江蘇地區(qū)漢族孕前女性中與先心病相關(guān)的MTHFR基因多態(tài)性分布研究

李孟蘭　孫曉如　黃麗麗　官　燮　王麗娟　陳　偉　姜志欣　姜　晏

封　婕1　吳玉璘1　林　寧1*

1.江蘇省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，江蘇省生殖健康檢驗(yàn)中心(南京，210036)； 2.重慶市人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院

出生缺陷是國(guó)際上一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題，在發(fā)展中國(guó)家尤為突出。目前，我國(guó)每年新增出生缺陷約為90萬(wàn)例[1]，其中先天性心臟病(簡(jiǎn)稱(chēng)先心病)從2005年開(kāi)始一直處于首位高發(fā)，給社會(huì)和家庭帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。先心病的發(fā)生受遺傳、環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)因素等的共同影響，如何有效地預(yù)防先心病的發(fā)生、降低先心病患兒的出生率已成為婦幼保健工作中亟待解決的問(wèn)題。本研究通過(guò)檢測(cè)915名孕前漢族女性中與先心病相關(guān)的亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR )c.677C>T和c.1298A>C兩個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性，探討江蘇地區(qū)孕前漢族女性中與先心病相關(guān)的MTHFR基因的遺傳分布特征，了解備孕婦女中攜帶與子代先心病發(fā)生相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因的比例，為建立以個(gè)性化補(bǔ)充葉酸為主的預(yù)防子代先心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的一級(jí)預(yù)防管理提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以在江蘇地區(qū)蘇南(丹陽(yáng)市300人)、蘇中(南通市310人)和蘇北(沭陽(yáng)縣305人)3個(gè)項(xiàng)目點(diǎn)中參加孕前優(yōu)生健康檢查的備孕婦女共915人為研究對(duì)象，均為漢族女性，年齡(26.1±2.9)歲。對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)問(wèn)卷調(diào)查并自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 DNA抽提采集研究對(duì)象靜脈血2ml，EDTA抗凝后保存于-80℃冰箱。室溫平衡后，經(jīng)蛋白酶K消化，再以酚、氯仿/異戊醇法抽提外周血白細(xì)胞中的基因組DNA。

1.2.2 MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)以抽提的基因組DNA為模板，采用Taqman-MGB技術(shù)檢測(cè)和分析各研究對(duì)象MTHFR c.677C>T、c.1298A>C的基因多態(tài)性。反應(yīng)體系共6μl，其中含待測(cè)DNA樣本1μl(濃度為10μg/μl)，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)(50℃ 2min、95℃ 10min、95℃ 15s、60℃ 1min)。實(shí)驗(yàn)中所用儀器為美國(guó)ABI 7900HT型熒光定量PCR儀，采用配套試劑進(jìn)行檢測(cè)。MTHFR c.677C>T位點(diǎn)的探針序列(5’-3’)FAM-AAATCGGCTCCCGCA-MGB，HEX-TGAAATCGACTCCCG-MGB；c.1298A>C位點(diǎn)的探針序列(5’-3’)FAM-AAGACACTTTCTTCACTG-MGB；HEX-AGACACTTGCTTCAC-MGB。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)研究人群采用HaploView4.2軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)、連鎖不平衡(LD)檢驗(yàn)和單體型構(gòu)建、分析。根據(jù)各研究對(duì)象的基因型結(jié)果，用Excel表分別計(jì)算3個(gè)項(xiàng)目點(diǎn)及總的等位基因頻率和基因型頻率，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，對(duì)各個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率的組間比較以及江蘇地區(qū)與其他省市之間基因型頻率及等位基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡分析

對(duì)MTHFR c.677C>T、c.1298A>C兩個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，其P值分別為0.482(c.677C>T)、0.688(c.1298A>C)，表明MTHFR c.677C>T、c.1298A>C兩個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，受檢樣本具有本區(qū)域群體代表性。

2.2 MTHFR多態(tài)性分布特征

蘇南、蘇中、蘇北3個(gè)地區(qū)MTHFR c.677C>T和c.1298A>C基因型分布特征和等位基因頻率詳見(jiàn)表2、表3。與蘇北地區(qū)比較，蘇中地區(qū)MTHFR c.677C>T TT基因型頻率和T等位基因頻率均低于蘇北地區(qū)(χ2=9.61，P=0.008；χ2=6.31，P=0.013)，蘇南地區(qū)MTHFRc.677C>T TT基因型頻率和T等位基因頻率與蘇北地區(qū)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而3個(gè)地區(qū)MTHFR c.1298A>C基因型分布和等位基因頻率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1　不同地區(qū)孕前女性MTHFR基因型頻率與等位基因頻率分布[例(%)]

*與蘇北比較P<0.05

2.3 與其他地區(qū)MTHFR基因型和等位基因頻率比較

2.3.1 MTHFR基因型在各地區(qū)漢族女性中的比較將本研究中蘇中、蘇南、蘇北3個(gè)地區(qū)共915名受試者作為一個(gè)整體代表江蘇地區(qū)與我國(guó)其他省市比較發(fā)現(xiàn)，江蘇地區(qū)漢族孕前女性MTHFR c.677C>T和c.1298A>C兩個(gè)位點(diǎn)基因型分布具有本地區(qū)的地域特點(diǎn)。本研究MTHFR c.677C>T純合突變TT基因型頻率為20.5%，顯著高于湖南湘潭、廣東惠州、海南省(P<0.05)，低于吉林延邊、山東淄博、河南鄭州(P<0.05)。結(jié)果顯示TT基因型頻率由南向北逐漸遞增，在山東淄博達(dá)到最高(43.6%)，吉林延邊又有下降趨勢(shì)。本研究c.1298A>C純合突變CC基因型頻率為3.4%，高于吉林延邊、山東淄博、河南鄭州(P<0.05)，低于湖南湘潭、廣東惠州、海南省(P<0.05)。結(jié)果顯示CC基因型頻率由南向北逐漸遞減，在鄭州達(dá)最低(1.3%)，再往北又有上升趨勢(shì)。見(jiàn)表2。

*與本研究比較P<0.05

2.3.2 MTHFR等位基因在各地區(qū)漢族女性中的比較江蘇地區(qū)漢族孕前女性MTHFR c.677C>T突變T等位基因頻率為44.6%，高于湖南湘潭、廣東惠州及海南省(P<0.05)，低于吉林延邊、山東淄博和河南鄭州(P<0.05)。c.677C>T突變T等位基因頻率總體由南向北逐漸遞增，在河南鄭州達(dá)最高(62.3%)，再往北又有下降趨勢(shì)。本研究c.1298A>C突變C等位基因頻率為17.8%，高于吉林延邊、山東淄博和河南鄭州(P<0.05)，低于湖南湘潭、廣東惠州及海南省(P<0.05)。c.1298A>C突變C等位基因頻率由南向北逐漸遞減，在山東淄博達(dá)最低(11.2%)，隨后又有上升趨勢(shì)。見(jiàn)表3。

表3　江蘇地區(qū)孕前女性MTHFR等位基因頻數(shù)和頻率分布及與其他地區(qū)比較[例(%)]

*與本研究比較P<0.05

2.4 MTHFR c.677C>T和c.1298A>C兩位點(diǎn)聯(lián)合基因型頻率分布及及單體型分析

MTHFR c.677C>T和c.1298A>C兩個(gè)位點(diǎn)間具有9種聯(lián)合基因型，其中CC/AA[146(16.0%)]、CC/AC[(111(12.1%)]、CC/CC[29(3.2%)]、CT/AA[293(32.0%)]、CT/AC[146(16.0)%]、TT/AA[182(19.9%)]這6種聯(lián)合基因型檢出頻率較高，CT/CC[2(0.2%)]和TT/AC[6(0.6%)]聯(lián)合基因型檢出頻率較低。另外，受樣本量較少的限制，本研究中未檢出TT/CC聯(lián)合基因型。LD檢驗(yàn)結(jié)果顯示D’和r2值分別為0.90和0.14，提示MTHFR c.677C>T和c.1298A>C兩個(gè)位點(diǎn)間存在明顯的連鎖不平衡現(xiàn)象。單體型分析結(jié)果顯示兩個(gè)位點(diǎn)間存在4種組合情況，其檢出頻率分別為677C-1298A(38.3%)、677T-1298A(43.9%)、677C-1298C(17.0%)、677T-1298C(0.8%)。

3 討論

先天性心臟病是一種臨床常見(jiàn)的出生缺陷，在臨床上診斷和治療雖然已取得顯著的發(fā)展和進(jìn)步，但仍是新生兒死亡的主要原因之一。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，同型半胱氨酸的代謝異常在先心病的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，是先心病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。

MTHFR是由Goyette[3]等于1994年首次克隆成功的，其基因定位于染色體1p36.3，全長(zhǎng)19.3kb，mRNA全長(zhǎng)為7105 bp，共12個(gè)外顯子，編碼含有657個(gè)氨基酸編碼子的蛋白。MTHFR是葉酸和同型半胱氨酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，負(fù)責(zé)將體內(nèi)的5,10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸。5-甲基四氫葉酸作為體內(nèi)葉酸的主要活性形式，是一種重要的甲基供體，在甲硫氨酸合酶催化下，可使血液中同型半胱氨酸發(fā)生再甲基化，生成甲硫氨酸，從而維持血液中同型半胱氨酸正常水平。

研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR 基因具有多種基因多態(tài)性，尤以MTHFR c.677C>T位點(diǎn)C→T突變和MTHFR c.1298A>C位點(diǎn)A→C突變研究得最多，這兩個(gè)位點(diǎn)的突變可導(dǎo)致酶活性和熱穩(wěn)定性顯著降低。其中，c.677C>T 位點(diǎn)TT純合突變可使酶活性下降到正常的22%。單純MTHFR c.1298A>C位點(diǎn)A→C突變與酶的熱穩(wěn)定性無(wú)關(guān)，且對(duì)酶活性的降低影響不大，但其與c.677C>T位點(diǎn)存在協(xié)同作用，當(dāng)兩個(gè)位點(diǎn)為雙雜合狀態(tài)時(shí)，可使酶活性下降到正常的36%[4]。MTHFR酶活性的降低可導(dǎo)致機(jī)體葉酸代謝障礙，使血清和紅細(xì)胞葉酸濃度顯著降低，導(dǎo)致血漿同型半胱氨酸濃度顯著升高[5]。同時(shí)，葉酸的缺乏和高同型半胱氨酸血癥又是導(dǎo)致出生缺陷發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，可導(dǎo)致神經(jīng)管畸形、先天性心臟病、唐氏綜合征、唇腭裂、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、妊娠期高血壓等不良妊娠結(jié)局的發(fā)生[6-8]。

我們通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)與兒童先天性心臟病發(fā)病相關(guān)的易感性基因位點(diǎn)為MTHFR c.1298A>C(rs1801131)，其中母親的MTHFR c.1298A>C CC純合突變，使其孩子發(fā)生先天性心臟病的風(fēng)險(xiǎn)增加267.0%。MTHFR c.1298A>C和c.677C>T (rs1801133)單體型分析也顯示攜帶TC突變與先天性心臟病存在顯著關(guān)聯(lián)[9]。因此，我們認(rèn)為 MTHFR基因多態(tài)性是子代發(fā)生先天性心臟病的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。為進(jìn)一步了解MTHFR有關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因在江蘇地區(qū)有生育愿望的健康婦女人群中出現(xiàn)的幾率及其與機(jī)體葉酸和同型半胱氨酸含量之間的關(guān)系，并制定個(gè)體化孕前葉酸增補(bǔ)方案等預(yù)防先天性心臟病的切實(shí)可行的干預(yù)措施，本文研究江蘇地區(qū)孕前女性的MTHFR c.677C>T和c.1298A>C的基因多態(tài)性，并與已報(bào)道的其他地區(qū)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)蘇北地區(qū)MTHFR c.677C>T純合突變TT基因型和T等位基因頻率均高于蘇中和蘇南地區(qū)，c.1298A>C基因型分布和等位基因頻率3個(gè)地區(qū)比較未見(jiàn)差異。而以3個(gè)地區(qū)作為一個(gè)整體與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)比較，江蘇地區(qū)漢族孕前女性MTHFR c.677C>T位點(diǎn)TT基因型和T等位基因頻率與吉林延邊[10]、山東淄博[11]、河南鄭州[12]、湖南湘潭[13]、廣東惠州[14]及海南省[15]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TT基因型頻率與T等位基因頻率呈現(xiàn)北方高于南方的趨勢(shì)；MTHFR c.1298A>C位點(diǎn)CC基因型和C等位基因頻率與吉林延邊、山東淄博、河南鄭州、湖南湘潭、廣東惠州及海南省比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CC基因型頻率與C等位基因頻率呈現(xiàn)南方高于北方的趨勢(shì)，與賈小平[16]等報(bào)道相似。

以上研究發(fā)現(xiàn)，MTHFRc.677C>T和c.1298A>C基因多態(tài)性不僅在我國(guó)南北方不同省市、不同人群之間存在差異，在江蘇地區(qū)內(nèi)不同地市之間也存在差異，而這種基因多態(tài)性的差異將導(dǎo)致不同地區(qū)、不同人群葉酸代謝的差異及葉酸缺乏的不平衡性。提示對(duì)孕前女性進(jìn)行葉酸補(bǔ)充時(shí)要因人而異，不能使用統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，也不能盲目、過(guò)多地補(bǔ)充不必要的葉酸制劑，以避免引起不良后果。因此，通過(guò)對(duì)孕前女性MTHFR c.677C>T和c.1298A>C兩個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性的檢測(cè),對(duì)備孕女性進(jìn)行個(gè)體化的葉酸補(bǔ)充，從而降低先天性心臟病等出生缺陷的發(fā)生具有重要的臨床指導(dǎo)意義。

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