利用geNorm、NormFinder和 BestKeeper軟件進(jìn)行內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析的方法

吳建陽(yáng)+何冰+杜玉潔++李偉才+魏永贊

摘要 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）由于具備靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)及高通量等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為研究基因表達(dá)分析的常用方法，但其結(jié)果的準(zhǔn)確性取決于內(nèi)參基因。在任何試驗(yàn)條件下都能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因幾乎不存在，科研工作者為了獲得精準(zhǔn)的試驗(yàn)結(jié)果，首先必須從眾多的內(nèi)參基因中篩選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因。geNorm、NormFinder和BestKeeper等是專門用于篩選穩(wěn)定性內(nèi)參基因的軟件，但這3種軟件使用方法差異很大，為了讓更多的科研人員了解這些軟件、節(jié)省時(shí)間，筆者結(jié)合自己的科研經(jīng)驗(yàn)詳細(xì)介紹了這3種軟件的使用方法，以期為相關(guān)科研人員利用這些軟件篩選內(nèi)參基因提供便利。

關(guān)鍵詞 內(nèi)參基因；穩(wěn)定性分析；geNorm；NormFinder；BestKeeper

中圖分類號(hào) S60 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）05-0278-04

Abstract Real-time fluorescent quantitative PCR technology（RT-qPCR） is used for gene expression analysis with high sensitivity，good repea-tability，strong specificity，high throughput，but the veracity and reliability results depend on whether select appropriate reference gene or not.However，no universally applicable reference genes with an invariant expression are available.In order to obtain accurate results，appropriate reference genes for RT-qPCR normalisation must systematically evaluate the stability of candidate reference genes prior to using in each experimental system.geNorm，NormFinder and BestKeeper are useful programs to identify appropriate reference genes for RT-qPCR analysis，but the methods for using the three softwares were different.In order to save the time to understanding the way to use them and provide convenient for new researchers，this study described the methods of application.

Key words reference gene；stability analysis；geNorm；NormFinder；BestKeeper

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）由于具備靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)及高通量等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為研究基因表達(dá)分析的常用方法[1-2]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分為絕對(duì)定量和相對(duì)定量，在進(jìn)行相對(duì)定量分析時(shí)不需要已知量的標(biāo)準(zhǔn)品，因而該方法被經(jīng)常運(yùn)用，但該方法需要用內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行數(shù)據(jù)校正，才能獲得精確的結(jié)果[3-4]。

肌動(dòng)蛋白基因（ACT）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPD

H）、18S rRNA、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因（EF-1α）、多聚泛素酶基因（UBQ）、α微管蛋白基因（TUA）和β微管蛋白基因（TUB）等看家基因在之前的研究中常常被當(dāng)作內(nèi)參基因進(jìn)行使用[5-8]。然而，越來(lái)越多的研究表明，在某種試驗(yàn)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，在另一種試驗(yàn)中有可能是變化的[9-11]，而在任何試驗(yàn)條件下都能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因幾乎不存在[12-13]。如果僅僅根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道使用某個(gè)常用的內(nèi)參基因，不僅可能導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確性，甚至可能導(dǎo)致結(jié)論的錯(cuò)誤。因此，本著嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度，科研工作者首先必須從眾多的內(nèi)參基因中篩選出在各自試驗(yàn)條件下較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

geNorm、NormFinder 和 BestKeeper是專門用于篩選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的軟件，但這3種軟件的使用方法和分析的側(cè)重點(diǎn)各不一樣，為了讓相關(guān)科研人員快速了解并掌握這3種軟件的使用方法，筆者結(jié)合自身使用這些軟件的經(jīng)歷，詳細(xì)介紹了這3種軟件的使用要點(diǎn)，以期為相關(guān)科研人員分析內(nèi)參基因穩(wěn)定性提供便利。

1 geNorm軟件

1.1 軟件概述

geNorm 軟件是Vandesompele等[14]在2002年編寫的專門用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR中篩選內(nèi)參基因及確定最適內(nèi)參基因數(shù)目的程序，該程序可以用于篩選任何試驗(yàn)的任意數(shù)目的內(nèi)參基因，并最終挑選出2個(gè)或2個(gè)以上的內(nèi)參基因組合來(lái)校正數(shù)據(jù)，可使相對(duì)定量的結(jié)果更為精確。geNorm程序通過(guò)計(jì)算出每個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性的M值來(lái)篩選出穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因，判定標(biāo)準(zhǔn)為M值越小內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好，反之，則穩(wěn)定性越差。該軟件還可計(jì)算引入1個(gè)新的內(nèi)參基因后標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)變異V值，并根據(jù)Vn/Vn+1值來(lái)確定所需最適內(nèi)參基因的數(shù)目。默認(rèn)的V值為0.15（該值可以人為稍作調(diào)整），如果Vn/Vn+1值<0.15，則最適內(nèi)參基因的數(shù)量是n個(gè)；而如果Vn/Vn+1值>0.15，則最適內(nèi)參基因的數(shù)量是n+1個(gè)。

1.2 操作流程

1.2.1 修改Excel表格安全性級(jí)別。若geNorm軟件打開后不能正常運(yùn)行時(shí)，可能是由于Excel表格默認(rèn)宏的安全性級(jí)別設(shè)置的比較高，這時(shí)需要將Excel表格安全性級(jí)別更改到最低級(jí)別。更改方法為點(diǎn)擊Excel表格中的“工具”按鈕，然后點(diǎn)擊其下拉菜單“宏”的子菜單“安全性”選項(xiàng)，在彈出來(lái)的“安全性”對(duì)話框中將安全級(jí)別設(shè)置為最低。

1.2.2 計(jì)算？駐Ct值。先找到該基因在所有樣品中最小的Ct（Cycle threshold）值（表達(dá)量最高），再用其他樣品的Ct值減去最低Ct值，從而得到？駐Ct值，該值≥0。

1.2.3 計(jì)算2-？駐Ct值。獲得每個(gè)樣品每個(gè)基因的？駐Ct值后，利用Excel中的函數(shù)計(jì)算出相應(yīng)樣品相應(yīng)基因的2-？駐Ct值，該值就是每個(gè)候選內(nèi)參基因的相對(duì)定量數(shù)據(jù)，也是進(jìn)行g(shù)eNorm軟件分析時(shí)要用到的數(shù)據(jù)。

1.2.4 制作Excel表格。在利用geNorm軟件分析時(shí)是將已經(jīng)處理好的各個(gè)候選內(nèi)參基因的相對(duì)定量數(shù)據(jù)保存在一個(gè)新的Excel表格中，再把Excel表格導(dǎo)入geNorm程序中。而這個(gè)Excel表格中對(duì)于基因和樣品的排列位置是有特定要求的，要求規(guī)定第一列為試驗(yàn)的樣品（樣品數(shù)量至少在2個(gè)以上，樣品數(shù)量越多結(jié)論越可靠），第1行為欲篩選的內(nèi)參基因，第1列第1行的單元格必須是空的，其他單元格的數(shù)據(jù)是在步驟1.2.3中計(jì)算得到的基因相對(duì)表達(dá)量的數(shù)值。

1.2.5 內(nèi)參基因穩(wěn)定性和合適內(nèi)參基因數(shù)目的確定。關(guān)閉所有Excel程序，啟動(dòng)geNorm程序，點(diǎn)擊菜單欄中的“Load input data”按鈕導(dǎo)入已經(jīng)在步驟1.2.4中制作的Excel表格，點(diǎn)擊軟件中的“Calculate”按鈕，軟件初步計(jì)算后再點(diǎn)擊“Automated analysis”按鈕，便可得到候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性折線圖，見圖1（a），該圖最左邊基因的M值最高，是穩(wěn)定性最差的基因（H3基因），右邊基因的M值依次較左邊基因的M值低，穩(wěn)定性依次增強(qiáng)，最右邊基因的M值最低，是穩(wěn)定性最好的2個(gè)基因（CYP1和Fe-SOD2基因）。點(diǎn)擊菜單欄中的“Print or Save report”按鈕，從彈出來(lái)的對(duì)話框中選中“save output to fi”選項(xiàng)便可把每個(gè)候選內(nèi)參基因的M值導(dǎo)出到一個(gè)Excel中。再次點(diǎn)擊“Automated analysis”按鈕便可得到最適數(shù)據(jù)歸一化內(nèi)參數(shù)目的柱形圖，見圖1（b），可根據(jù)每個(gè)柱形圖上面的V值來(lái)確定試驗(yàn)所需的最適內(nèi)參基因數(shù)目，判定標(biāo)準(zhǔn)為當(dāng)Vn/Vn+1< 0.15時(shí)，則最合適內(nèi)參基因的數(shù)量是n個(gè)；而如果Vn/Vn+1 > 0.15時(shí)，則最合適內(nèi)參基因的數(shù)量是n+1個(gè)，所以該試驗(yàn)條件下的最適內(nèi)參基因數(shù)目是2個(gè)，因?yàn)閂2/3=0.135<0.15。再次點(diǎn)擊菜單欄中的“Print or Save report”按鈕，從彈出來(lái)的對(duì)話框中選中“save output to fi”選項(xiàng)便可把所有的Vn/Vn+1值導(dǎo)出到一個(gè)Excel中。

2 NormFinder軟件

2.1 軟件概述

NormFinder是Claus等[15]在2004年編寫的用于篩選穩(wěn)定性內(nèi)參基因的另一種程序，該程序計(jì)算原理與geNorm 程序相似，也是先獲得內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值，再根據(jù)穩(wěn)定值大小來(lái)篩選出最合適的內(nèi)參基因，判定標(biāo)準(zhǔn)為表達(dá)穩(wěn)定值最小的內(nèi)參基因?yàn)樽詈线m的內(nèi)參基因。NormFinder程序不但可以比較候選內(nèi)參基因的表達(dá)差異，還可以計(jì)算樣品組間的變異，但該程序只能篩選出一個(gè)最合適的內(nèi)參基因[16]。

2.2 操作流程

2.2.1 在Excel表格中插入NormFinder軟件。先打開一個(gè)Office 2003版的Excel表格，在菜單欄中單擊“工具”下拉菜單中的“加載宏”選項(xiàng)，通過(guò)“加載宏”對(duì)話框中的“瀏覽”按鈕找到NormFinder軟件存放的位置，點(diǎn)擊“確定”按鈕，將NormFinder軟件功能加載到Excel中，加載成功后在Excel菜單欄中會(huì)多一個(gè)NormFinder按鈕（圖2）。

2.2.2 計(jì)算？駐Ct值。計(jì)算方法與步驟1.2.2一致。

2.2.3 計(jì)算2-？駐Ct值。計(jì)算方法與步驟1.2.3一致。

2.2.4 制作Excel表格。進(jìn)行NormFinder分析是在Excel表格中進(jìn)行的，但Excel表格中基因和樣品的排列位置與進(jìn)行g(shù)eNorm軟件分析時(shí)有所不同。利用NormFinder分析時(shí)，Excel表格中第1列為欲篩選的內(nèi)參基因，第1行為試驗(yàn)中的樣品，第1列第1行的單元格必須是空的，其他單元格的數(shù)據(jù)是步驟2.2.3中計(jì)算得到的基因相對(duì)表達(dá)量的數(shù)值。

2.2.5 內(nèi)參基因穩(wěn)定性的確定。步驟2.2.4處理好后單擊Excel菜單欄“NormFinder”按鈕下拉菜單的“NormFinder”選項(xiàng)，便彈出對(duì)話框，如圖3所示。單擊“Select input date”后面的按鈕，就可以利用鼠標(biāo)在Excel表格中選定數(shù)據(jù)區(qū)域，選定區(qū)域后再次回到圖3界面，然后單擊“Go”按鈕，便可獲得各個(gè)基因穩(wěn)定性M值，同時(shí)穩(wěn)定性最好的基因（Best gene）會(huì)單獨(dú)顯示出來(lái)，如圖4所示最穩(wěn)定的基因?yàn)镽PL2。

3 BestKeeper軟件

3.1 軟件概述

BestKeeper是Michael等[17]編寫的針對(duì)內(nèi)參基因和目標(biāo)基因表達(dá)量分析的程序，該程序最多只能比較100個(gè)樣品中10個(gè)內(nèi)參基因和10個(gè)目標(biāo)基因的表達(dá)水平。通過(guò)該程序計(jì)算可以獲得每個(gè)基因之間產(chǎn)生配對(duì)的相關(guān)系數(shù)（r）、標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和變異系數(shù)（CV），再通過(guò)比較各個(gè)值的大小，最終確定穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因。判定原則為相關(guān)系數(shù)越大、標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)越小，內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好，反之，穩(wěn)定性越差；當(dāng)SD>1時(shí)，則該內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定。該程序不但可以用于內(nèi)參基因穩(wěn)定性比較，還可以分析目的基因的表達(dá)水平。

3.2 操作流程

BestKeeper程序是一個(gè)內(nèi)置公式的Excel表格，在該表格中只有CP（crossing point）值輸入?yún)^(qū)域（CP date input）可以進(jìn)行數(shù)據(jù)的輸入和修改，其他區(qū)域的單元格由于帶有內(nèi)置公式而不能進(jìn)行任何操作。該程序操作較簡(jiǎn)單，只需要將實(shí)時(shí)熒光定量PCR所獲得的CP值直接輸入“CP date input”區(qū)域，輸入的CP值是RT-qPCR中3次技術(shù)重復(fù)所得值的幾何平均數(shù)。當(dāng)CP值輸入完畢后，BestKeeper程序會(huì)自動(dòng)將計(jì)算好的相關(guān)系數(shù)（r）、標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和變異系數(shù)（CV）等值顯示在表格的下方。之后根據(jù)判定原則，確定較穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

4 結(jié)語(yǔ)

geNorm、NormFinder和BestKeeper等軟件是專門用于篩選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的程序，且在多種植物中利用這些軟件獲得的內(nèi)參基因穩(wěn)定性試驗(yàn)成果已在較高檔次的SCI期刊上發(fā)表，如在大豆[18]、馬鈴薯[19]、印加果[20]、香蕉[21]上的試驗(yàn)結(jié)果分別在BMC Molecular Biology、Journal of Experimental Botany、International Journal of Molecular Sciences、Planta期刊上發(fā)表，筆者利用這些軟件分析獲得的龍眼[22]內(nèi)參基因穩(wěn)定性結(jié)果也發(fā)表在Frontiers in Plant Science期刊。

利用geNorm和NormFinder軟件分析時(shí)，需要將RT-qPCR所得到的Ct值轉(zhuǎn)化為基因的相對(duì)表達(dá)量，然后按相應(yīng)的格式把這些數(shù)據(jù)保存在Excel表格中，而在使用BestKeeper軟件時(shí)不需要將RT-qPCR所得到的CP值進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可以直接使用所得到的CP值。

geNorm分析時(shí)首先是將已經(jīng)處理好的數(shù)據(jù)保存在Excel表格中，再把Excel表格導(dǎo)入geNorm程序中。NormF-inder分析時(shí)是在Excel表格中將NormFinder程序以宏的方式插入到Excel表格中，從而使Excel具有NormFinder分析功能。BestKeeper分析時(shí)是在內(nèi)置BestKeeper公式的Excel表格中直接輸入CP值進(jìn)行分析。

這3種軟件各具優(yōu)點(diǎn)，geNorm軟件可以用于篩選任何樣品的任意數(shù)量?jī)?nèi)參基因，通過(guò)該程序分析可以篩選出合適的內(nèi)參基因以及確定最適內(nèi)參基因數(shù)目。NormFinder軟件不但可以比較內(nèi)參基因的表達(dá)差異，還可以計(jì)算樣品組間的變異，但只能篩選出1個(gè)合適的內(nèi)參基因。BestKeeper軟件可以用于比較100個(gè)樣品中10個(gè)內(nèi)參基因和10個(gè)目標(biāo)基因的表達(dá)水平，并最終獲得較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

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