川芎嗪抑制大鼠腦缺血再灌注損傷的機(jī)制

李鵬飛 沈梅紅 吳錦萍 張春兵

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210029)

·基礎(chǔ)研究·

川芎嗪抑制大鼠腦缺血再灌注損傷的機(jī)制

李鵬飛 沈梅紅1吳錦萍2張春兵2

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210029)

目的 探討川芎嗪(TMP)抑制腦缺血再灌注損傷(CIRI)的分子機(jī)制。方法 選擇清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠，采用改良的Zea Longa栓線法構(gòu)建大腦中動(dòng)脈梗塞(MCAO)模型，并將大鼠隨機(jī)分為三組(n=20)：假手術(shù)組、模型組、TMP治療組。假手術(shù)組大鼠不插入線栓，其余操作均同模型組；TMP治療組大鼠在被拔出線栓再灌注時(shí)，腹腔注射TMP 20 mg/kg。再灌注24 h后，各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，然后麻醉處死，取材檢測(cè)。干濕稱重法檢測(cè)大鼠腦組織含水量；2，3，5-三苯基氮化四氮唑(TTC)染色法檢測(cè)大鼠腦梗死面積，HE染色觀察腦組織形態(tài)；熒光定量PCR檢測(cè)大鼠梗死側(cè)腦皮層中miR-199a-5p、Bax、Bcl-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6 mRNA的表達(dá)水平；酶聯(lián)免疫法檢測(cè)大鼠血清中炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β和IL-6的含量；免疫組化法觀察大鼠梗死側(cè)腦皮質(zhì)核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB p65及磷酸化NF-κB p65(NF-κB p-p65)的表達(dá)。結(jié)果 TMP治療可顯著改善神經(jīng)缺陷評(píng)分(P<0.05)，降低腦組織含水量(P<0.05)，減少梗死體積(P<0.01)，減輕腦組織破壞。模型組miR-199a-5p、Bax、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，而Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。而TMP治療可顯著降低miR-199a-5p、Bax、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)水平(P<0.05)，增加Bcl-2 mRNA的表達(dá)(P<0.05)。與模型組比較，TMP治療組大鼠腦皮質(zhì)和血清中TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子含量均顯著降低(P<0.05)。IHC結(jié)果顯示，TMP治療組中NF-κB p-p65陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。結(jié)論 TMP可減輕CIRI，其機(jī)制可能為抑制miR-199a-5p的表達(dá)，減少凋亡，降低炎癥反應(yīng)，且可降低NF-κB的活化。

川芎嗪；腦缺血再灌注損傷；凋亡；炎癥

在腦缺血過程中，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的急劇缺乏以及氧供不足可導(dǎo)致神經(jīng)死亡。腦缺血后血流的恢復(fù)在某些情況下反而會(huì)導(dǎo)致進(jìn)一步的組織損傷和功能障礙，這種恢復(fù)血流灌注后的有害情況稱為腦缺血再灌注損傷(CIRI)〔1～3〕。我們前期綜述發(fā)現(xiàn)，中藥有效成分可以多層次地多靶向抑制CIRI〔4〕，其中，川芎被稱為血中之氣藥，具有活血行氣、消散淤血、祛風(fēng)止痛之功效，其主要活性成分為川芎嗪(TMP)，學(xué)名2，3，5，6-四甲基吡嗪。TMP在臨床上廣泛應(yīng)用于治療和預(yù)防缺血性心腦血管性疾病〔5〕。有研究表明，TMP具有多種藥學(xué)性能如抗炎、鈣拮抗、清除氧自由基及抗氧化損傷等〔6～8〕。微小核糖核酸(miRNA)表達(dá)紊亂是缺血性腦卒中(IS)發(fā)生發(fā)展的重要原因〔7〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)急性IS患者外周血血清中miRNAs的表達(dá)與健康人群有顯著差異，且這些miRNAs在CIRI中扮演重要的角色〔8〕。有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-199a-5p特異表達(dá)于神經(jīng)組織中〔9〕，并參與神經(jīng)再生、神經(jīng)突起、突觸可塑性等重要環(huán)節(jié)〔10〕。最新研究發(fā)現(xiàn)，TMP能改善脊髓損傷功能修復(fù)，降低神經(jīng)凋亡，主要是通過miRNA發(fā)揮作用〔11，12〕。本文將探討TMP減輕CIRI是否與miR-199a-5p有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 鹽酸川芎嗪注射液購自無錫市第七制藥廠；栓線購自北京沙東生物科技有限公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)購自美國Amresco公司；10%水合氯醛購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PrimescriptTM RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物公司；TRIzol購自上海Invitrogen公司；mRNA、miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒購自瑞士Roche公司；兔抗大鼠核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB p65、磷酸化NF-κB p-p65(NF-κB p-p65)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體購自美國Abcam公司；大鼠白細(xì)胞介素(IL)1-β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 選擇清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體重(280±20)g，由北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司〔許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001〕提供。所有大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境〔12 h/12 h晝夜節(jié)律、(22±2)℃室溫、50%～60%濕度、通風(fēng)良好〕，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，大鼠自由攝食與飲水。術(shù)前大鼠禁食12 h，可自由飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、TMP治療組。假手術(shù)組：大鼠所有操作與模型組大鼠一致，但是不用插入線栓。模型組：大鼠所有操作如下1.3所示，腦缺血2 h，再灌注24 h。TMP治療組：大鼠線栓拔出，再灌注時(shí)腹腔注射TMP 20 mg/kg。

1.3 大鼠局灶性CIRI模型的建立 采用Zea Longa改良栓線法〔13〕。 SD大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g體重)腹腔注射麻醉，仰臥固定。頸部正中切開皮膚，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，仔細(xì)分離避免損傷迷走神經(jīng)。由頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎頸外動(dòng)脈，用微型動(dòng)脈夾夾住頸總動(dòng)脈近心端及頸內(nèi)動(dòng)脈，在靠近頸總動(dòng)脈分叉處用眼科剪在頸外動(dòng)脈上剪一小口，將直徑0.23～0.26 mm釣魚線用線香燒成小球的一端沿小切口插入頸外動(dòng)脈，剪斷頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，將頸外動(dòng)脈反向拉直，使其與頸內(nèi)動(dòng)脈處于同一直線上，移去頸內(nèi)動(dòng)脈的動(dòng)脈夾，經(jīng)頸總動(dòng)脈分叉處將魚線緩慢向頸內(nèi)動(dòng)脈入顱腦內(nèi)的方向推進(jìn)約(18±0.5)mm，微遇阻力時(shí)停止，使魚線頭端到達(dá)較細(xì)的大腦中動(dòng)脈起始處?？`緊預(yù)先放置于穿刺小切口處的絲線，縫合，消毒，缺血2 h后拔出栓線，建立CIRI模型。假手術(shù)組大鼠只分離暴露頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈。所有大鼠在術(shù)前禁食12 h，自由飲水。

1.4 神經(jīng)功能缺陷評(píng)分 使用Zea Longa五分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(1989年)〔13〕，在大鼠拔出線栓后初步判斷模型是否成功。對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：0分，正常，無神經(jīng)學(xué)征象；1分，出現(xiàn)Honer征；2分，拎起大鼠尾巴時(shí)大鼠左前肢不能伸展；3分，一側(cè)肢體不完全癱瘓，大鼠向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；4分，一側(cè)肢體完全癱瘓，大鼠向左側(cè)傾倒；5分，死亡。其中神經(jīng)功能評(píng)分≥2分者納入實(shí)驗(yàn)組，評(píng)分為0分或是5分者剔除。

1.5 大鼠腦梗死面積計(jì)算 各組大鼠(n=5)經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉后迅速斷頭取腦，去除嗅球、小腦等其他組織。取出腦組織后，置于-20℃冰凍15 min。將大腦沿冠狀面切成5等份腦片，置于2%的TTC生理鹽水溶液中37℃避光孵育30 min，10%甲醛中性緩沖液(pH7.4)固定過夜。TTC染色后，正常腦組織呈玫紅色，梗死組織呈白色。使用微距相機(jī)拍攝，Image J圖像分析軟件計(jì)算并統(tǒng)計(jì)各組大鼠腦梗死面積百分比。計(jì)算公式：腦梗死面積百分比=梗死灶面積/全腦面積×100%。

1.6 大鼠腦含水量測(cè)定 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物再灌注24 h后，每組各取5只斷頭取腦，濾紙吸盡表面血漬后銳性刀片分離左右半球，將損傷側(cè)半球的腦組織用電子分析天平稱其濕重后置于106℃恒溫干燥箱內(nèi)持續(xù)干燥24 h后稱其干重，腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.7 蘇木素-伊紅(HE)染色檢查腦組織病理學(xué)改變 每組大鼠(n=5)經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉后，迅速經(jīng)左心室依次使用0.9%氯化鈉鹽溶液250 ml和250 ml 4%多聚甲醛溶液灌注固定到大鼠身體發(fā)僵后，迅速斷頭取出腦組織標(biāo)本。腦組織標(biāo)本保存于4℃的10%中性甲醛溶液中。24 h后依次經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋，由切片機(jī)連續(xù)切取6 μm的冠狀腦組織切片，后經(jīng)過脫蠟、HE染色等步驟后，置于Olympus BX50生物光學(xué)顯微鏡(×400)下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察形態(tài)學(xué)變化。

1.8 免疫組織化學(xué)染色檢查腦皮質(zhì)NF-κB p65、NF-κB p-p65的表達(dá) 將包埋好的石蠟塊置于石蠟切片機(jī)，將蠟塊由前向后作大腦冠狀切片，每片厚5 μm，收集腦片。選擇完好腦片貼于已涂有多聚賴氨酸的載玻片上，晾干使腦片緊貼，以防脫片。每只動(dòng)物取1張腦切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，按免疫組化測(cè)試盒操作說明進(jìn)行操作。光學(xué)顯微鏡觀察大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)，并用Olympus顯微圖像獲取系統(tǒng)400×拍攝圖像。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)不同視野，計(jì)算5個(gè)視野中總的陽性細(xì)胞數(shù)，即為該動(dòng)物的陽性細(xì)胞數(shù)。采用南京大學(xué)捷達(dá)軟件公司圖像分析系統(tǒng)測(cè)定視野中陽性細(xì)胞的平均灰度、平均光密度，計(jì)算積分光密度值(IOD)，以評(píng)估陽性細(xì)胞中的蛋白含量變化。

1.9 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Bax、Bcl-2、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA以及miR-199a-5p的表達(dá) 大鼠在10%水合氯醛麻醉下，快速斷頭取腦，迅速浸于冰磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗去表面血液。將取出的大腦置于濾紙上(濾紙置于冰上)，用手術(shù)剪取腦皮質(zhì)層裝入eppendorf管，立即置于液氮。采用Trizol法提取各組總RNA，使用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定RNA濃度并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總RNA的完整性后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

mRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20 μl)：5×PrimescriptTM緩沖液4 μl，PrimescriptTM RT Enzyme Mix I 1 μl，Oligo dT Primer 1 μl，Random 6 mers 4 μl，總RNA RNase Free H2O 10 μl。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。使用Roche公司熒光定量檢測(cè)試劑盒，按照試劑說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。 PCR反應(yīng)體系(20 μl)：2×熒光定量探針法反應(yīng)預(yù)混液 10 μl，20×探針和擴(kuò)增引物預(yù)混液1 μl，模板cDNA 1 μl，RNase Free H2O 8 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火、延伸1 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；在退火、延伸步驟中采集熒光信號(hào)。β-actin作為內(nèi)參。

MiR-199a-5p的逆轉(zhuǎn)錄條件(20 μl體系)：5×PrimescriptTM緩沖液4 μl，PrimescriptTM RT Enzyme Mix 1 μl，miRNA RT Primer 1 μl，RNase Free H2O和總RNA 14 μl；反應(yīng)條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。使用Roche公司熒光定量檢測(cè)試劑盒，按照試劑說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。PCR反應(yīng)體系(20 μl)：2×熒光定量探針法反應(yīng)預(yù)混液10 μl，20×探針和擴(kuò)增引物預(yù)混液1 μl，模板cDNA 1 μl，RNase Free H2O 8 μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火、延伸1 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。在退火、延伸步驟中采集熒光信號(hào)，U6 snRNA作為內(nèi)參，所有結(jié)果重復(fù)三次。結(jié)果分析用十二烷基硫酸鈉(SDS)software version 2.0，分析條件設(shè)置：根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值，在analysis菜單下選擇analyze自動(dòng)分析結(jié)果。采用相對(duì)定量法(2-ΔΔCT)計(jì)算各目的分子的相對(duì)表達(dá)量。

1.10 ELISA檢測(cè)炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量 各組大鼠再灌注24 h后，各取5只迅速斷頭取腦，留取血液，室溫下放置2 h后，3 000 r/min離心20 min，去上清，-80℃保存。血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量的測(cè)定按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 5.0軟件，組間比較用單因素方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 TMP對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響 模型大鼠24 h再灌注后，其神經(jīng)功能缺陷評(píng)分明顯增加(3.00±0.89，假手術(shù)組為1.00±0.00，P<0.001)；TMP治療后，可以顯著改善模型大鼠神經(jīng)功能(1.83±0.75,P<0.05)。

2.2 TMP對(duì)大鼠腦梗死體積的影響 與模型組腦梗死體積〔(35.50±1.68)%〕比較，TMP治療組腦梗死體積〔(26.04±1.36)%〕顯著下降25.61%(P<0.01)。

2.3 TMP對(duì)大鼠腦組織含水量的影響 腦組織含水量分別為：假手術(shù)組(79.24±0.419)%、模型組(82.25±1.640)%、TMP治療組(80.30±1.286)%。與假手術(shù)組相比，模型組腦組織含水量顯著升高(P<0.01)，而經(jīng)TMP治療后大鼠腦組織含水量顯著改善(P<0.05)。

2.4 TMP對(duì)大鼠腦組織形態(tài)的影響 腦組織HE染色結(jié)果顯示：神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)染色呈淡紅色，胞核染色呈紫藍(lán)色。假手術(shù)組大鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，可見神經(jīng)錐體細(xì)胞數(shù)量多，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核大而圓，未見病理性損傷。模型組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞縮小變形，細(xì)胞核固縮深染，核固縮呈三角形或不規(guī)則形狀，部分胞核和胞質(zhì)界限不清；神經(jīng)組織間質(zhì)水腫明顯，組織結(jié)構(gòu)被破壞疏松呈網(wǎng)狀，染色淺淡，甚至在部分紅染區(qū)域僅見到無明顯結(jié)構(gòu)的壞死組織。TMP治療組腦組織破壞情況得到了改善，僅可見少量不同程度被破壞的神經(jīng)細(xì)胞。見圖1。

圖1 各組大鼠腦皮質(zhì)HE染色結(jié)果(×400)

2.5 TMP對(duì)大鼠腦皮質(zhì)miR-199a-5p的影響 與假手術(shù)組(0.98±0.15)相比，模型組中miR-199a-5p的表達(dá)(2.32±0.55)顯著上調(diào)(P<0.001)，TMP治療組miR-199a-5p表達(dá)(1.67±0.41)顯著下調(diào)(P<0.05)。

2.6 TMP對(duì)大鼠腦皮質(zhì)Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 與假手術(shù)組(Bax:0.95±0.19，Bcl-2:0.95±0.21)比較，模型組腦皮質(zhì)中Bax RNA表達(dá)(2.95±0.62)上調(diào)，Bcl-2 mRNA表達(dá)(0.50±0.14)明顯下降(P<0.01)；TMP治療后，Bax mRNA表達(dá)(1.88±0.32)得到顯著抑制(P<0.01)，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平(1.63±0.30)明顯上升(P<0.001)。

2.7 TMP對(duì)大鼠腦組織和外周血TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組(分別為1.05±0.20，0.80±0.26，0.94±0.05)比較，模型組TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)(2.95±0.18，2.38±1.03，3.20±1.28)顯著升高(P<0.01，P<0.05)；TMP治療后，TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)(0.95±0.19，0.64±0.19，0.54±0.17)均顯著降低(P<0.01，P<0.05)。

ELISA結(jié)果表明，模型組大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)含量〔(52.00±19.09)、(152.70±58.36)、(105.60±10.36)pg/ml〕比假手術(shù)組〔(23.00±6.60)、(61.48±7.96)、(66.00±3.11)pg/ml〕顯著升高(均P<0.01)；與模型組相比，TMP治療組各因子的表達(dá)含量〔(29.60±7.27)、(62.93±11.74)、(79.00±5.14)pg/ml〕均顯著降低(P<0.05)。

2.8 TMP對(duì)大鼠腦組織中NF-κB p65、NF-κB p-p65的影響 免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，在模型組大鼠腦皮質(zhì)中可明顯觀察到NF-κB p65及NF-κB p-p65陽性細(xì)胞。與假手術(shù)組(38.00±1.47,28.00±2.25)相比，模型組大鼠腦皮質(zhì)中NF-κB p65(53.00±2.48)及NF-κB p-p65(56.25±3.12)表達(dá)明顯升高(P<0.01，P<0.001)；TMP治療后，NF-κB p65及NF-κB p-p65表達(dá)(47.25±2.78、42.00±3.49)顯著降低(P<0.05)。見圖2，圖3。

圖2 各組大鼠腦皮質(zhì)中NF-κB p65的表達(dá)(IHC法，×400)

圖3 各組大鼠腦皮質(zhì)中NF-κB p-p65的表達(dá)(IHC法，×400)

3 討 論

腦缺血再灌注24 h后，可出現(xiàn)明顯腦水腫、大面積梗死灶，神經(jīng)元發(fā)生大片壞死、凋亡，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重。本文發(fā)現(xiàn)TMP能夠顯著改善腦水腫、減少腦梗死面積以及改善神經(jīng)組織的損傷，充分表明TMP具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。IS引起一系列細(xì)胞和分子事件級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括神經(jīng)興奮性毒性、鈣離子超載、氧化應(yīng)激以及神經(jīng)炎癥〔14〕。多種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)可以證實(shí)TMP能阻斷多個(gè)損傷級(jí)聯(lián)事件，提供神經(jīng)保護(hù)作用〔15〕。凋亡與CIRI密切相關(guān)，抑制凋亡可以減輕缺血腦損傷，對(duì)腦組織具有保護(hù)作用。Kao等〔4〕發(fā)現(xiàn)，TMP能抑制腦缺血誘導(dǎo)的凋亡。Chang等〔16〕報(bào)道TMP可抑制MCAO誘導(dǎo)的Caspase3活化及細(xì)胞凋亡，從而降低梗死面積。同時(shí)，有文獻(xiàn)證實(shí)，在兔子脊髓缺血模型中，TMP可以通過增加Bcl-2和降低Bax的表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用〔17〕。我們團(tuán)隊(duì)前期體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TMP也可有效調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase9的表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔18,19〕。本文通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察到TMP可改善神經(jīng)組織損害情況，降低Bax和上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，證實(shí)TMP可以降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡。炎癥反應(yīng)是腦缺血后腦損傷的主要原因之一，控制缺血后炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)顯得尤為重要。促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6是CIRI早期分泌釋放的細(xì)胞因子，它們表達(dá)上調(diào)是腦缺血后炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的始動(dòng)因素。Wu等〔20〕發(fā)現(xiàn)，TMP能下調(diào)TNF-α及細(xì)胞間黏附分子-1的表達(dá)，從而降低炎性反應(yīng)。Liao等〔21〕發(fā)現(xiàn)，TMP通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及其他炎癥細(xì)胞的活化、遷移及聚集，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔16〕。Chang等〔16〕發(fā)現(xiàn)TMP抑制TNF-α的表達(dá)，對(duì)神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用。本文研究也發(fā)現(xiàn)TMP可以降低腦缺血再灌注過程中炎癥反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。炎癥反應(yīng)的發(fā)生主要以NF-κB信號(hào)通路為核心和關(guān)鍵。NF-κB參與腦缺血再灌注導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡、壞死、功能下降等病程的發(fā)生發(fā)展，能促發(fā)各種炎性反應(yīng)介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄激活〔22〕。在大鼠局灶性腦缺血模型中，缺血組織中NF-κB表達(dá)增強(qiáng)〔23〕，啟動(dòng)IL-1、IL-6和TNF-α等炎性因子的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)白細(xì)胞黏附、滲出與聚集。這些炎性因子又可作為NF-κB的激活劑，反過來激活NF-κB〔24〕。本研究結(jié)果表明腦缺血再灌注后NF-κB被激活，TMP可以抑制NF-κB 活化，降低炎癥級(jí)聯(lián)損傷，減輕CIRI。miRNAs與IS病理生理過程關(guān)系緊密，我們前期研究發(fā)現(xiàn)急性IS患者血清中存在差異的miRNAs，這些miRNAs在CIRI中發(fā)揮重要的角色〔7,25,26〕，其中表達(dá)變化較顯著的miR-199a-5p引起極大關(guān)注。 據(jù)報(bào)道，miR-199a-5p參與多種細(xì)胞進(jìn)程，包括細(xì)胞分化和增殖、腫瘤發(fā)生、血管生成和自噬〔27～30〕等。尤為重要的是，miR-199a-5p調(diào)控多種細(xì)胞的凋亡和存活〔10,31,32〕。而且，miR-199a-5p主要表達(dá)在海馬組織中，可促進(jìn)癲癇中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。也有研究者認(rèn)為，miR-199a-5p可參與免疫應(yīng)答〔33,34〕。本文發(fā)現(xiàn)MCAO大鼠腦皮質(zhì)中miR-199a-5p高表達(dá)，而且，TMP治療后可以降低miR-199a-5p的表達(dá)水平。推測(cè)TMP可能通過抑制miR-199a-5p的表達(dá)、降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及炎癥的產(chǎn)生，從而減輕CIRI。

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〔2016-05-11修回〕

(編輯 徐 杰)

Tetramethylpyrazine inhibits cerebral ischemia/reperfusion injury in rats by modulation of miR-199a-5p,apoptosis,and inflammation

LI Peng-Fei,SHEN Mei-Hong,WU Jin-Ping,etal.

Department of Clinical Laboratory,Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,Jiangsu,China

Objective To observe the inhibitory effects of tetramethylpyrazine (TMP) on cerebral ischemia and reperfusion injury (CIRI) and further explore the underling molecular mechanisms.Methods Health adult male Sprague-Dawley(SD) rats were subjected to transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO),and assigned into sham,model and TMP groups(n=20).TMP was administered via intraperitoneal injection (20 mg/kg) at the beginning of reperfusion after 2 h ischemia.After 24 h MCAO,the neurological function scores were evaluated.HE staining was used to evaluate the cerebral tissue morphology.qRT-polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the expressions of miR-199a-5p,Bax,Bcl-2,TNF-α,IL-1β,and IL-6 mRNA in infarction cortex.Furthermore,enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the content of TNF-α,IL-6,IL-1β in rats′ peripheral blood.Animals were euthanized for immunohistochemical labeling to measure NF-κB p65 and NF-κB p-p65 levels in the infarction area.Results TMP significantly improved neurological function at 24 h after ischemia(P<0.05),decreased brain water content(P<0.05),reduced cerebral infarction volume(P<0.01).The damage of nerve cells in TMP group was improved significantly.The expressions of miR-199a-5p,Bax,TNF-α,IL-1β,and IL-6 mRNA were significantly increased in the brain of MCAO rats and Bcl-2 mRNA was markedly decreased.However,TMP markedly decreased the expressions of miR-199a-5p,Bax,TNF-α,IL-1β,and IL-6 mRNA and increased the expression of Bcl-2 mRNA in cortex.TMP also significantly reduced TNF-α,IL-1β,and IL-6 contents in serum of rats.In addition,IHC showed that TMP significantly decreased the expression of NF-κB p-p65(P<0.05).Conclusions The neuroprotective effect of TMP may be mediated at least by a portion of the inhibition of miR-199a-5p,followed by the inhibition of apoptosis,the reduction of proinflammatory cytokines,decrease the activation of NF-κB.

Tetramethylpyrazine;Cerebral ischemia and reperfusion injury;Apoptosis;Inflammation

國家自然科學(xué)基金資助課題(81403136,81373748,81171659,11574156)

1 南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院 2 南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

張春兵(1969-)，男，副教授，主任技師，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥治療腦卒中的分子機(jī)制研究。

李鵬飛(1984-)，男，博士，主要從事腦卒中的分子診斷與治療基礎(chǔ)研究。

R743.31

A

1005-9202(2017)07-1561-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.001