NTS/IL-8通路對肝細胞肝癌侵襲 遷移和EMT的影響*

張麗杰龍欣欣肖培葉英楠劉芃芃于津浦

NTS/IL-8通路對肝細胞肝癌侵襲 遷移和EMT的影響*

張麗杰①龍欣欣①肖培①葉英楠②劉芃芃②于津浦①②

目的：探討神經(jīng)降壓素（neurotensin，NTS）對肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）細胞合成和分泌白細胞介素8（in?terleukin-8，IL-8）的影響及NTS/IL-8通路活化對HCC侵襲、遷移和上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的作用。方法：通過慢病毒基因轉染構建神經(jīng)降壓素受體1（neurotensin receptor1，NTR1）高表達的HCC細胞系Hep3BNTR1hi，利用小干擾RNA構建NTR1低表達HCC細胞系HepG2NTR1-。通過實時熒光定量PCR（RT-qPCR）和酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）實驗檢測外源性NTS刺激前后HCC細胞IL-8分泌量的變化；利用劃痕修復實驗和Transwell實驗觀察阻斷IL-8受體后HCC細胞侵襲遷移能力的變化；采用Western blot比較阻斷IL-8受體后HCC細胞EMT相關蛋白的表達變化。結果：外源性NTS刺激和高表達NTR1可促進Hep3B和HepG2細胞合成和分泌IL-8（P均＜0.01），阻斷或降低NTR1表達后IL-8的表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。外源性NTS刺激和高表達NTR1可提高HCC細胞的侵襲和遷移能力（P均＜0.05），阻斷IL-8受體，即阻斷NTS/IL-8信號下傳，HCC細胞的劃痕修復率和侵襲細胞數(shù)均降低（P均＜0.001），同時伴有E-cadherin表達增加，N-cadherin、β-catenin表達降低。結論：外源性NTS刺激和高表達NTR1可以刺激HCC細胞合成和分泌IL-8，阻斷NTS/IL-8信號下傳會降低肝癌細胞EMT和侵襲遷移能力。

神經(jīng)降壓素 白細胞介素-8 肝細胞肝癌 上皮間質轉化

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是目前較為常見的惡性腫瘤之一，現(xiàn)已成為導致腫瘤相關性死亡的第二大病因［1］。盡管隨著手術切除和介入治療水平的不斷提高，早期HCC患者的預后有所改善，但總體上HCC的復發(fā)和轉移率仍居高不下。因此深入研究該過程中的關鍵因素及分子機制，有助于尋找更高效的治療手段以改善HCC預后。

近年來，越來越多的研究證實上皮間質轉化（ep?ithelial-mesenchymal transition，EMT）在HCC的發(fā)生、發(fā)展，尤其是腫瘤侵襲轉移中發(fā)揮不可忽視的調節(jié)作用［2-3］。在EMT過程中，HCC細胞失去原有的上皮特征而獲得間質細胞相關特征，進而導致腫瘤細胞侵襲及轉移的增加［4］。本研究前期發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)降壓素（neurotensin，NTS）可促進HCC細胞的侵襲、遷移和EMT，但詳細的分子機制尚不明確［5］。NTS與其高親和力受體神經(jīng)降壓素受體1（neurotensin receptor 1，NTR1）結合，可活化NF-κB途徑、ERK途徑和PKC途徑而促進IL-8的釋放，從而引起局部炎癥反應，這一過程被稱為NTS/IL-8通路［6］。有研究已證實NTS/ IL-8通路介導的炎癥反應在結腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［7］。因此，推測HCC細胞中NTS/IL-8通路可能通過促進EMT而促進腫瘤侵襲和轉移，從而影響肝癌患者預后。本研究中將著重探討NTS對HCC細胞中IL-8合成和分泌的影響及NTS/IL-8通路活化對HCC侵襲、遷移和EMT的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人肝癌細胞株Hep3B、HepG2由本課題組保存，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。本課題組前期實驗中對HCC的5種常見細胞系（MHCC97H、MHCC97L、Hep3B、7721和HepG2）的NTS及NTR1表達水平進行了相關檢測，結果顯示Hep3B中NTS表達水平高而NTR1水平較低；而HepG2細胞系中NTS水平稍低而NTR1水平高。因此選取這兩種細胞系，通過慢病毒基因轉染獲得NTR1穩(wěn)定高表達的Hep3BNTR1hi，利用小干擾RNA獲得NTR1敲減的HepG2NTR1-細胞系［5］。本研究獲天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院倫理委員會審查批準。

1.1.2 實驗試劑 人IL-8包被的ELISA Kit（達科為公司）。兔抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、β-連接素（βcatenin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）單克隆抗體以及羊抗兔二抗（美國ABcam公司）。NTS（美國Phoenix Pharmaceuticals公司）。Reparixin（IL-8受體CXCR1/2的抑制劑）、SR48692（NTS受體NTR1的拮抗劑）購自美國Sigma公司。細胞培養(yǎng)液DMEM（美國Hyclone公司）。胎牛血清（中國賽默飛公司）。Matrigel基質膠、Transwell培養(yǎng)板（美國BD公司）。

1.2.1 實時熒光定量 PCR 分別將 Hep3Bwt、Hep3BNTR1hi、HepG2wt和HepG2NTR1-細胞以6×105個/孔接種于6孔板中，共分3個處理組：NTS處理組給予1μg/mL的NTS刺激；NTR1阻斷組給予10 nmol/mL的SR48692抑制NTR1；NTS刺激和NTR1阻斷共同處理組給予1 μg/mL的NTS和10 nmol/mL的SR48692處理，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。將上述不同處理的細胞用Trizol試劑提取總RNA，以此為模板行逆轉錄得總cDNA。采用實時熒光定量PCR（RT-qP?CR）法檢測IL-8及內(nèi)參β-actin的mRNA表達。

1.2.2 ELISA實驗 收集上述不同處理組細胞的培養(yǎng)上清，按照酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒的操作說明，檢測不同處理組細胞的培養(yǎng)上清中IL-8的表達。

1.2.3 劃痕修復實驗 將Hep3Bwt、Hep3BNTR1hi和HepG2wt細胞以6×105個/孔接種于6孔板中，分別進行以下處理：NTS刺激組給予1 μg/mL的NTS刺激；IL-8受體阻斷組給予0.2 nmol/mL的Reparixin阻斷IL-8受體（CXCR1/2）的表達；IL-8受體阻斷及NTS刺激組給予1 μg/mL的NTS和0.2 nmol/mL的Reparixin共同處理，過夜培養(yǎng)。至細胞融合率達80%，用20 μL槍頭進行劃痕，之后用PBS洗去劃下細胞，換無血清培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每12 h取樣，拍照。

1.2.4 Transwell侵襲實驗 將20～25 μL Matrigel基質膠（1 mg/mL）鋪于Transwell小室底部，在Transwell下室加入含10%FBS培養(yǎng)基500 μL/孔，將Hep3Bwt、Hep3BNTR1hi和HepG2wt細胞以2×104個/孔接種于上室，分別進行以下處理：NTS刺激組給予1 μg/mL的NTS刺激；IL-8受體阻斷組給予0.2 nmol/mL的Reparixin處理；IL-8受體阻斷及NTS刺激組同時給予1 μg/mL的NTS和0.2 nmol/mL的Reparixin處理，去血清培養(yǎng)48 h。95%乙醇固定30 min。結晶紫染色20 min，于倒置顯微鏡下觀察穿過膜的細胞，計數(shù)。

1.2.5 Western blot檢測 以6×105個/孔將Hep3Bwt、Hep3BNTR1hi和HepG2wt細胞接種于6孔板中，NTS刺激組給予1 μg/mL的NTS刺激；IL-8受體阻斷組給予0.2 nmol/mL的Reparixin處理；IL-8受體阻斷及NTS刺激組同時給予1 μg/mL的NTS和0.2 nmol/mL的Reparixin處理，過夜培養(yǎng)。RIPA蛋白裂解液裂解細胞，提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度。配制10%分離膠和5%濃縮膠，取30 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉至PVDF膜上。5%BSA封閉1 h后，抗E-cadherin、β-catenin、N-cadherin（1:1 000）及抗內(nèi)參β-actin（1:2 000）抗體4℃孵育過夜。TBST漂洗后，辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1:4 000）室溫孵育1 h，TBST漂洗后，ECL顯色曝光檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，計數(shù)資料用±s表示，計量資料的比較用χ2檢驗，計數(shù)資料的比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 外源性NTS和高表達NTR1對HCC細胞IL-8 mRNA表達的影響

采光頂鋼結構周邊為規(guī)則的弧形，內(nèi)環(huán)也為規(guī)則的相近的弧形，凸起的內(nèi)環(huán)靠下面的內(nèi)環(huán)進行支撐。整個采光頂線條簡明，造型新穎。

RT-qPCR結果表明，Hep3BNTR1hi細胞中IL-8的相對表達量為Hep3Bwt細胞的（5.36±1.17）倍（P＜0.01，圖1A）。NTS刺激組的Hep3Bwt細胞IL-8的相對表達量為對照組的（2.89±1.18）倍（P＜0.01，圖1A），且NTS刺激組的Hep3BNTR1hi細胞IL-8的相對表達量為對照組的（4.89±1.38）倍（P＜0.01，圖1A）。

在HepG2細胞系中，HepG2NTR1-細胞中IL-8的相對表達量較HepG2wt細胞明顯降低［（0.49±0.05）vs.（1.03±0.09），P＜0.05，圖1B］。NTS刺激組的HepG2wt細胞較對照組IL-8的mRNA表達顯著升高［（2.30± 0.22）vs.（1.03±0.09），P＜0.01，圖1B］；并且NTS刺激組的HepG2NTR1-細胞中IL-8的表達為對照組的（1.58± 0.23）倍（P＜0.05，圖1B）。

圖1 外源性NTS對不同NTR1表達水平的HCC細胞系中IL-8（mRNA）表達的影響（RT-qPCR）；*P＜0.05，**P＜0.01Figure 1 Effect of exogenous NTS stimulation on IL-8 mRNA expression in HCC lines with different levels of NTR1(RT-qPCR)

2.2 外源性NTS和高表達NTR1對HCC細胞培養(yǎng)上清中IL-8分泌的影響

ELISA結果顯示，Hep3Bwt細胞在NTS刺激前后，幾乎不分泌IL-8；而Hep3BNTR1hi細胞較Hep3Bwt細胞IL-8分泌明顯提高［（25.06±7.46）pg/mL vs.（0.56± 0.06）pg/mL，P=0.030，圖2A］；并且NTS刺激組的Hep3BNTR1hi細胞和對照組相比，其IL-8分泌也顯著升高［（162.40±22.88）pg/mL vs.（25.06±7.46）pg/mL，P= 0.005，圖2A］。采用NTR1阻斷劑SR48692阻斷NTR1表達，觀察到SR48692處理的Hep3BNTR1hi細胞較對照組IL-8分泌顯著降低［（0.63±0.08）pg/mL vs.（25.06±7.46）pg/mL，P=0.031，圖 2A］；且NTS和SR48692同時處理的Hep3BNTR1hi細胞的IL-8分泌較僅NTS刺激組明顯降低［（3.00±1.16）pg/mL vs.（162.40±22.88）pg/mL，P=0.002，圖2A］。

對于HepG2細胞系，敲減型HepG2NTR1-細胞與野生型HepG2wt細胞相比，降低NTR1表達量后，IL-8分泌顯著降低［（173.30±12.02）pg/mL vs.（410.02±0.82）pg/mL，P=0.001，圖2B］。NTS刺激組的HepG2wt較對照組IL-8的分泌明顯上升［（666.70±8.82）pg/mL vs.（410.02±0.82）pg/mL，P=0.001，圖2B］；且NTS刺激的HepG2NTR1-細胞較對照組IL-8分泌也有所增加［（216.70±8.82）pg/mL vs.（173.30±12.02）pg/mL，P= 0.043，圖2B］。同樣地，采用NTR1阻斷劑SR48692阻斷NTR1表達，結果表明SR48692處理后，HepG2wt細胞IL-8分泌明顯降低［（41.67±4.41）pg/mL vs.（410.00±0.82）pg/mL，P=0.002，圖2B］；并且NTS刺激的Hep3Bwt細胞IL-8分泌較SR48692處理前也明顯降低［（78.33±4.41）pg/mL vs.（666.70±8.82）pg/mL，P= 0.005，圖2B］。與此一致的是，SR48692處理后，HepG2NTR1-細胞較對照組IL-8分泌明顯降低［（3.67± 0.88）pg/mL vs.（173.3±12.02）pg/mL，P=0.001，圖2B］；且NTS刺激的HepG2NTR1-細胞IL-8分泌較SR48692處理前也顯著降低［（11.33±1.86）pg/mL vs.（216.70± 8.82）pg/mL，P=0.003，圖2B］。

2.3 阻斷IL-8受體對NTS誘導的HCC細胞侵襲、遷移的影響

劃痕修復實驗結果顯示Hep3BNTR1hi細胞的24 h劃痕修復率和48 h劃痕修復率較Hep3Bwt細胞均明顯升高［（39.33±2.60）%vs.（28.00±1.53）%，P=0.020；（64.32± 2.08）%vs.（40.00±2.89）%，P=0.003，圖3A］；NTS刺激的Hep3BNTR1hi細胞的24 h和48 h劃痕修復率均高于對照組［（55.01±2.89）%vs.（39.33±2.60）%，P=0.016；（91.33± 1.86）%vs.（64.32±2.08）%，P＜0.001，圖3A］。同時，IL-8受體阻斷劑Reparixin處理的Hep3BNTR1hi細胞與對照組細胞相比，其24 h和48 h劃痕修復率均明顯下降［（21.00±2.08）%vs.（39.33±2.60）%，P＜0.001；（30.67±1.20）%vs.（64.32±2.08）%，P＜0.001，圖3A］。同樣，NTS刺激的Hep3BNTR1hi細胞在Reparixin處理24 h和48 h后，劃痕修復率較對照組對照組細胞也顯著下降［（27.07±1.73）% vs.（55.01±2.89）%，P＜0.001；（45.07±2.89）%vs.（91.33± 1.86）%，P＜0.001，圖3A］，這些結果表明外源性NTS和高表達NTR1提高了Hep3B細胞的遷移能力，而阻斷IL-8受體，即阻斷NTS/IL-8信號下傳，抑制了Hep3B細胞的遷移。

同樣地，NTS刺激的HepG2wt細胞的24 h和48 h劃痕修復率較對照組明顯增加［（58.01±4.85）%vs.（37.67± 1.45）%，P=0.012；（94.03±2.33）%vs.（61.02±1.98）%，P＜0.001，圖3B］；而Reparixin處理組的HepG2wt細胞的24 h和48 h劃痕修復率較對照組明顯降低［（21.33±1.86）% vs.（37.67±1.45）%，P＜0.001；（34.67±2.60）%vs.（61.02± 1.98）%，P＜0.001，圖3B］；且NTS刺激的HepG2wt細胞在Reparixin處理24 h和48 h后，其劃痕修復率較對照組細胞也顯著下降［（35.07±2.89）%vs.（58.01±4.85）%，P= 0.021；（51.07±2.08）%vs.（94.03±2.33）%，P＜0.001，圖3B］，這進一步證實NTS激活的IL-8信號的活化促進了HepG2細胞的遷移，而阻斷IL-8受體，明顯降低了HepG2細胞的遷移能力。

與劃痕試驗相對應的是，Transwell侵襲實驗計數(shù)結果顯示Hep3BNTR1hi細胞的侵襲細胞數(shù)較Hep3Bwt細胞明顯增加［（92.00±4.13）vs.（53.33±4.41），P=0.003，圖3C］；NTS處理的Hep3BNTR1hi細胞在侵襲細胞數(shù)目上較對照組也明顯增加［（170.00±5.78）vs.（92.00± 4.13），P＜0.001，圖3C］。并且，Transwell侵襲實驗的結果也表明，Reparixin處理的Hep3BNTR1hi細胞的侵襲細胞數(shù)較Reparixin未處理組顯著減少［（55.01±3.21）vs.（92.00±4.13），P=0.002，圖3C］。NTS和Reparixin共同處理的Hep3BNTR1hi細胞的侵襲細胞數(shù)較僅NTS處理組也顯著下降［（75.00±2.87）vs.（170.00±5.78），P=0.001，圖3C］。同樣地，NTS處理的HepG2wt細胞的侵襲細胞數(shù)較對照組明顯增加［（166.70±5.74）vs.（100.00±5.74），P＜0.001，圖3C］，而Reparixin處理組及NTS和Reparixin共同處理組的HepG2wt與對照組相比，其侵襲細胞數(shù)均顯著減少［（50.01±2.87）vs.（100.00±5.74），P=0.001；（90.00±5.74）vs.（166.70± 5.74），P=0.002，圖3D］。以上結果表明NTS刺激的IL-8信號的活化提高了HCC細胞的侵襲能力，而阻斷IL-8受體，即阻斷NTS/IL-8信號下傳，則明顯降低了HCC細胞的侵襲性。

2.4 阻斷IL-8受體對NTS誘導的HCC細胞EMT的影響

Western blot結果顯示，Hep3BNTR1hi細胞的EMT相關蛋白表達較Hep3Bwt細胞發(fā)生顯著變化，其中E-cadherin表達明顯降低，而N-cadherin、β-catenin表達均升高；NTS處理的Hep3Bwt、Hep3BNTR1hi細胞與對照組相比，E-cadherin表達也降低，N-cadherin、βcatenin表達也明顯升高。同時，Western blot結果也表明NTS和Reparixin共同處理組的Hep3BNTR1hi細胞與僅NTS處理組相比，EMT相關蛋白的表達也發(fā)生明顯改變，其中E-cadherin的表達較對照組細胞明顯升高，而N-cadherin、β-catenin表達均降低（圖4）。

同樣地，Western blot結果顯示NTS處理的HepG2wt細胞與對照組相比，E-cadherin的表達明顯降低，而N-cadherin、β-catenin表達均升高；然而，NTS和Reparixin共同處理的HepG2wt細胞與僅NTS處理組相比，EMT進程被逆轉，其中上皮標志物E-cad?herin的表達明顯上調，而N-cadherin、β-catenin表達均顯著降低（圖4）。

圖2 外源性NTS對不同NTR1表達水平的HCC細胞培養(yǎng)上清中IL-8表達的影響（ELISA）；*P＜0.05，**P＜0.01Figure 2 Effect of exogenous NTS stimulation on IL-8 expression in HCC cell supernatants with different levels of NTR1(ELISA)

綜上所述，外源性NTS和高表達NTR1可促進HCC細胞中IL-8的合成和分泌，并且NTS/IL-8信號的激活可促進HCC細胞發(fā)生EMT，提高HCC細胞的侵襲性，而抑制NTS/IL-8信號下傳，則逆轉了HCC細胞的EMT，進而抑制HCC細胞的侵襲和遷移。

圖3 阻斷IL-8受體對NTS誘導的HCC細胞侵襲性的影響Figure 3 Effects of IL-8 receptor blockade on NTS-induced tumor invasion

圖4 阻斷IL-8受體對NTS誘導的HCC細胞EMT的影響Figure 4 Effects of IL-8 receptor blockade on NTS-induced tumor EMT

3 討論

研究已證實炎性微環(huán)境的形成對腫瘤細胞EMT的發(fā)生和HCC侵襲能力的增加起著重要的推動作用，其中肝炎病毒引起的慢性肝硬化在腫瘤EMT形成中的促進作用早有定論，但目前對于非病毒性炎性微環(huán)境在EMT和HCC侵襲轉移中的作用尚不明確［8］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在HCC中，NTS高表達與多種炎癥基因的過表達及EMT的活化密切相關［9］。NTS是由13個氨基酸組成的神經(jīng)內(nèi)分泌肽，近年的研究已證實NTS與結腸癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌等多種惡性腫瘤的生長和侵襲密切相關［10-14］。NTS不僅可以促進惡性腫瘤細胞增殖，還可以刺激炎癥因子釋放，促進局部炎癥微環(huán)境形成［15］。其中NTS刺激炎癥趨化因子IL-8分泌的過程，即NTS/IL-8通路已被證實與結腸癌轉移及EMT過程密切相關［16，17］。但是目前關于肝癌中NTS/IL-8通路與EMT相關性的仍缺乏詳細的研究報道。

生理狀態(tài)下，IL-8是由單核巨噬細胞分泌的CXC型炎癥趨化因子，近期的研究證實乳腺癌和結腸癌等惡性腫瘤中也存在IL-8的表達，并且IL-8信號可通過促進腫瘤細胞發(fā)生EMT來提高惡性細胞的侵襲性［18］。現(xiàn)階段的研究已證實IL-8與HCC的進展和遠處轉移密切相關，但機制尚不清楚［19］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)原代HCC組織中，NTS和IL-8蛋白表達呈顯著正相關，且NTS和IL-8雙陽性HCC標本中伴有典型的上皮標志E-cadherin丟失和胞漿內(nèi)βcatenin堆積等EMT特征，提示HCC中可能存在NTS/ IL-8通路的異?；罨?，并與肝癌EMT進程顯著相關［9］。因此，本研究著重在體外基因修飾的HCC細胞系中探討NTS/IL-8通路及其對HCC侵襲、遷移和EMT的影響。

本研究利用慢病毒基因轉染和小干擾RNA技術構建不同NTS易感性HCC細胞模型［5，20］，以研究外源性NTS對HCC細胞合成和分泌IL-8的影響，并進一步探究NTS/ IL-8通路活化在HCC細胞侵襲遷移和EMT中的作用。首先，采用慢病毒基因轉染和小干擾RNA技術在體外構建NTR1穩(wěn)定高表達的Hep3BNTR1hi細胞系及NTR1敲減的HepG2NTR1-細胞系，用超過HCC細胞自分泌水平的外源性NTS對細胞進行刺激，觀察到外源性NTS刺激及NTR1的過表達可增加HCC細胞IL-8的合成和分泌。相反，阻斷NTR1后，IL-8的合成和分泌則明顯下降。這些結果表明NTS可通過與其受體NTR1結合促進IL-8的合成和分泌，即在HCC細胞存在NTS/IL-8通路的異常激活。同時，劃痕修復實驗和Transwell侵襲實驗的結果表明外源性NTS和高表達NTR1促進了HCC細胞的侵襲和遷移，而采用CXCR1/2的抑制劑reparixin來阻斷IL-8與受體的結合，即阻斷NTS/IL-8信號下傳，則觀察到在阻斷CXCR1/2表達后，HCC細胞的劃痕修復率明顯降低，并且侵襲細胞也顯著減少，這表明NTS/IL-8通路的激活促進了HCC細胞的遷移和侵襲；同時在阻斷CXCR1/2后，觀察到EMT相關指標也發(fā)生明顯變化，其中E-cadherin升高，而N-cadherin、β-catenin表達均降低。以上結果表明，NTS通過誘導IL-8的合成和分泌，繼而通過促進HCC細胞發(fā)生EMT而提高腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。

本研究進一步證實了HCC細胞中存在NTS/IL-8信號通路的異常激活，并且證明NTS/IL-8通路可通過促進HCC細胞EMT而提高腫瘤細胞的侵襲和遷移能力，從而為HCC的靶向治療提供了有利的實驗證據(jù)。

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（2016-10-10收稿）

（2017-02-18修回）

（編輯：周曉穎 校對：楊紅欣）

Effects of NTS-induced IL-8 on invasion and epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma

Lijie ZHANG1,Xinxin LONG1,Pei XIAO1,Yingnan YE2,Pengpeng LIU2,Jinpu YU1,2
1Department of Immunology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin's Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy,Tianjin 300060,China;2Cancer Molecular Diagnostic Center,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin's Clinical Research Center for Cancer,Tianjin 300060,China

Jinpu Yu;E-mail:yujinpu@tjmuch.com

Objective:To determine the abnormal activation of the neurotensin(NTS)/interleukin-8(IL-8)pathway and its effect on invasion and epithelial–mesenchymal transition(EMT)in hepatocellular carcinoma(HCC).Methods:Hepatoma cell lines Hep3BNTR1hiand HepG2NTR1-were genetically modified by gene transfection or siRNA interference to establish various NTS-sensitive HCC cell lines bearing multiple levels of NTS receptor 1(NTR1).ELISA assay and real time RT-PCR were used to detect the difference of IL-8 protein secretion and RNA synthesis in varied NTS-sensitive Hep3B and HepG2 cell lines after exogenous NTS stimulation.The migration and invasion potentials of HCC cells were evaluated by scratch repair test and Transwell invasion assay.Western blot assay was used to detect the expression of EMT-related proteins in HCC cells with or without blocking IL-8 receptors.Results:Exogenous NTS stimulation and NTR1 overexpression enhanced the IL-8 RNA synthesis and protein secretion(P all＜0.01).Exogenous NTS stimulation and NTR1 overexpression also increased the invasion of HCC cells(P all＜0.05).Blocking IL-8 receptors reduced the wound closure rate,decreased the numbers of invasive cells,and reversed the EMT progress(P all＜0.001),including the up-regulation of E-cadherin and down-regulation of N-cadherin and β-catenin.Conclusion:In HCC cells,NTS stimulation and high expression of NTR1 induced the synthesis and secretion of IL-8,thereby promoting tumor EMT and HCC invasion.

neurotensin,interlukin-8,hepatocellular carcinoma,EMT

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.06.163

①天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院免疫室，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市腫瘤免疫與生物治療重點實驗室，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心（天津市300060）；②腫瘤分子診斷中心

*本文課題受國家科技支撐計劃課題（編號：2015BAI12B12和2015BAI12B15）、國家自然科學基金課題（編號：81272360和81472473）及天津市科技計劃項目（編號：13ZCZCSY20300）資助

于津浦 yujinpu@tjmuch.com

This study was supported by the National Key Scientific and Technological Project of China(No.2015BAI12B12,2015BAI12B15),National Natural Science Foundation of China(No.81272360 and 1472473),and Scientific and Technological Project of Tianjin,China(No.13ZCZCSY20300)

張麗杰 專業(yè)方向為腫瘤免疫微環(huán)境的基礎研究。

E-mail：zhanglj1108@foxmail.com