)及瘢痕形成有關(guān)〔1〕，在許多纖維性疾病中，OPN和TGF-β1均呈高表達，OPN與TGF-β1具有協(xié)同效應(yīng)，共同促進纖維性疾病的發(fā)生及發(fā)展〔2,3〕。OPN及TGF-β1在瘢痕疙瘩中的表達以及兩者的相關(guān)性鮮見研究。本實驗擬分析OPN與TGF-β1的相關(guān)性及在瘢痕疙瘩形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要的實驗試劑及儀器 兔抗人OPN單克隆抗體與兔抗人TGF-β1單克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。電熱恒溫干燥箱購自中國上海實驗儀器總廠。高精度輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機購自日本的LAICA。顯微鏡購自日本的OLYMPUS。石蠟包埋機、恒溫孵化箱購自日本的SANYO。

1.2 實驗標(biāo)本的來源及分組 所有標(biāo)本供體均取自門診及住院患者(所有患者均知情并同意)。取材部位為胸部、腹部、面部、四肢。實驗標(biāo)本分為瘢痕疙瘩組(KG)標(biāo)本20例，扁平瘢痕組(SG)標(biāo)本23例，正常皮膚組(NG)標(biāo)本16例。

1.3 實驗方法 應(yīng)用SP免疫組化染色方法檢測OPN、TGF-β1在瘢痕疙瘩、扁平瘢痕及正常皮膚中的表達：所有標(biāo)本經(jīng)過甲醛溶液中固定，石蠟包埋，4 μm切片,一張行HE染色，一張行免疫組化檢測，一張PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 試驗結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 三組中OPN與TGF-β1陽性表達率的判斷 OPN與TGF-β1陽性細胞主要表現(xiàn)為棕黃色顆?；螯S褐色顆粒，主要分布于胞質(zhì)中。在低倍鏡(100×)視野下選取視野，于高倍鏡(400×)下從表皮到皮下依次選取5個視野并計算陽性細胞率。按切片中顯色細胞數(shù)比例計分(分別為0～3分)及按切片中細胞顯色強度計分(分別為0～3分)。

1.4.2 三組中OPN與TGF-β1累積光密度(IOD)的測定 在低倍鏡(100×)視野下掃視整個組織切片 ,選取背景對比良好、陽性細胞數(shù)量密集的視野，于高倍鏡(400×)下從表皮到皮下依次取5個視野后采用Image pro plus 6.0軟件分析系統(tǒng)測量圖像，測量指標(biāo)為IOD值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS11.0軟件行χ2檢驗或t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 OPN在三組中的陽性表達率及IOD值 OPN在NG表達數(shù)目少且稀疏；在SG中全層均有表達，染色顆粒的數(shù)量及染色強度均高于正常皮膚組；在瘢痕疙瘩的全層均有表達，無論是陽性染色顆粒的數(shù)目、染色強度還是陽性顆粒的密集程度明顯強于SG及NG。見表1，圖1。OPN在KG、SG、NG三組中的IOD值分別為(455 103.75±145 907.22)、(243 162.05±54 810.94)、(38 952.65±8 216.19)，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 OPN在各組中的表達(n)

2.2 TGF-β1在三組中的陽性表達率及IOD值 TGF-β1在NG中的表達為陰性；在SG中主要表達于瘢痕表皮基底層細胞；在瘢痕疙瘩的全層均有表達，無論是陽性染色顆粒的數(shù)目、染色強度還是陽性顆粒的密集程度明顯強于SG及NG。見表2，圖1。TGF-β1在KG、SG、NG三組中的IOD值分別為(335 432.9±60 038.73)，(19 339.05±4 776.14)，(4 501.54 ±577.27)，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 OPN與TGF-β1在瘢痕疙瘩中表達的相關(guān)性 OPN和TGF-β1在瘢痕疙瘩中的表達具有相關(guān)性(P<0.05)。見表3。

表2 TGF-β1在各組中的表達(n)

圖1 OPN、TGF-β1在三組中的表達(×400)

TGF-β1OPN-+ r值P值-1100+01210.480.032 0143 0033

3 討 論

OPN作為一種重要ECM組分，廣泛分布于人體組織中，具有多種生物學(xué)活性。越來越多的國內(nèi)外研究結(jié)果證實OPN在纖維化疾病及腫瘤中呈高表達，OPN與纖維化疾病(肝、肺、腎)及腫瘤的發(fā)生及發(fā)展具有密切的相關(guān)性，新近研究發(fā)現(xiàn)OPN與創(chuàng)面修復(fù)及瘢痕形成有關(guān)〔4〕。瘢痕疙瘩作為一種纖維性疾病，同時具有腫瘤的生物學(xué)性質(zhì)，本試驗中OPN在瘢痕疙瘩組高表達，為瘢痕疙瘩的研究提供了新的思路。

TGF-β有3種亞型，分別是TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，其中TGF-β1所占的比例最高。TGF-β1對很多纖維化疾病具有促進作用。動物實驗表明，局部給裸鼠皮下注射TGF-β1可致注射部位局部纖維化，而全身應(yīng)用TGF-β1可使肝腎肺等主要器官纖維化〔5〕。TGF-β1在瘢痕疙瘩的發(fā)病機制中起到重要的促進作用，增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中可以檢測到病變部位TGF-β1高表達〔6〕。

瘢痕疙瘩是一種纖維性疾病，同時具有腫瘤的生物學(xué)特征，OPN及TGF-β1在瘢痕疙瘩中表達特點的研究較少，國內(nèi)尚未見到報道。本實驗結(jié)果表明OPN與TGF-β1在瘢痕疙瘩中的表達呈正相關(guān)，因此推測兩者具有協(xié)同作用，共同促進瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展。

瘢痕疙瘩的形成主要有以下幾方面：①細胞外基質(zhì)中膠原合成與降解失衡；②成纖維細胞的大量增殖與凋亡抑制；③細胞因子的相互作用及調(diào)控。根據(jù)國內(nèi)外的相關(guān)性研究及本實驗結(jié)果，我們推測OPN及TGF-β1可能與以下瘢痕疙瘩的形成因素有關(guān)：①調(diào)控細胞外基質(zhì)的合成和降解，促進細胞外基質(zhì)沉積：有研究表明在瘢痕疙瘩形成與在形成中局部合成的生長因子及細胞因子相互作用促進過量的細胞外基質(zhì)沉積〔7〕。OPN是一種重要的細胞外基質(zhì)成分，具有改變細胞外基質(zhì)的作用，TGF-β1亦有改變細胞外基質(zhì)成分的作用，兩者通過改變合成與降解的動態(tài)平衡，促進細胞外基質(zhì)沉積，減緩細胞外基質(zhì)的降解以達到促進瘢痕疙瘩形成。②通過調(diào)控共同促進血管內(nèi)皮細胞增生，誘導(dǎo)新血管生成：OPN及TGF-β1誘導(dǎo)瘢痕疙瘩中新血管生成，主要是通過與其相應(yīng)受體結(jié)合后促進內(nèi)皮細胞增生。血管內(nèi)皮細胞的初始反應(yīng)由TGF-β1介導(dǎo)，通過與血管相鄰的ECM成纖維細胞表達TGF-β1 mRNA而被放大，導(dǎo)致鏈鎖效應(yīng)〔8〕。③OPN與TGF-β1調(diào)控的信號通路：OPN與TGF-β1在很多纖維化疾病(肝、腎、肺)纖維化過程中具有協(xié)同作用，促進其發(fā)生發(fā)展。在肝硬化中OPN可通過TGF-β1/Smad 信號傳導(dǎo)通路直接激活HSC而導(dǎo)致肝纖維化的形成。有學(xué)者在小鼠肝纖維化實驗中證實，OPN在肝組織中大量表達會直接誘導(dǎo)TGF-β1 mRNA上調(diào)，進而進一步激活HSC，產(chǎn)生大量的ECM而引起肝纖維化〔2〕。

瘢痕疙瘩的防治是醫(yī)學(xué)界的難題，我們的實驗中OPN及TGF-β1在瘢痕疙瘩組織中均呈高表達且兩者具有相關(guān)性，因此推測兩者通過協(xié)同作用共同促進瘢痕疙瘩的發(fā)生及發(fā)展，但具體作用機制還需進一步研究。

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2 Atorrasagasti C, Aguino JB , Hofman L,etal.SPARC downregulation attenuates the profibrogenic response of hepatic stellate cells induced by TGF-β1 and PDGF〔J〕.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2011；300(5)：G739-48.

3 Yan X，Liu Z，Chen Y.Regulation of TGF-beta signaling by Smad7〔J〕.Acta Biochim Biophy Sin，2009；41(4)：263-472.

4 Mori R, Shaw TJ, Martin P,etal.Molecular mechanisms linking wound inflammation and fibrosis：knockdown of osteopontin leads to rapid repair and reduced scarring 〔J〕.J Exp Med,2008；205(1)：43-51.

5 Chen W，Wahl SM.TGF-beta：receptors，signaling pathways and autoimmunity〔J〕.Curr Dir Autoimmun，2002；5(1)：62-91.

6 Zhang K,Garner W,Cohen L，etal.Increased types I andⅢcollagen and transforming growth factor-131 mRNA and protein in hypertrophic burnscar〔J〕.J Invest Dermatol，1995;104(6)：750-4.

7 Broder WA,Ruoslahti E.Transforming growth factor β in disease：the dark side of tissue repair〔J〕.J Clin Invest,1992;90(1)：1-7.

8 Tuan TL, Nichter LS.The molecular basis of keloid and hypertrophic scar formation〔J〕.Mol Med Today,1998;4(1)：19-24.

〔2016-07-15修回〕

(編輯 郭 菁)

1 吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部整形外科

王 芳(1984-)，女，主治醫(yī)師，主要從事整形外科臨床研究。

R622+.9

A

1005-9202(2017)07-1596-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.013