丹皮酚對肝癌細胞增殖凋亡及JAK-STAT信號通路的影響

于洋洋 梁明輝

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

丹皮酚對肝癌細胞增殖凋亡及JAK-STAT信號通路的影響

于洋洋 梁明輝

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 探究丹皮酚(Pae)對肝癌細胞增殖凋亡及JAK-STAT信號通路的影響。方法 采用MTT法檢測7.5、15、22.5、30、60 mg/L Pae 對HepG2細胞的抑制作用；采用流式細胞儀檢測60 mg/L Pae作用HepG2細胞48 h后細胞凋亡情況；qRT-PCR法檢測Pae處理對HepG2細胞Stat3、Stat5 mRNA的影響；Western印跡檢測Pae處理JAK-STAT信號通路蛋白表達的影響。結(jié)果 Pae對HepG2細胞的抑制作用與培養(yǎng)時間和藥物劑量呈依賴性，當Pae濃度為60 mg/L，處理細胞72 h時抑制效果最佳;流式細胞儀檢測顯示對照組細胞未出現(xiàn)大量凋亡，經(jīng)60 mg/L Pae處理72 h后的HepG2細胞出現(xiàn)大量凋亡，處理組凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)。與對照組相比，不同濃度Pae作用HepG2細胞 48 h后，STAT3、STAT5基因表達量逐漸降低(P<0.05)，且與Pae劑量呈依懶性；Western印跡檢測結(jié)果顯示60 mg/L Pae 處理HepG2細胞48 h后，JAK1、JAK2、STAT3、STAT5蛋白表達量均顯著低于對照組。結(jié)論 Pae能夠抑制肝癌細胞HepG2增殖、誘導(dǎo)其凋亡，其機制可能與抑制JAK-STAT信號通路STAT3、STAT5基因和蛋白表達相關(guān)。

丹皮酚；HepG2細胞；凋亡；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白

目前臨床上治療肝癌主要以手術(shù)和化療為主，95%的患者在確診時已為晚期，化療藥物雖然對患者病情具有一定控制作用，但其毒副作用較大〔1，2〕。丹皮酚(Pae)是從牡丹根部提取的化合物，具有消炎、解熱、鎮(zhèn)痛的療效，研究表明Pae對肝癌細胞具有一定的抑制作用〔3〕。本研究旨在探討Pae對肝癌細胞HepG2抑制凋亡及Janus蛋白酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白(JAK/STAT)信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細胞HepG2細胞購于上海生物細胞研究所，本院凍存。丹皮酚注射液購于北京雙鶴藥業(yè)有限公司，批號：Z31020399，規(guī)格：2 ml/10 mg；胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于杭州四季青有限公司，MTT、DMSO購于Sigma公司；鏈霉素和青霉素購于華北制藥有限公司；2×SYBR Green Mix 訂購于Takara公司；兔抗人JAK1、JAK2單克隆抗體購于Cell Signaling Technoloy 公司，鼠抗人STAT3單抗購于Origene 公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記二抗山羊抗兔IgG購于中杉金橋公司。二氧化碳培養(yǎng)箱購于Thermo公司；流式細胞儀購于美國Thermo Scientific公司；全自動酶標儀購于Nano Drop公司；熒光定量PCR儀器購于Bio-Red公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 從超低溫冰箱中取出凍存細胞，置于30℃水浴中使細胞解凍，加入5 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，添加0.2%胰蛋白酶進行消化后于DMEM培養(yǎng)基中終止消化，加入10%FBS的DEME培養(yǎng)液，移液槍吹打培養(yǎng)液使細胞密度為106個/m3，置于5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當細胞貼壁生長達到80%時加入胰蛋白酶消化，用DMEM培養(yǎng)基洗滌3次，800 r/min離心3 min，收集細胞。按照1∶3比例進行傳代培養(yǎng)，第三代細胞用于后續(xù)研究。

1.2.2 MTT法檢測Pae對HepG2細胞的抑制作用 將生長至對數(shù)期的HepG2細胞接種于96孔板中加入100 μl DEME培養(yǎng)液，將Pae用培養(yǎng)基進行稀釋使?jié)舛葹?.5、15、22.5、30、60 mg/L，將稀釋后的藥物100 μl加入培養(yǎng)板，上述5組每組設(shè)置4個重復(fù)，同時以未加入Pae處理的孔作為對照組，分別培養(yǎng)24、48、72 h，培養(yǎng)結(jié)束后加入20 μl MTT，37℃反應(yīng)4 h，去除細胞上清液后加入200 μl DMSO，37℃孵育20 min，于波長570 nm下測定各組的濃度，細胞存活率=OD實驗組/OD空白組×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測Pae對HepG2細胞凋亡的影響 以未進行Pae處理的細胞為對照組，以60 mg/L Pae 處理后的HepG2細胞為實驗組細胞，培養(yǎng)使細胞液密度為103個/m3，37℃反應(yīng)48 h后收集細胞，加入PBS溶液洗滌。對照組添加200 μl DMSO溶液，實驗組加入100 μl DMSO和20 μl PI，避光反應(yīng)20 min，采用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。

1.2.4 qRT-PCR法檢測Pae處理對HepG2細胞STAT3、STAT5 mRNA的影響 收集處理后的HepG2細胞，參照細胞總RNA提取試劑盒進行細胞RNA提取，采用mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA翻轉(zhuǎn)為cDNA，STAT3熒光定量引物序列：正義：5′-TTGGAGGCAGGAATAGG-3′ 反義：5′-TGGCTTGACGGGTTGAT-3′，STAT5引物序列：正義：5′-TTTGGAGGCAGGAATAGG-3′反義：5′-TGGCTTGACGGGTTGAT-3′，以β-actin 為內(nèi)參，序列：正義5′-TCCACCGCAAATGCTTCTAG-3′，反義：5′-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′。20 μl反應(yīng)體系：10 μl 2×SYBR Green Mix，正義、反義引物各1 μl，H2O 7 μl，10×cDNA模板1 μl，反應(yīng)程序95℃ 3 min，94℃ 10 s、56℃ 20 s，72℃ 2 min，30個循環(huán)，72℃ 10 min，95℃ 10 s。利用CFX manager 3.0軟件進行CQ值分析，以β-actin作為內(nèi)參基因，按照2-ΔΔCQ算法進行基因相對定量分析。

1.2.5 Western印跡檢測JAK-STAT信號通路蛋白的表達 收集處理后的細胞液提取細胞總蛋白，BCA法測定提取后蛋白的濃度，配制8%、12%的分離膠與濃縮膠，取30 μg蛋白上樣，蛋白Marker 5 μl，濃縮膠電壓設(shè)置為80 V，分離膠電壓為120 V，反應(yīng)結(jié)束將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(JAK1和JAK2：200 mA，100 min；STAT3：90 V，120 min)加入脫脂牛奶封閉4 h，加入一抗(兔抗人JAK1、JAK2，鼠抗人STAT3單抗)4℃震蕩過夜，加入PBS溶液清洗3次，10 min/次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下反應(yīng)2 h，加入PBS溶液清洗3次，10 min/次。將蛋白凝膠用EXL發(fā)光后，在暗室中曝光，利用凝膠成像儀對Western印跡產(chǎn)生的條帶進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 Western印跡檢測JAK-STAT信號通路蛋白的表達 用60 mg/L Pae 處理HepG2細胞48 h后，JAK1、JAK2、STAT3、STAT5蛋白表達量均顯著低于對照組。見圖1。

A.未經(jīng)Pae處理； B：60 mg/L Pae 處理48 h圖1 Western印跡檢測結(jié)果

2.2 MTT法檢測Pae對HepG2細胞的抑制作用 不同濃度Pae對HepG2細胞均有一定抑制作用，Pae對HepG2細胞的抑制作用與培養(yǎng)時間和藥物劑量呈依賴性，在相同濃度下，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞的抑制率逐漸增加，相同培養(yǎng)時間內(nèi)，隨著劑量的增加，細胞的抑制作用逐漸增強。當Pae濃度為60 mg/L，處理細胞72 h時，抑制效果最佳。見圖2。

圖2 HepG2細胞生長抑制曲線

2.3 流式細胞儀檢測HepG2細胞的凋亡 對照組細胞未出現(xiàn)大量凋亡，經(jīng)60 mg/L Pae處理72 h后的HepG2細胞出現(xiàn)大量凋亡，處理組凋亡率(80%)明顯高于對照組(10%)(P<0.05)。

2.4 qRT-PCR法檢測Pae處理對HepG2細胞STAT3、STAT5 mRNA的影響 選取7.5、15、22.5、30 mg/L Pae 作用HepG2細胞48 h后，與對照組(0.90，0.81)相比，隨著處理濃度的增加，STAT3、STAT5基因表達量逐漸降低(7.5、15、22.5、30 mg/L Pae處理后細胞STAT3、STAT5 mRNA表達量分別為0.80，0.75；0.70，0.60；0.60，0.48；0.50，0.41；P<0.05)，與Pae劑量呈依懶性。

3 討 論

肝癌的發(fā)生發(fā)展是由多因素、多基因、多步驟共同參與而導(dǎo)致的結(jié)果，探究其發(fā)生原因主要與以下幾方面相關(guān)：(1)癌基因的激活或抑癌基因的失活；(2)肝細胞抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；(3)信號通路被激活使凋亡機制的失活；(4)細胞增殖異常、血管內(nèi)皮生長因子受到外源刺激〔4～6〕。

牡丹皮性寒、味苦有清熱解毒、活血化瘀的功效，具有保肝、消炎、抗癌、保護神經(jīng)、抗過敏性哮喘等作用，Pea是從牡丹皮中提取的有效化學(xué)成分〔7〕，近期有較多文獻報道Pae能夠通過多種途徑抑制控制腫瘤細胞的增殖，動物實驗表明Pae能夠通過升高血清中SOD、GSH-Px抑制脂質(zhì)過氧化進而抑制癌細胞增殖〔8〕，體外實驗表明Pea能夠抑制乳腺癌細胞以及宮頸癌細胞增殖〔9〕。此外，Pae與姜黃素聯(lián)合使用后抗腫瘤活性得到進一步提高，在Pae對肝癌MHCC97的抑制機制實驗結(jié)果中顯示Pae通過降低AKT表達、升高PTNE基因表達而抑制癌細胞增殖〔10，11〕。本研究結(jié)果表明Pae能夠顯著抑制肝癌細胞增殖，隨著PAE處理濃度的增加以及培養(yǎng)時間的延長其抑制作用逐漸增強，而且進一步流式細胞檢測也顯示經(jīng)Pae處理后細胞出現(xiàn)大量凋亡，表明Pae具有誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的作用。

JAK-STAT信號通路在肝癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，在正常情況下JAK和STAT通過反饋調(diào)節(jié)模式維持相對穩(wěn)定狀態(tài)，機體產(chǎn)生病變后激活JAK蛋白磷酸化，激活信號傳導(dǎo)途徑，使STAT蛋白中的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，活化后形成同源二聚體進入細胞核中與相應(yīng)靶基因結(jié)合從而調(diào)控其進行表達。相關(guān)研究表明STATS蛋白家族中的大部分成員對細胞增殖、凋亡以及細胞免疫方面產(chǎn)生一定影響。研究表明STAT3、STAT5被異常激活后，能夠引起下游靶基因如Survivin、Bcl-2、caspases、c-myc、Cyclin D1等的異常表達，這些基因均與細胞增殖凋亡等病理過程相關(guān)〔12〕。有研究表明STAT3在乳腺癌、肝癌、淋巴癌、肺癌中均大量表達，而正常組織中表達量較低〔13〕。在研究JAK-STAT信號通路與肝癌患者預(yù)后關(guān)系中結(jié)果顯示JAK-STAT途徑中JAK、STAT蛋白過度表達不利于患者預(yù)后〔14〕。有文獻報道JAK化學(xué)阻斷劑能夠誘導(dǎo)白血病細胞凋亡，而不影響正常細胞〔15〕。本研究結(jié)果顯示使用Pae處理后HepG2細胞中STAT3、STAT5基因表達量降低，提示這兩者基因的表達與肝癌細胞抑制相關(guān)，進一步從蛋白水平上研究結(jié)果顯示JAK1、JAK2、STAT3蛋白表達量下降，這與相關(guān)文獻〔13〕報道Pae能誘導(dǎo)BEL-7402細胞凋亡相符，提示JAK-STAT信號通路在肝癌發(fā)展中占有重要作用，Pae處理后能夠通過影響JAK-STAT信號通路蛋白表達，抑制肝癌細胞增殖。

1 黃乾榮，張 玲.原發(fā)性肝癌治療研究新進展〔J〕.實用醫(yī)學(xué)雜志，2016；32(14)：56-60.

2 楊紹梅，張 娜.肝癌治療藥物的研究進展〔J〕.中國新藥與臨床雜志，2015；8(2)：93-8.

3 劉 強，劉文彬，張玉芳，等.丹皮酚的酮基衍生物及其藥理活性研究進展〔J〕.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015；35(2)：56-9.

4 王莉莉，于 超.丹皮酚對HepG2細胞MRP2表達和功能的影響〔J〕.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016；15(2)：164-7.

5 孫愛華，陳 勁，關(guān)恒明，等.丹皮酚對肝癌HepG2/ADM細胞株多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及其機制〔J〕.山東醫(yī)藥，2016；8(1)：1-4.

6 王莉莉.丹皮酚對人肝癌細胞株HepG2藥物轉(zhuǎn)運體表達及功能的影響〔D〕.重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2015.

7 Zhang L，Tao L，Shi T，etal.Paeonol inhibits B16F10 melanoma metastasis in vitro and in vivo via disrupting proinflammatory cytokines-mediated NF-κB and STAT3 pathways〔J〕.IUBMB Life，2015；67(10)：778-88.

8 Jing W，Xia X，Zhang B，etal.The protective effects of paeonol against epirubicin-induced hepatotoxicity in 4T1-tumor bearing mice via inhibition of the PI3K/Akt/NF-κB pathway〔J〕.Chem Biol Interact，2015；244：1-8.

9 張燕麗，孟凡佳，付起鳳，等.牡丹皮中有效成分丹皮酚的抗癌作用研究進展〔J〕.中醫(yī)藥信息，2016；33(1)：117-9.

10 Ukawa S，Tamakoshi A，Wakai K，etal.Associations of daily walking and television viewing time with liver cancer mortality：findings from the Japan Collaborative Cohort Study〔J〕.Cancer Causes Control，2014；25(7)：787-93.

11 王建杰，董 航，王茉琳，等.丹皮酚對人MCF-7乳腺癌細胞PI3 K/Akt mRNA表達的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014；34(1)：68-70.

12 Lepage C，Capocaccia R，Hackl M，etal.Survival in patients with primary liver cancer，gallbladder and extrahepatic biliary tract cancer and pancreatic cancer in Europe 1999-2007：Results of EUROCARE-5〔J〕.Eur J Cancer，2015；51(51)：2169-78.

13 吳 珊，權(quán)循鳳，孫國平，等.丹皮酚對食管鱗癌細胞株Eca-109的體外放射增敏作用和機制〔J〕.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014；(10)：1418-22.

14 Chatterjee R，Mitra A.An overview of effective therapies and recent advances in biomarkers for chronic liver diseases and associated liver cancer〔J〕.Internat Immunopharmacol，2015；24(2)：335-45.

15 張秀娟，侯 喆，白雪瑩，等.楊梅素作用于人肝癌HepG-2細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究〔J〕.中國藥理學(xué)通報，2014；30(1)：71-6.

〔2016-11-30修回〕

(編輯 郭 菁)

齊齊哈爾市科技計劃指令性項目(XCP-201401)

梁明輝(1975-)，男，碩士，高級實驗師，主要從事醫(yī)學(xué)影像學(xué)研究。

于洋洋(1989-)，男，主要從事臨床醫(yī)學(xué)研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)07-1591-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.011