趨化因子CXC配體12/CXC受體4在前列腺癌細胞的表達及其對細胞增殖的作用機制

曲修勝 劉媛媛 孫華威 梁立春 李 玥 齊亞靈 王偉群

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154002)

趨化因子CXC配體12/CXC受體4在前列腺癌細胞的表達及其對細胞增殖的作用機制

曲修勝 劉媛媛 孫華威 梁立春1李 玥1齊亞靈2王偉群1

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154002)

目的 檢測DU145、PC-3和LNCaP前列腺癌細胞中趨化因子CXC配體(L)12及其受體(R)4的表達，探討重組人CXCL12對上述細胞增殖的影響及其機制。方法 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)研究CXCL12/CXCR4在DU145、PC-3和LNCaP細胞的表達；CCK-8實驗研究重組人CXCL12對DU145、PC-3和LNCaP細胞增殖的作用；Wettern印跡實驗研究重組人CXCL12對DU145細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和磷酶化ERK(pERK)表達的影響。結(jié)果 DU145、PC-3和LNCaP細胞均表達CXCL12和CXCR4，重組人CXCL12可明顯促進上述細胞的增殖，重組人CXCL12雖然不能改變DU145細胞ERK1/2表達，但可上調(diào)pERK1/2的表達。結(jié)論 前列腺癌細胞表達CXCL12 及其受體CXCR4，CXCL12/CXCR4可通過活化絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信號通路促進前列腺癌細胞的增殖。

前列腺癌；趨化因子CXC配體(L)12；CXC受體(R)4；細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)

前列腺癌是臨床上最常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其致死率位列所有男性腫瘤的第二位〔1〕。目前認為，前列腺癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，高危因素包括年齡、吸煙、炎癥、雄激素水平、飲食和遺傳等。其中，炎癥反應(yīng)在惡性腫瘤中的作用越來越引起人們的關(guān)注，其已被認為是癌癥發(fā)生的第七大危險因素〔2〕。趨化因子屬于細胞因子超家族成員，其具有吸引、活化、調(diào)節(jié)各種類型白細胞運輸?shù)墓δ?。近年來的研究成果表明，趨化因子也可通過促進腫瘤微環(huán)境中血管的生成、腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移而參與腫瘤的發(fā)生與演進過程〔3〕。本研究觀察趨化因子CXC配體(L)12及其受體(R)4在前列腺癌細胞的表達并探討CXCL12對前列腺癌細胞增殖的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞及試劑 人類前列腺癌細胞系DU145、PC-3和 LNCaP(中科院上海細胞庫，中國)，胎牛血清(NQBB，美國)，青、鏈霉素和細胞計數(shù)試劑盒(CCK)8(博士德，中國)，RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，美國)，Trizol(Invitrogen，美國)，TIANScript RT試劑盒(天跟，中國)，外源性CXCL12(PeproTech，美國)，苯甲基磺酰氟(PMSF)、放射免疫沉淀(RIPA)裂解液和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(碧云天，中國)，兔抗細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和兔抗磷酸化ERK(pERK)(Affinity，美國)，鼠抗β-actin、辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗(中杉金橋，中國)。

1.2 細胞培養(yǎng) DU145、PC-3和 LNCaP細胞被接種和培養(yǎng)在含10% 胎牛血清、100 μg/ml青、鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，待細胞密度達到90%以上時，細胞受胰蛋白酶消化，離心后收集細胞沉淀或傳代，備用。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)實驗 用Trizol試劑常規(guī)提取DU145、PC-3和LNCaP細胞的總RNA并測量其濃度，利用TIANScript RT試劑盒按操作規(guī)程將2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并行PCR實驗。PCR擴增中各基因引物及PCR反應(yīng)條件見表1。

表1 PCR引物及反應(yīng)條件

1.4 細胞增殖實驗 取對數(shù)生長期DU145、PC-3和 LNCaP細胞重懸于RPMI1640完全培養(yǎng)基中(含10% 胎牛血清、100 μg/ml青、鏈霉素)。待計數(shù)板計數(shù)細胞后，將1.5×103細胞/孔分別接種于96孔板中，并于37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待第2天細胞完全貼壁后，小心吸取培養(yǎng)基，向每孔中加入含外源性CXCL12完全培養(yǎng)基100 μl，使各孔中外源性CXCL12終濃度分別為0、10、20、40和 60 ng/ml，將孔板置于上述培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后用CCK8試劑盒檢測細胞增殖情況。

1.5 Western印跡實驗 將細胞培養(yǎng)在10 cm培養(yǎng)皿中，待細胞融合度達到90%以上后，收集細胞沉淀，加入含PMSF 的RIPA蛋白裂解液充分裂解細胞，待BCA蛋白定量試劑盒測量各樣本濃度后將樣本存于-80℃冰箱中備用。Western印跡流程如下：取50 μg的總蛋白于12%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠中電泳(電壓為110 V)；將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(電流為300 mA，2 h)；5%的脫脂奶粉室溫封閉3 h；Tween-20磷酸鹽緩沖液(PBST)洗膜3×5 min；一抗4℃孵育過夜(β-actin、ERK和pERK濃度均為1∶1 000)，PBST洗膜3×5 min； HRP標記的二抗(1∶10 000)37℃孵育45 min；PBST洗膜4×5 min；向膜上加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液，并于全自動化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)中曝光、拍照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件行q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 前列腺癌細胞表達CXCL12及其受體CXCR4 DU145、PC-3和 LNCaP均表達CXCL12及其受體CXCR4。見圖1。半定量分析表明，與PC-3(0.51±0.08)和DU145(0.29±0.06)比較，LNCaP細胞 CXCL12 mRNA表達量(1.34±0.14)明顯增高，而CXCR4的mRNA水平在DU145中最高(0.99±0.08)，LNCaP次之(0.62±0.09)，PC-3最低(0.47±0.06)。

圖1 前列腺癌細胞表達CXCL12及CXCR2 mRNA

2.2 外源性CXCL12促進前列腺癌細胞增殖 細胞培養(yǎng)72 h后，CCK8實驗結(jié)果表明，外源性CXCL12均可促進DU145、PC-3和 LNCaP的增殖，但是各細胞促進增殖的濃度有明顯差異(P<0.05)，DU145的促增殖濃度為10、20和40 ng/ml，PC-3為60 ng/ml，而LNCaP為10、20、40和60 ng/ml。見表2。

2.3 外源性CXCL12促進DU145細胞ERK磷酸化(pERK) 與0 ng/ml CXCL12(0.70±0.35、0.55±0.13)比較，10、40 ng/ml的CXCL12不能改變ERK的水平(1.01±0.15、0.94±0.14，P>0.05)，但可明顯促進pERK的表達(1.55±0.14、1.56±0.18，P<0.05)。見圖2。

組別0ng/ml10ng/ml20ng/ml40ng/ml60ng/mlDU1450.553±0.080.636±0.061)0.666±0.032)0.753±0.042)0.647±0.04PC-30.491±0.040.526±0.060.529±0.060.541±0.040.610±0.031)LNCaP0.609±0.100.768±0.031)0.848±0.051)0.864±0.041)0.837±0.031)

與0 ng/ml比較：1)P<0.05；2)P<0.01

1～3：0、10、40 ng/ml CXCL12圖2 外源性CXCL12上調(diào)DU145 細胞pERK水平

3 討 論

前列腺癌在歐美被稱為男性健康的第一大殺手，其發(fā)病率位居西方世界男性惡性腫瘤的第一位，而死亡率也已升至第二位，僅次于肺癌〔4〕。前列腺癌在北京男性泌尿生殖系腫瘤中排名第一位、所有腫瘤疾病中排名第五位〔5〕。

炎癥反應(yīng)是機體在進化演進過程中形成的具有抵抗及清除病原微生物、異物及壞死組織的一種保護機制。該過程有助于生物體清除異己，從而保證個體的生存，但炎癥的長期存在，即慢性炎癥，也會導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生〔6〕。全球約25%的腫瘤是由炎癥發(fā)展而來的〔7〕。

趨化因子屬于細胞因子超家族成員，根據(jù)鄰近氨基端結(jié)構(gòu)性半胱氨酸的排列，其可被分為CXC、CX3C、CC和C四個亞家族。其中CXC亞家族又可依據(jù)第一個保守半胱氨酸前是否存有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(ELR)結(jié)構(gòu)，進一步分為ELR+CXC和ELR-CXC兩類。盡管趨化因子在炎癥和免疫反應(yīng)中可以活化、吸引及調(diào)節(jié)粒細胞的遷移，但越來越多的證據(jù)顯示，趨化因子也參與了腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成〔8〕。

作為ELR+CXC類趨化因子中的一員，CXCL12是CXCR4的唯一配體。有研究已經(jīng)證實，CXCL12/CXCR4參與了多種腫瘤的發(fā)生與演進過程。在包括卵巢癌、小細胞肺癌和腦膠質(zhì)瘤的許多腫瘤中，CXCL12均可促進表達CXCR4腫瘤細胞的增殖與存活〔9～11〕。另外，CXCL12也參與腫瘤細胞的特異性器官轉(zhuǎn)移，Müller等〔12〕研究表明，CXCR4高表達于乳腺癌細胞和乳腺癌組織，而乳腺癌常轉(zhuǎn)移的靶組織則高表達其配體CXCL12，CXCR4可介導(dǎo)乳腺癌細胞肌動蛋白的聚合和偽足形成，并借助受體與配體的特異性結(jié)合，以實現(xiàn)其向靶組織的趨化及轉(zhuǎn)移，這就是所謂的“歸巢學(xué)說”，而阻斷CXCL12/CXCR4的相互作用，則可抑制癌細胞的歸巢和遷移。本研究提示，CXCL12的表達可能與雄激素信號有關(guān)。細胞增殖實驗表明外源性給予CXCL12均可促進上述細胞的增殖，而當(dāng)CXCL12濃度增加到一定數(shù)值后，其促DU145和LNCaP的增殖效應(yīng)有所下降。Begley等〔13〕的研究證實同為ELR+CXC類趨化因子的CXCL5對前列腺癌細胞的增殖也具有雙向調(diào)節(jié)作用，即一定濃度的CXCL5可促進癌細胞增殖，而超過一定濃度反而會出現(xiàn)抑制效應(yīng)；推斷這種現(xiàn)象可能與高濃度的配體導(dǎo)致受體下調(diào)有關(guān)。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK通路在腫瘤中的作用已被廣泛證實，其不僅參與了腫瘤細胞的增殖與血管發(fā)生，還在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用〔14～16〕。本研究結(jié)果表明，外源性CXCL12雖然不能改變ERK1/2表達，但可上調(diào)pERK1/2的表達。由此可見活化MAPK/ERK信號通路可促進前列腺癌細胞的增殖。

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〔2015-12-17修回〕

(編輯 苑云杰)

The expression of CXCL12/CXCR4 axis in prostate cancer cells and its action mechanism on cells proliferation

QU Xiu-Sheng,LIU Yuan-Yuan,SUN Hua-Wei,etal.

Medical Oncology,the First Affiliated Hospital,Jiamusi University,Jiamusi 154002,Heilongjiang,China

Objective To test the expression of chemotactic factor CXCL12 and its receptor CXCR4 in DU145,PC-3 and LNCaP prostate cancer cell,and explore the effect and mechanism of human recombinant CXCL12 on the proliferation of cells mentioned above.Methods RT-PCR experiments were utilized to study the expression of CXCL12/CXCR4 in DU145,PC-3 and LNCaP cells;CCK-8 experiments were used to investigate the proliferative effects of human recombinant CXCL12 on DU145,PC-3 and LNCaP cells;Western blot experiments were performed to explore the effect of human recombinant CXCL12 on the expression of ERK and pERK.Results CXCL12 and CXCR4 were expressed in DU145,PC-3 and LNCaP cells.Human recombinant CXCL12 obviously promoted proliferative response on the three cell lines,which didn’t change the expression of ERK1/2 in DU145 cells,whereas up-regulated pERK1/2 expressionConclusions Prostate cancer cells express CXCL12 and its receptor CXCR4,CXCL12/CXCR4 axis contributes prostate cancer cells proliferation by activating MAPK/ERK signaling pathway.

Prostate cancer;CXCL12;CXCR4;ERK

國家自然科學(xué)基金面上資助項目(No.81272854)；黑龍江省自然科學(xué)基金資助項目(No.D201129)；佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目(No.YM2016_006)

1 佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 2 海南醫(yī)學(xué)院

王偉群(1974-)，男，醫(yī)學(xué)博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤病理生理學(xué)研究。 齊亞靈(1967-)，女，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤發(fā)病機制研究。

曲修勝(1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤放化療研究。

R737.25

A

1005-9202(2017)07-1568-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.003