2型糖尿病大鼠海馬胰島素樣生長因子-1表達(dá)變化及絲膠的干預(yù)作用

王芳芳 王 楓 宋成軍 陳志宏

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000)

2型糖尿病大鼠海馬胰島素樣生長因子-1表達(dá)變化及絲膠的干預(yù)作用

王芳芳 王 楓 宋成軍1陳志宏1

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000)

目的 探討2型糖尿病模型大鼠海馬胰島素樣生長因子(IGF)-1表達(dá)的變化以及絲膠的干預(yù)作用。方法 取健康雄性SD大鼠，以25 mg/kg的鏈脲佐菌素連續(xù)(1次/d，注射3 d)腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型，模型成功建立后給予模型大鼠絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃35 d作為治療藥物，同時以二甲雙胍(55.33 mg·kg-1·d-1)作為陽性對照藥物。采用逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測大鼠海馬IGF-1 mRNA表達(dá)。結(jié)果 與模型組大鼠比較，絲膠治療組大鼠海馬IGF-1 mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 絲膠可上調(diào)糖尿病模型大鼠海馬IGF-1的表達(dá)，這可能是絲膠保護(hù)糖尿病海馬損傷的機(jī)制之一。

絲膠；2型糖尿??；海馬；胰島素樣生長因子(IGF)-1

胰島素樣生長因子(IGF)，也被稱為“類胰島素生長因子”或“生長激素介質(zhì)”，是生長激素發(fā)揮生理作用必需的一種活性蛋白多肽物質(zhì)，已知包括IGF-1和IGF-2兩種。糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)損傷是糖尿病晚期并發(fā)癥之一，以獲得性認(rèn)知和行為缺陷為特征，患者主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降，而海馬與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)〔1〕。本研究擬探討彩色蠶繭水提物絲膠可否通過影響海馬IGF-1的表達(dá)改善糖尿病時神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的選擇、分組和給藥 SPF級健康成年雄性SD大鼠48只，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(大鼠合格證號：712024)。根據(jù)隨機(jī)原則分為空白對照組、模型組、絲膠治療組和陽性對照組，每組12只。采用鏈脲佐菌素(美國Sigma，用pH4.4的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液臨用時配制成2%的溶液，用量25 mg/kg，連續(xù)注射3 d)腹腔注射法建立2型糖尿病大鼠模型，成模標(biāo)準(zhǔn)是注射鏈脲佐菌素7 d后大鼠的空腹血糖≥16.7 mmol/L。成功建模后，分別給予絲膠治療組和陽性對照組大鼠2.4 g·kg-1·d-1絲膠和55.33 mg·kg-1·d-1二甲雙胍灌胃35 d；模型組大鼠不予其他任何處理。

1.2 絲膠的獲取 取承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所提供的彩色蠶繭，蒸餾水浸泡24 h后水煎2次，合并濾液，過濾、濃縮，即得。

1.3 大鼠取材和檢測血糖 大鼠使用4%水合氯醛腹腔注射麻醉，用毛細(xì)玻璃管經(jīng)內(nèi)眥刺入大鼠眶后靜脈叢并采集靜脈血，4℃、3 000 r/min離心，收集血清，使用全自動生化分析儀采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖。然后斷頭處死大鼠，在冰盤上迅速取腦并分離雙側(cè)海馬入液氮保存。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測海馬IGF-1 mRNA的表達(dá) 加入Trizol(美國Invitrogen公司)提取海馬總RNA(100 mg海馬，液氮保存)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：94℃、2 min，94℃、30 s，50℃～65℃、30 s，72℃，1 min，第2步起循環(huán)。引物序列(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)：①IGF-1，正義:5′-CTGGTGGACGCTCTTCAGTTCG-3′，反義:5’-TCCTTCTCCTTTGCAGCTTCC-3′；②β-actin，正義:5′-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反義:5′-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3′。退火溫度：IGF-1 59℃、β-actin 55℃，循環(huán)次數(shù)：IGF-1 31次，β-actin 29次，產(chǎn)物大小：IGF-1 280 bp、β-actin 445 bp。取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物和5 μl DNA Ladder(北京泰格美科技有限公司)進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，使用ZF型紫外透射反射分析儀攝像。應(yīng)用Quantity One-4.6.2軟件進(jìn)行定量分析，以IGF-1條帶光密度/β-actin條帶光密度作為IGF-1 mRNA表達(dá)的相對水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖水平檢測結(jié)果 與空白對照組〔(10.83±2.03)mmol/L〕大鼠比較，模型組大鼠的血糖水平〔(29.45±4.82)mmol/L〕明顯升高(P<0.05)；與模型組大鼠比較，絲膠治療組〔(13.20±4.09)mmol/L〕、陽性對照組〔(13.18±2.30)mmol/L〕大鼠的血糖水平明顯降低(P<0.05)。

2.2 各組大鼠海馬IGF-1 mRNA表達(dá)結(jié)果 與空白對照組(1.502 0±0.027 6)大鼠比較，模型組(0.543 7±0.026 7)大鼠海馬IGF-1 mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組大鼠比較，絲膠治療組(1.032 3±0.022 4)、陽性對照組(1.052 1±0.016 1)大鼠海馬IGF-1 mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見圖1。

1.空白對照組；2.模型組；3.絲膠治療組；4.陽性對照組圖1 逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測大鼠海馬IGF-1 mRNA的表達(dá)

3 討 論

目前，臨床治療糖尿病仍以服用化學(xué)合成的藥物為主(如經(jīng)典降糖藥物二甲雙胍等)，各種藥物雖能明顯降低血糖，但不能有效改善胰島素抵抗，且長期服用容易產(chǎn)生各種比較嚴(yán)重的副作用，造成肝、腎損害〔2〕。因此，有必要探討降糖效果可靠、毒副作用少的天然物質(zhì)。

絲膠約占蠶繭的25%～30%，在提取絲素(用于制作衣料)的過程中被丟棄，不但浪費(fèi)了絲膠也造成了環(huán)境污染。根據(jù)民間蠶繭泡水降血糖的驗方，結(jié)合《本草綱目》關(guān)于蠶繭的記載：蠶繭，性甘、溫，無毒，具有滋陰潤燥、生精止渴的作用〔3〕，本課題組采用水煎的方法提取蠶繭中的水溶性蛋白——絲膠，前期研究發(fā)現(xiàn)，絲膠能明顯降低糖尿病模型大鼠的血糖，保護(hù)糖尿病時大鼠肝臟損傷〔4,5〕。

IGF-1是一種在分子結(jié)構(gòu)上與胰島素類似的多肽蛋白物質(zhì)，是人體內(nèi)肝、腎、脾、腦等多種臟器自分泌和旁分泌的產(chǎn)物，具有降血糖、降血脂、舒張血管、促進(jìn)骨的合成代謝、促生長、促進(jìn)細(xì)胞分化和創(chuàng)傷修復(fù)等多種功能。由于胰島素不能通過血腦屏障，傳統(tǒng)觀點認(rèn)為胰島素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)沒有影響，但近年的研究發(fā)現(xiàn)，胰島素與認(rèn)知功能有關(guān)，在腦內(nèi)存在胰島素和IGF-1，它們有類似神經(jīng)營養(yǎng)因子的功能，作用于神經(jīng)細(xì)胞〔6,7〕；同時有研究發(fā)現(xiàn)，嗅球、脈絡(luò)叢、下丘腦、海馬、大腦皮質(zhì)等腦內(nèi)的多個部位存在有IGF-1受體〔8〕。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，IGF-1有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、成熟等類似神經(jīng)營養(yǎng)支持的作用，能抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)突觸的可塑性以及神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放，同時能調(diào)節(jié)鈣通道的活性等；另外，IGF-1還具有神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)再生、髓鞘化、突觸再生和樹突分支形成等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)等作用〔6，9,10〕。上述研究均提示，IGF-1在細(xì)胞增殖、凋亡、機(jī)體生長發(fā)育等各方面均有重要作用，決定了其將在疾病治療中占有重要的地位〔11,12〕。

本研究結(jié)果提示絲膠可上調(diào)糖尿病模型大鼠海馬IGF-1的表達(dá)，這可能是絲膠保護(hù)糖尿病時海馬損傷的機(jī)制之一。

1 Chen H,Iinuma M,Onozuka M,etal.Chewing maintains hippocampus-dependent cognitive function〔J〕.Int J Med Sci,2015;12(6):502-9.

2 Bonsignore A,Pozzi F,Fraternali Orcioni G,etal.Fatal metformin overdose:case report and postmortem biochemistry contribution〔J〕.Int J Legal Med,2014;128(3):483-92.

3 李時珍.本草綱目〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，1985:1045-52.

4 付秀美，鐘美蓉，付文亮，等.絲膠對2型糖尿病大鼠血糖和血脂的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;31(1):103-5.

5 劉東慧，王小杰，宋成軍，等.2型糖尿病大鼠肝臟腫瘤壞死因子-α表達(dá)變化及絲膠的保護(hù)作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015;35(21):6011-3.

6 王蓬文，楊 芳，盛樹力，等.胰島素樣生長因子受體-1在糖尿病小鼠腦內(nèi)的分布〔J〕.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2002;18(2):127-30.

7 Supeno NE,Pati S,Hadi RA,etal.IGF-1 acts as controlling switch for long-term proliferation and maintenance of EGF/FGF-responsive striatal neural stem cells〔J〕.Int J Med Sci,2013;10(5):522-31.

8 吳曉宇.生長激素-胰島素樣生長因子軸與結(jié)直腸癌〔J〕.腸外與腸內(nèi)營養(yǎng)，2007;14(5):374-7.

9 Mangiola A,Vigo V,Anile C,etal.Role and importance of IGF-1 in traumatic brain injuries〔J〕.Biomed Res Int,2015;2015:736104.

10 Joshi Y,Sória MG,Quadrato G,etal.The MDM4/MDM2-p53-IGF1 axis controls axonal regeneration,sprouting and functional recovery after CNS injury〔J〕.Brain,2015;138(Pt 7):1843-62.

11 Ekstr?m K,Salemyr J,Zachrisson I,etal.Normalization of the IGF-IGFBP axis by sustained nightly insulinization in type 1 diabetes〔J〕.Diabetes Care,2007;30(6):1357-63.

12 Trojan E,Glombik K,Slusarczyk J,etal.The beneficial impact of antidepressant drugs on prenatal stress-evoked malfunction of the insulin-like growth factor-1 (IGF-1) protein family in the ol factory bulbs of adult rats〔J〕.Neurotox Res,2016;29(2):288-98.

〔2016-05-31修回〕

(編輯 郭 菁)

The expression of insulin-like growth factors-1 in hippocampus of type 2 diabetic rats and intervention effects of sericin

WANG Fang-Fang, WANG Feng, SONG Cheng-Jun,etal.

Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, Hebei, China

Objective To investigate the changes of insulin-like growth factors (IGF) -1 in hippocampus of type 2 diabetic rats and intervention effects of sericin.Methods Healthy male SD rats were used to establish type 2 diabetes model rats by intraperitoneally injecting streptozotocin (25 mg/kg, 1 time a day, 3 days).Then the model rats were lavaged with sericin (2.4 g·kg-1·d-1) for 35 days.The metformin (55.33 mg·kg-1·d-1) was used as positive control drug.RT-PCR was used to detect the expression of IGF-1 mRNA in hippocampus.Results Compared with type 2 diabetes model rats, the expression of IGF-1 mRNA in hippocampus of rats in experimental group was increased obviously (P<0.05).Conclusions Sericin could down regulate the expression of IGF-1 in hippocampus, this maybe one of the mechanisms that sericin protects hippocampus injury during diabetes.

Sericin; Type 2 diabetes mellitus; Hippocampus; Insulin-like growth factors(IGF)-1

國家自然科學(xué)基金項目(81441133)；河北省自然科學(xué)基金項目(H2012406018)；河北省高校重點發(fā)展學(xué)科“人體解剖與組織胚胎學(xué)”建設(shè)項目資助

1 承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室

陳志宏(1971-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的中醫(yī)藥防治方面的研究。 宋成軍(1972-)，男，碩士，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的中醫(yī)藥防治方面的研究。

王芳芳(1964-)，女，主要從事神經(jīng)內(nèi)科方面的研究。

R587

A

1005-9202(2017)07-1574-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.005