鄰苯二甲酸二丁酯的毒性作用及機制*

紀(jì)紅蕊， 杜 霞， 宋永彬， 劉 欣

(哈爾濱理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院， 哈爾濱 150040)

化學(xué)工程

鄰苯二甲酸二丁酯的毒性作用及機制*

紀(jì)紅蕊， 杜 霞， 宋永彬， 劉 欣

(哈爾濱理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院， 哈爾濱 150040)

鄰苯二甲酸酯(PAEs)是指鄰苯二甲酸的酯化衍生物.作為塑化劑，PAEs廣泛應(yīng)用于塑料、涂料、油墨的生產(chǎn)中，同時也可添加于驅(qū)蟲劑、發(fā)膠噴霧劑、指甲油和火箭燃料中，但PAEs對人類健康具有嚴(yán)重危害.PAEs與塑料之間的結(jié)合并不緊密，很容易脫離塑料本體進(jìn)入環(huán)境中，因而PAEs已被很多國家限制使用，美國國家環(huán)保局將其列為環(huán)境優(yōu)先污染物，同時PAEs也被人們稱為“第二個全球性PCB污染物”.鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)是應(yīng)用最為廣泛的PAEs之一，主要用于制造塑料制品增塑劑、染料溶劑、橡膠助劑等[1].本文以DBP為研究對象，研究其對小鼠的肝臟和睪丸的毒性作用，從自由基損傷和生殖毒性角度探討了DBP的詳細(xì)致毒機制.

1 實 驗

1.1 實驗材料與儀器

主要實驗材料包括產(chǎn)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司的DBP(化學(xué)純)，產(chǎn)自上海華聯(lián)制藥有限公司的注射用環(huán)磷酰胺，產(chǎn)自南京建成生物制品公司的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、堿性磷酸酶(AKP)與水合氯醛(分析純)，產(chǎn)自中糧北海糧油工業(yè)(天津)有限公司的色拉油，以及購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物中心的昆明種小鼠.

主要實驗儀器包括德國弗魯克F6/10型超細(xì)勻漿器、T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計、產(chǎn)自上海博停經(jīng)貿(mào)有限公司的QL-861型渦旋混合振蕩器、產(chǎn)自北京醫(yī)用離心機廠的LD4-2A型臺式低速離心機、HH-S恒溫水浴鍋、日本Olympus BS60型萬能顯微鏡、中國愛華TSJ-1型全自動組織脫水包埋機、德國萊卡2135型輪轉(zhuǎn)式生物切片機與日本JEM-1220型透射電子顯微鏡.

1.2 實驗方法

1.2.1 DBP染毒與分組

選用體重為(30±5) g的雄性昆明種小鼠，通過灌胃進(jìn)行染毒，共設(shè)4個實驗組，包括1個空白對照組與3個染毒劑量組.不同染毒組的染毒劑量分別相當(dāng)于1/2LD50、1/4LD50和1/8LD50.每組連續(xù)染毒14 d，染毒期間各組均正常進(jìn)食和進(jìn)水.末次染毒結(jié)束后，禁食禁水，于第15 d處死小鼠.

1.2.2 臟器系數(shù)與關(guān)鍵酶的測定

于第15 d對小鼠進(jìn)行眼眶取血，經(jīng)離心處理10 min后吸出上層血漿，分別檢測血漿中AKP、GOT和GPT的活力.摘取小鼠的甲狀腺、肺、脾、胸腺、肝臟、睪丸、附睪、前列腺、心臟和腎臟組織，吸去多余的血液和組織液，稱其濕重，計算臟器系數(shù)(臟器的濕重與體重的比值).隨后摘取小鼠的部分肝臟組織，利用低溫生理鹽水進(jìn)行漂洗，再利用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的肝臟組織勻漿，測定其MDA與蛋白含量，以及CAT、SOD活力.

1.2.3 小鼠精子畸形實驗

選用體重為30 g的性成熟雄性昆明種小鼠進(jìn)行精子畸形實驗.在DBP染毒處理過程中將小鼠隨機分成5組，包括1個空白對照組、1個CP陽性對照組與3個染毒劑量組，不同染毒組的染毒劑量分別相當(dāng)于1/2LD50、1/4LD50和1/8LD50.每天染毒1次，連續(xù)灌胃染毒5 d，于末次染毒后的第30 d處死小鼠.摘取小鼠的一側(cè)附睪進(jìn)行制片與伊紅染色，在高倍顯微鏡下每只小鼠計數(shù)500只完整精子，計算其精子畸形率.

1.2.4 HE染色

將各實驗組小鼠的肝臟和睪丸迅速取出后，利用生理鹽水沖洗組織塊上的血液和黏液，并將其固定在甲醛溶液中.一段時間后將固定后的組織臟器取出，按照需要改刀成1 cm×2 cm×0.2 cm的組織塊后，投入甲醛固定液中.室溫下保持4 h后取出組織塊.首先利用流水對組織塊進(jìn)行為時30 min的沖洗，隨后對其進(jìn)行脫水處理.在脫水處理過程中乙醇的體積分?jǐn)?shù)分別為75%、85%、95%和100%，相應(yīng)的脫水時間均為2 h.之后對組織塊進(jìn)行二甲苯透明處理和石蠟包埋處理.將切片用具備好，修正并固定好包埋蠟塊后，即可進(jìn)行切片.切片厚度一般約為6 μm.將石蠟切片放入水浴鍋中，然后利用粘片劑將其粘貼在已用酒精處理后的載玻片上.在37.5 ℃恒溫箱中烤片2 h后，對切片進(jìn)行蘇木素(H)伊紅(E)染色[2].

1.2.5 組織觀察

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠臟器系數(shù)的測定

經(jīng)過不同劑量DBP染毒后獲得的小鼠臟器系數(shù)如表1所示.由表1可見，與空白對照組相比，1/2LD50組的胸腺、肝臟、腎臟和前列腺具有顯著性改變；1/4LD50組的腎臟具有顯著性改變；1/8LD50組的甲狀腺、脾臟、胸腺、肝臟和腎臟具有顯著性改變.需要注意的是圖注中P代表概率，且P

表1 DBP染毒后臟器系數(shù)的變化Tab.1 Change of organ coefficient after DBP contamination ×10-2

注：與空白對照組相比，*代表P<0.05，**代表P<0.005.

2.2 小鼠血漿、肝臟關(guān)鍵酶的測定

經(jīng)過不同劑量DBP染毒后小鼠血漿中關(guān)鍵酶的測定結(jié)果如表2所示.由表2可見，與空白對照組相比，1/2LD50組和1/4LD50組的GOT活力顯著升高；1/2LD50組、1/4LD50組和1/8LD50組的GPT活力顯著升高；1/2LD50組和1/8LD50組的AKP活力顯著下降.

表2 DBP對小鼠血漿中GOT、GPT和AKP的影響Tab.2 Effect of DBP on GOT，GPT and AKP in blood plasma of mice

注：與空白對照組相比，*代表P<0.05.

經(jīng)過不同劑量DBP染毒后肝臟中SOD、MDA與CAT的測定結(jié)果如表3所示.由表3可見，與空白對照組相比，1/2LD50組的SOD、CAT活力顯著下降，而MDA含量顯著升高.

表3 DBP對小鼠肝臟CAT、MDA與SOD的影響Tab.3 Effect of DBP on CAT，MDA and SOD in liver of mice

注：與空白組對照組相比，*代表P<0.05.

2.3 DBP對小鼠精子活動力與畸形率的影響

DBP對小鼠精子活動力與畸形率的影響結(jié)果如表4所示.由表4可見，與空白對照組相比，1/2LD50組、1/4LD50組與CP陽性對照組中小鼠精子活動率顯著下降；1/2LD50組與CP陽性對照組中小鼠精子數(shù)量顯著下降；1/2LD50組、1/4LD50組與CP陽性對照組中小鼠精子畸變率顯著升高.

2.4 DBP對肝臟病理的影響

圖1為光學(xué)顯微鏡下DBP染毒后肝臟的變化.空白對照組中小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰(見圖1a).經(jīng)過不同劑量DBP染毒后小鼠的肝臟發(fā)生了病理變化.1/2LD50組中小鼠的肝臟組織出現(xiàn)了一定的損傷，發(fā)現(xiàn)了壞死灶，壞死灶中心為碎片壞死的肝細(xì)胞與少量炎細(xì)胞，周圍具有增生纖維細(xì)胞及大量炎細(xì)胞(見圖1b)；同時組織左下方小葉中央靜脈周圍的肝細(xì)胞發(fā)生紅染，細(xì)胞核消失，而左上方可見部分肝細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞核濃縮現(xiàn)象，且胞漿內(nèi)含有空泡(見圖1c).1/4LD50組中組織右側(cè)為壞死的肝細(xì)胞，左側(cè)可見大量的炎細(xì)胞和增生的纖維細(xì)胞(見圖1d)；同時中央靜脈周圍的肝細(xì)胞發(fā)生膨脹，胞漿透亮，發(fā)生紅染，細(xì)胞核消失，胞漿內(nèi)含有空泡(見圖1e).1/8LD50組中組織上方為肝細(xì)胞壞死灶，下方可見肝細(xì)胞點狀壞死灶(見圖1f)；部分組織可以觀察到兩個壞死灶(見圖1g).

表4 DBP對小鼠精子活動力與畸形率的影響Tab.4 Effect of DBP on sperm viability and abnormality rate of mice

注：與空白對照組相比，*代表P<0.05，**代表P<0.01.

圖1 光學(xué)顯微鏡下DBP染毒后肝臟的變化Fig.1 Changes of liver after DBP contamination under optical microscope

圖2為電子顯微鏡下DBP染毒后肝臟的變化.1/2LD50組中小鼠肝臟出現(xiàn)了胞核萎縮、線粒體腫脹現(xiàn)象(見圖2b)；同時肝臟的毛細(xì)膽管絨毛減少，糖原聚積，細(xì)胞核嚴(yán)重變形(見圖2c).1/4LD50組中細(xì)胞核萎縮，線粒體基本正常(見圖2d).1/8LD50組中細(xì)胞核正常，線粒體腫脹(見圖2e).

圖2 電子顯微鏡下DBP染毒后肝臟的變化Fig.2 Changes of liver after DBP contamination under electron microscope

2.5 DBP對睪丸病理的影響

圖3為光學(xué)顯微鏡下DBP染毒后睪丸的變化.空白對照組中小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)清晰(見圖3a).經(jīng)過不同劑量DBP染毒后，小鼠的睪丸組織發(fā)生了改變.1/2LD50組中曲細(xì)精管細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)不再完整(見圖3b).1/4LD50組中曲細(xì)精管精原細(xì)胞紊亂，精原細(xì)胞內(nèi)有空泡，腔內(nèi)可見精子(見圖3c)；部分組織精原細(xì)胞發(fā)生變性，曲細(xì)精管內(nèi)可見少量精子(見圖3d).1/8LD50組中曲細(xì)精管管腔大小不一，左上方可見曲細(xì)精管管腔內(nèi)含有變性的細(xì)胞(見圖3e).

圖3 光學(xué)顯微鏡下DBP染毒后睪丸的變化Fig.3 Changes of testis after DBP contamination under optical microscope

圖4為電子顯微鏡下DBP染毒后睪丸的變化.空白對照組中小鼠睪丸曲細(xì)精管內(nèi)的各級支持細(xì)胞、生精細(xì)胞排列整齊，曲細(xì)精管的管腔大小一致，基膜完整，管內(nèi)各級生精細(xì)胞依次為精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞，且管腔內(nèi)可見精子細(xì)胞，同時支持細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)完整(見圖4a).1/2LD50組中線粒體腫大，精原細(xì)胞脫離(見圖4b).1/4LD50組中初級和次級精母細(xì)胞并無變化，線粒體腫大，細(xì)胞核減少(見圖4c).

3 毒性作用分析

3.1 肝臟毒性作用分析

肝臟是人體的重要器官，也是體內(nèi)新陳代謝的中心站，參與蛋白質(zhì)、激素、維生素、脂肪和凝血因子等重要物質(zhì)的合成，是機體內(nèi)重要的解毒部位[4].DBP是肝臟毒性物質(zhì)，DBP進(jìn)入人體后可以迅速溶入血液，最終引起肝臟組織形態(tài)的改變.由肝臟組織觀察結(jié)果可見，DBP對肝臟造成的損傷尤以高劑量組為重.光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果表明，1/2LD50組中肝臟組織出現(xiàn)壞死灶，周圍含有增生纖維細(xì)胞與大量炎細(xì)胞，部分肝細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞核濃縮現(xiàn)象，胞漿內(nèi)含有空泡.電子顯微鏡觀察結(jié)果表明，1/2LD50組中肝臟結(jié)構(gòu)細(xì)胞核萎縮，線粒體發(fā)生腫脹.就超微結(jié)構(gòu)而言，DBP引起肝臟損傷的作用靶點是細(xì)胞內(nèi)的線粒體.

圖4 電子顯微鏡下DBP染毒后睪丸的變化Fig.4 Changes of testis after DBP contamination under electron microscope

肝臟中GOT分布于細(xì)胞漿的水溶性部分和線粒體中，而GPT主要分布于細(xì)胞漿的水溶性部分.當(dāng)肝臟等臟器組織受損時，細(xì)胞內(nèi)的酶被釋放出來并進(jìn)入血液中，導(dǎo)致血清酶活力升高，最終酶的總活力約升高100～1 000倍，反映了肝細(xì)胞損害和壞死的程度[5].本文1/2LD50和1/4LD50組中的GPT和GOT均明顯升高，此時肝細(xì)胞內(nèi)的酶滲漏到血液中又通過血清肝酶譜的改變表現(xiàn)出來，表明肝細(xì)胞受到了損害.

AKP廣泛存在于各種組織中，尤以腸上皮、骨骼、肝臟、胎盤與白細(xì)胞中含量為多.正常人血清中AKP主要來自骨骼和肝臟，并經(jīng)膽道排出體外，故AKP的顯著改變可以用來診斷肝膽系統(tǒng)疾病.血清中AKP升高的機制較為復(fù)雜[6]，膽汁排泄障礙并非主要原因，而血清中AKP降低主要見于重癥慢性腎炎并伴有腎衰、營養(yǎng)不良和甲狀腺功能不全、鎂缺乏、乳糜瀉、嚴(yán)重貧血等病癥.本文1/2LD50組和1/8LD50組的AKP顯著下降，可見該結(jié)果與肝臟的損傷與病理改變機制相吻合.

氧自由基可以啟動膜脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在機體的新陳代謝過程中發(fā)揮重要作用，可以造成膜的流動性與通透性的改變，導(dǎo)致異常生理生化反應(yīng)與免疫反應(yīng)的產(chǎn)生.MDA是自由基脂質(zhì)過氧化過程中生成的醛類物質(zhì)，能夠促進(jìn)核酸、蛋白質(zhì)與磷脂的交聯(lián)，改變體內(nèi)重要生物大分子的功能.SOD是一種可以清除H2O2和OH·的物質(zhì)，SOD可以保護細(xì)胞不受毒性氧自由基的損傷，是人體防御內(nèi)、外環(huán)境中超氧離子損傷的重要保護酶.當(dāng)MDA含量升高、SOD活力降低時，可以引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而損傷細(xì)胞甚至導(dǎo)致某些細(xì)胞的死亡[7].1/2LD50組中SOD、CAT活力均顯著下降，MDA含量顯著升高，表明DBP確實能夠引起小鼠肝臟發(fā)生脂質(zhì)過氧化過程，因而加速了早期肝損傷的形成.

3.2 生殖毒性作用分析

睪丸具有生精與分泌睪酮兩大功能，睪丸細(xì)胞由生殖細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞組成，睪丸小葉內(nèi)含有盤曲的精曲小管，精曲小管上皮能夠產(chǎn)生精子[8].小管之間的結(jié)締組織內(nèi)含有分泌雄性激素的間質(zhì)細(xì)胞.精曲小管結(jié)合成精直小管，并進(jìn)入睪丸縱隔交織形成睪丸網(wǎng).本文中經(jīng)過DBP染毒后睪丸組織形態(tài)發(fā)生了改變，表明不同染毒劑量的DBP能夠進(jìn)入睪丸細(xì)胞內(nèi)部，損害睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞.

精子活力是指精液中表現(xiàn)為前進(jìn)運動的精子所占的百分比[9].具有前進(jìn)運動的精子才可能具有正常的生存能力和受精能力，因而精子活力是目前評定精液品質(zhì)優(yōu)劣的常規(guī)檢查中的主要指標(biāo)之一.精子活率是指存活精子的數(shù)量，可以定量評估活精子與死精子的數(shù)量.精子活動力反映的是活動精子的質(zhì)量優(yōu)劣，可以定性評估精子的活力.本文中較高染毒劑量的DBP可使精子活動率顯著下降，并使精子數(shù)量顯著減少，表明該物質(zhì)對各級生精細(xì)胞的生長和發(fā)育均可以產(chǎn)生毒性作用.

4 結(jié) 論

[1]Du J B，Tang Y L，Long Z W，et al.Theoretical calculation of spectra of dibutyl phthalate and dioctyl phthalate [J].Russian Journal of Physical Chemistry A，2014，88(5)：819-822.

[2]George A，Elliot L，Ronald P，et al.Pathologic response to preoperative chemotherapy in colorectal liver metastases：fibrosis，not necrosis，predicts outcome [J].Annals of Surgical Oncology，2012，19(9)：2797-2804.

[3]紀(jì)紅蕊，陳家駒，張茜，等.雙酚A的毒性作用機制 [J].沈陽工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，37(6)：710-715.

(JI Hong-rui，CHEN Jia-ju，ZHANG Qian，et al.Toxic effect mechanisms of bisphenol A [J].Shenyang University of Technology，2015，37(6)：710-715.)

[4]Johan F L，Maciej M，Daniel S，et al.Function and volume recovery after partial hepatectomy：influence of preoperative liver function，residual liver volume，and obesity [J].Langenbeck’s Archives of Surgery，2012，397(8)：1297-1304.

[5]Papadimitriou E，Loumbourdis N S.Glycogen，proteins，and aminotransferase (GOT，GPT) changes in the frog rana ridibunda exposed to high concentrations of copper [J].Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology，2005，74(1)：120-125.

[6]Yuan X，Wang J G，Zhu X Y，et al.Effect of copper on levels of collagen and alkaline phosphatase activity from chondrocytes in newborn piglets in vitro [J].Bio-logical Trace Element Research，2011，144(1)：597-605.

[7]Liu M，Chang X R，Yan J.Effects of moxibustion pretreatment on GSH-Px，SOD and MDA in gastric mucosa of rats with stress ulcer [J].Journal of Acupuncture and Tuina Science，2011，9(1)：17-20.

[8]Kang H J，Moon M J，Lee H Y，et al.Testosterone alters testis function through regulation of piRNA expression in rats [J].Molecular Biology Reports，2014，41(10)：6729-6735.

[9]Nudmamud-Thanoi S，Thanoi S.Pseudoephedrine induces sperm abnormalities，lower sperm counts and increased apoptosis in rat testis [J].Cell and Tissue Research，2012，349(2)：625-630.

[10]Sivanarayana T，Ravi-Krishna G，Jaya-Prakash K，et al.CASA derived human sperm abnormalities：correlation with chromatin packing and DNA fragmenta-tion [J].Journal of Assisted Reproduction and Genetics，2012，29(12)：1327-1334.

(責(zé)任編輯：尹淑英 英文審校：尹淑英)

Toxic effect and mechanisms of dibutyl phthalate

JI Hong-rui,DU Xia,SONG Yong-bin,LIU Xin

(College of Chemical and Environmental Engineering,Harbin University of Science and Technology,Harbin 150040,China)

Aiming at the current situation that the environmental pollution has become increasingly serious,the effect of dibutyl phthalate (DBP) on the hepatotoxicity and reproductive toxicity was studied.The key enzymes,sperm viability and sperm abnormality rate were tested,and the pathological changes of liver and testis were observed.The results show that DBP can significantly raise the glutamic-pyruvic transaminase (GPT),glutamic-oxaloacetic transaminase (GOT),alkaline phosphatase (AKP) and malonaldehyde (MDA),and remarkably reduce the superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT).It means that DBP can induce the lipid peroxidation of liver for mice and early hepatic injury.BPA can penetrate blood-testis barrier,and interfere the growth and development process of sperms.Therefore,DBP is a genotoxic compound which has latent mutagenic damage to the malesex cells.

dibutyl phthalate(DBP);hepatotoxicity;reproductive toxicity;lipid peroxidation injury;blood-testis barrier;sperm viability;sperm abnormality rate;pathological change

2016-06-23.

國家自然科學(xué)基金資助項目(21476054).

紀(jì)紅蕊(1978-)，女，黑龍江哈爾濱人，副教授，博士，主要從事毒理學(xué)與藥理學(xué)等方面的研究.

02 17∶27在中國知網(wǎng)優(yōu)先數(shù)字出版.

http：∥www.cnki.net/kcms/detail/21.1189.T.20170302.1727.002.html

10.7688/j.issn.1000-1646.2017.02.20

TQ 450.2

A

1000-1646(2017)02-0230-06