依那普利聯(lián)合鴉膽子油對(duì)肝硬化模型大鼠肝纖維化的影響

謝正元 丁 浩 肖志華 王芬芬 郭武華

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江西 南昌 330006)

依那普利聯(lián)合鴉膽子油對(duì)肝硬化模型大鼠肝纖維化的影響

謝正元 丁 浩 肖志華 王芬芬 郭武華

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江西 南昌 330006)

目的 通過(guò)研究依那普利聯(lián)合鴉膽子油對(duì)肝硬化模型大鼠肝臟纖維化的影響，探討其作用機(jī)制。方法 將SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、鴉膽子油組、依那普利組、兩藥聯(lián)合組，采用0.5%二甲基亞硝胺(DEN)生理鹽水溶液腹腔注射制備大鼠肝硬化模型。各組給藥治療后，取大鼠血清檢測(cè)反映肝功能的總膽紅素(T-Bil)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、白蛋白(Alb)、總蛋白(TP)以及肝纖維化相關(guān)指標(biāo)Ⅲ型前膠原(PⅢ)、透明質(zhì)酸(HA)、層黏蛋白(LN)和Ⅳ型膠原(CⅣ)的含量。另外，利用ELISA法測(cè)定血清α-肌動(dòng)蛋白(SMA)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-1、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1的表達(dá)情況，取部分肝臟進(jìn)行HE染色觀察肝臟病理形態(tài)變化。結(jié)果 與空白組相比，模型組血清中T-Bil、ALT、AST、GGT、PⅢ、HA、LN、CⅣ、α-SMA、TIMP-1、ICAM-1和MMP-1含量均顯著升高，而Alb和TP含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)。HE染色顯示模型組大鼠肝臟出現(xiàn)炎性細(xì)胞活動(dòng)及纖維組織增生等病理改變。與模型組比較，單一用藥組血清中T-Bil、ALT、AST、GGT、PⅢ、HA、LN、CⅣ含量有所降低，而Alb和TP含量有所升高，其中鴉膽子油組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合用藥組血清中T-Bil、ALT、AST、GGT、PⅢ、HA、LN、CⅣ含量降低更明顯，而Alb和TP含量顯著升高(P<0.01)。大鼠肝組織病理狀態(tài)也有所改善，其中聯(lián)合用藥組比單一用藥組的肝臟組織狀態(tài)、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生情況明顯改善，受損肝小葉結(jié)構(gòu)極少，沒(méi)有間隔出現(xiàn)。結(jié)論 依那普利聯(lián)合鴉膽子油可協(xié)同治療肝硬化，同時(shí)也減輕肝臟功能的損害，使肝纖維化癥狀得到改善，且效果比單一用藥好。因此，依那普利與鴉膽子油聯(lián)合用藥對(duì)提高肝硬化的治療效果有著重要的臨床意義。

肝硬化；鴉膽子油；肝纖維化

肝硬化是一種長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作的慢性、彌散性肝臟疾病〔1〕，其病理特征為大面積肝細(xì)胞壞死、肝小葉損傷，肝臟逐漸纖維化等。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)肝組織發(fā)生炎癥時(shí)常伴有膠原纖維組織沉積，因此針對(duì)肝硬化進(jìn)行抗肝纖維化治療非常重要〔2〕。依那普利是一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑，能夠很好地抑制肝臟纖維化癥狀〔3〕。鴉膽子油來(lái)源于中藥鴉膽子的成熟果實(shí)，性極苦寒有毒，毒性成分主要存在于水溶性苦味質(zhì)部分，油脂部分無(wú)明顯毒性，主要成分油酸有很強(qiáng)的抗肝癌活性〔4，5〕；與西藥聯(lián)用，發(fā)揮協(xié)同抗肝癌作用，在發(fā)揮治療效果的同時(shí)可以減少西藥治療的副作用。本研究擬評(píng)價(jià)依那普利聯(lián)合鴉膽子油治療肝硬化的作用，探索其抗纖維化作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 總膽紅素(T-Bil)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)試劑盒(南京森貝伽生物公司)；白蛋白(Alb)和總蛋白(TP)試劑盒(北京中創(chuàng)宏達(dá)有限公司)；透明質(zhì)酸(HA)、層黏蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、Ⅲ型前膠原(PⅢ)試劑盒(上海佳和生物有限公司)；α-肌動(dòng)蛋白(SMA)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-1、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1試劑盒(BioSource 公司)；鴉膽子油乳注射液(浙江九旭藥業(yè)有限公司)；依那普利(上?，F(xiàn)代制藥有限公司)。

1.2 動(dòng)物 健康SD大鼠75只，體重(220±20)g，10 周齡左右，雌雄各半，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(黑)2014001。

1.3 儀器 全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus 公司)；高速冷凍離心機(jī)和低速離心機(jī)(上海安亭有限公司)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Thermo Scientific公司)；γ放射免疫計(jì)數(shù)器(西化儀科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物模型的制備 參照文獻(xiàn)復(fù)制肝硬化大鼠模型〔6，7〕，采用生理鹽水作溶劑配置0.5%二甲基亞硝胺(DEN)溶液，對(duì)大鼠連續(xù)4 w腹腔注射，給藥量2 ml/kg，1次/d，隔天給藥一次；空白組腹腔注射等量生理鹽水。

1.4.2 分組和給藥 將SD大鼠分為模型組、鴉膽子油組、依那普利組、兩藥聯(lián)合組，每組15只，各組分別腹腔注射鴉膽子油0.3 ml·kg-1·d-1、依那普利15 mg·kg-1·d-1以及同時(shí)依次腹腔注射兩種藥物的相同劑量，連續(xù)給藥治療8 w，模型組和空白組腹腔注射等量的生理鹽水。

1.4.3 采集標(biāo)本 給藥治療結(jié)束后，對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉后腹主動(dòng)脈取血，分離血清。取血后立即取出肝臟，用冰生理鹽水沖洗后取小塊肝臟組織，經(jīng)過(guò)處理用于HE染色。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 肝功能 取已處理的血清樣品，按照試劑盒的操作方法測(cè)定血清中T-Bil、ALT、AST、GGT、Alb以及TP水平。

1.5.2 肝纖維化指標(biāo)的檢測(cè) 采用 ELISA法測(cè)定血清中HA、LN、CⅣ、PⅢ含量，嚴(yán)格按照說(shuō)明操作。

1.5.3 組織病理學(xué)觀察 經(jīng)10%甲醛溶液固定的肝左葉，常規(guī)制作成病理石蠟切片，HE 染色，在光鏡下觀察肝內(nèi)部結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞炎癥程度以及肝纖維組織增生情況。

1.5.4 大鼠肝組織相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 按照試劑盒操作步驟測(cè)定血清中α-SMA、TIMP-1、ICAM-1和MMP-1蛋白的表達(dá)情況，觀察各組相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清肝功能指標(biāo)測(cè)定 相比較于空白組，模型組大鼠血清T-Bil、ALT、AST和GGT含量均顯著增多(P<0.01)，而Alb和TP水平明顯減少(P<0.05)。經(jīng)過(guò)藥物治療后，與模型組相比，單一用藥組的T-Bil、ALT、AST和GGT含量有所降低(P<0.05)，而Alb 和TP水平有所提高(P<0.05)，其中依那普利組的差異不明顯(P>0.05)，而鴉膽子油組的差異明顯(P<0.05)；但兩藥聯(lián)合組T-Bil、ALT、AST、GGT、Alb 和TP水平變化最明顯(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 大鼠血清肝纖維化指標(biāo)含量的變化 相比較于空白組，模型組血清中PⅢ、HA、LN 和CⅣ含量均顯著升高(P<0.05)。而與模型組相比，單一用藥組相應(yīng)的肝纖維化指標(biāo)含量稍有降低，其中依那普利組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩藥聯(lián)合組相應(yīng)的肝纖維化指標(biāo)含量降低更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明聯(lián)合用藥能夠更好地緩解大鼠肝臟纖維化程度。見(jiàn)表2。

組別T-Bil(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)GGT(U/L)Alb(g/L)TP(g/L)空白組7.12±2.3530.82±8.5872.15±23.1521.59±5.4243.56±13.1272.15±15.24模型組28.15±10.122)54.23±12.252)126.15±18.562)50.26±8.542)32.15±8.541)59.26±10.251)鴉膽子油組20.15±12.453)40.25±8.563)109.12±26.123)35.44±3.453)40.19±7.583)69.15±8.453)依那普利組17.45±3.563)39.12±13.223)110.15±18.243)35.30±5.1283)38.17±9.1567.56±11.24兩藥聯(lián)合組12.56±2.554)31.69±10.054)82.28±14.254)25.58±7.444)43.12±10.114)74.44±13.294)

與空白組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05,4)P<0.01

組別PⅢHALNCⅣ空白組45.26±8.24145.26±35.1256.92±9.2860.26±10.12模型組98.12±14.121)253.47±45.241)120.08±12.251)102.17±34.151)鴉膽子油組86.68±13.14221.84±35.24110.14±24.1290.11±24.14依那普利組74.13±10.242)199.38±29.142)106.12±18.242)82.15±28.452)兩藥聯(lián)合組52.77±8.583)164.51±19.123)80.24±16.283)69.12±18.253)

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

2.3 各組大鼠病理形態(tài)學(xué)的變化 空白組大鼠肝組織完整，光滑，富有彈性，肝小葉呈多角形，結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列整齊規(guī)則；模型組大鼠肝臟出現(xiàn)較嚴(yán)重的病理?yè)p傷，肝小葉被分割成假小葉，肝細(xì)胞肥大同時(shí)出現(xiàn)間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)以及大量纖維組織增生；鴉膽子油組肝小葉結(jié)構(gòu)仍有部分破壞，依舊存在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生，但程度較輕而且間隔形成較少；依那普利組與鴉膽子油組基本相似；鴉膽子油與依那普利聯(lián)合后，肝臟組織狀態(tài)明顯改善，受損肝小葉結(jié)構(gòu)極少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生情況明顯改善，沒(méi)有間隔出現(xiàn)。見(jiàn)圖1。

2.4 治療后肝組織α-SMA、TIMP-1、ICAM-1和MMP-1 蛋白表達(dá)變化 相比較于空白組，模型組肝組織α-SMA、TIMP-1、ICAM-1和MMP-1表達(dá)顯著增強(qiáng) (P<0.01)；經(jīng)過(guò)治療后，與模型組比較，鴉膽子油組和依那普利組α-SMA、TIMP-1、ICAM-1和MMP-1指標(biāo)略微降低，而兩藥聯(lián)用組這幾種蛋白表達(dá)顯著降低 (P<0.01)，見(jiàn)表3。

圖1 各組大鼠肝組織病理狀態(tài)(HE，×200)

組別α-SMATIMP-1ICAM-1MMP-1空白組623.27±241.35420.57±110.12220.17±57.15240.88±89.47模型組1456.78±342.471)1104.27±349.121)685.24±104.741)780.17±124.121)鴉膽子油組1208.34±275.241097.24±210.74524.12±100.252)625.47±153.25依那普利組1059.24±198.452)939.55±185.452)478.25±114.232)525.34±108.122)兩藥聯(lián)合組786.77±154.723)784.25±145.583)345.28±124.253)321.25±136.243)

3 討 論

肝纖維化是肝臟細(xì)胞外基質(zhì)病理性蓄積的結(jié)果，是肝硬化的病理改變基礎(chǔ)，若能減少肝纖維化的沉積，就有助于逆轉(zhuǎn)肝硬化〔8〕。肝組織發(fā)生炎癥時(shí)常伴隨膠原纖維組織沉積，因此針對(duì)肝病進(jìn)行抗纖維化治療是非常有必要的。

相關(guān)研究表明，T-Bil、ALT、AST、GGT等可很敏感地反映肝臟損傷，而TP和Alb能反映肝細(xì)胞合成蛋白的能力〔9〕。HA是確定的血清肝纖維化指標(biāo)〔10〕；PⅢ主要在肝星狀細(xì)胞內(nèi)，能夠體現(xiàn)肝臟的纖維化程度；而LN與CⅣ共同參與基底膜的形成，在肝硬化中有著重要的意義〔11〕。肝纖維化過(guò)程中肝星狀細(xì)胞起著非常重要的作用，α-SMA是肝星狀細(xì)胞的特征性標(biāo)志物〔12〕；TIMPs可抑制MMPs降解細(xì)胞外基質(zhì)活性〔13〕；ICAM-1的表達(dá)是肝星狀細(xì)胞活化的生物學(xué)特性之一〔14〕。本研究結(jié)果說(shuō)明，鴉膽子油與依那普利聯(lián)合使用具有很好的改善肝纖維化作用。推測(cè)鴉膽子油與依那普利聯(lián)合用藥后，通過(guò)抑制其他細(xì)胞活化為 α-SMA 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞從而減少肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量來(lái)減少腎間質(zhì)纖維化;通過(guò)抑制 TIMPs從而降低ICAM-1和MMP-1，減少纖維化細(xì)胞；通過(guò)PⅢ、HA、LN、CⅣ、T-Bil、ALT、AST、GGT等指標(biāo)的降低來(lái)減輕肝臟的損傷程度，因此也驗(yàn)證了兩藥聯(lián)合用藥后對(duì)肝纖維化的減緩作用。

綜上所述，鴉膽子油與依那普利聯(lián)合應(yīng)用比單一使用鴉膽子油或依那普利能更好地改善大鼠的心肌纖維化。

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〔2016-05-17修回〕

(編輯 徐 杰)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81360074)；江西省科技廳社會(huì)發(fā)展領(lǐng)域項(xiàng)目(20141BBG70038)

郭武華(1968-)，男，醫(yī)學(xué)博士，教授，主要從事肝癌的分子生物治療研究。

謝正元(1976-)，男，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，主要從事肝臟病診療相關(guān)研究。

R57

A

1005-9202(2017)07-1565-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.002