小腸結腸炎耶爾森菌在達烏爾黃鼠鼠疫疫源地分布及特征研究

董 麗，于慧霞，陳彩玉，王立新，王化彬，景懷琦，王 鑫

小腸結腸炎耶爾森菌在達烏爾黃鼠鼠疫疫源地分布及特征研究

董 麗1，于慧霞1，陳彩玉1，王立新1，王化彬1，景懷琦2，王 鑫2

目的 了解小腸結腸炎耶爾森菌在達烏爾黃鼠鼠疫疫源地動物中的種間帶菌分布情況及其特征，為我國小腸結腸炎耶爾森菌的研究提供科學的參考數(shù)據(jù)。方法 在達烏爾黃鼠鼠疫疫源地內選擇牧區(qū)、半農半牧區(qū)和農區(qū)3個不同生態(tài)環(huán)境，分別采集鼠類、家畜家禽動物的糞便、舌根、咽拭子及腸道內容物等樣本，進行小腸結腸炎耶爾森菌的分離、鑒定和毒力基因檢測。結果 共檢測各類樣本3 260份，檢出小腸結腸炎耶爾森菌65株，總檢出率為1.99%；豬的帶菌率最高，其攜帶O∶3/3、O∶5/1A、O∶4/4 3個血清生物型；其中O∶3/3型致病性菌株攜帶ail、ystA、yadA、VirF、rfbc毒力基因；且在牧區(qū)、半農半牧區(qū)、農區(qū)的樣本均可檢出陽性菌，以農區(qū)最高, 檢出率為9.95%。結論 小腸結腸炎耶爾森菌在內蒙古達烏爾黃鼠鼠疫疫源地中分布較廣，以農區(qū)為重；豬是致病性小腸結腸炎耶爾森菌的主要攜帶者。

達烏爾黃鼠鼠疫疫源地；小腸結腸炎耶爾森菌；病原特征；分布

小腸結腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)屬于腸桿菌科，耶爾森菌屬(Yersinia)。該菌中某些菌株對人和動物有很強的致病性,是當前國際社會廣泛關注的食源性致病菌之一[1]。人感染后能引起嚴重的腸道疾患，甚至累及肝、肺、關節(jié)等器官，嚴重者可引起敗血癥導致死亡，有個別患者的臨床表現(xiàn)(如關節(jié)疾病)極容易與布魯氏菌桿菌病混淆。同時該菌屬的致病性菌包括鼠疫耶爾森菌、假結核耶爾森菌和小腸結腸炎耶爾森菌,它們攜帶的毒力質粒PYV具有同源性,耶爾森菌僅限于初次感染，即動物被3種耶爾森菌屬中的任何一種感染，就會對另外兩種產生一定的免疫力,表明這3種近緣菌存在交叉免疫。

內蒙古赤峰市是達烏爾黃鼠鼠疫歷史疫區(qū),也是布魯氏菌病自然疫源地，因小腸結腸炎與鼠疫桿菌有較近的親緣關系，且可與布魯氏菌產生非特異性免疫反應。目前，小腸結腸炎耶爾森菌在該地區(qū)的分布情況及病原特征未見報道。為了填補這項空白該研究旨在闡明小腸結腸炎耶爾森菌在該地區(qū)的分布和病原特征，為該病的預防控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 調查區(qū)概況 內蒙古達烏爾黃鼠鼠疫疫源地內的赤峰市位于東經116°21′-120°58′，北緯41°17′-45°24′之間，總面積90 275 km2，人口460萬，是多民族集聚的地區(qū)。按動物地理區(qū)劃屬古北界、蒙新區(qū)、東部草原亞區(qū)；自然氣候屬中溫帶半干旱大陸性季風氣候區(qū)，大部分地區(qū)年平均氣溫為0～7 ℃，年降雨量在300～500 mm。為玄武巖丘陵半干旱草原地帶,草原內植物主要以大針茅、羊草為代表的禾本科的多種植物。該地區(qū)鼠疫的主要貯存宿主為達烏爾黃鼠,故稱達烏爾黃鼠鼠疫疫源地,是我國歷史悠久的鼠疫監(jiān)測點,目前本市轄12個旗(縣區(qū))，有11個旗(縣區(qū))已達到了國家穩(wěn)定控制鼠疫的標準水平，僅阿魯科爾沁旗近十余年動物間鼠疫疫情仍然活躍。

1.2 調查點選擇 赤峰市北部多為牧區(qū)，中部為半農半牧區(qū)，南部多為農區(qū)。根據(jù)本市地理位置的條件,為使本次調查具有代表性和科學性，本次在牧區(qū)、半農半牧區(qū)和農區(qū)各抽樣選擇一個調查點，進行動物樣本的采集。

1.3 樣本采集 在各調查點隨機采集鼠類和家禽家畜等標本。對鼠疫疫區(qū)內獲得的鼠類樣本首先進行鼠疫桿菌檢驗,排除鼠疫桿菌的可能。采集動物的樣本主要包括新鮮糞便、舌根、腸道內容物和咽拭子，采集的樣本裝在盛有改良磷酸鹽緩沖液的離心管(按1∶10混合)中，并置于4 ℃條件下冷增菌20 d。從2009-2013年共采集各類宿主動物樣本3 260份,其中達烏爾黃鼠1 515份，小家鼠193份，黑線倉鼠、長爪沙土鼠、三趾、五趾跳鼠等42份；豬糞771份，豬咽拭子217份，牛、驢、馬、羊、雞、鵝等家畜家禽522份。

1.4 試劑來源 耶爾森菌麥康凱選擇性培養(yǎng)基購自美國BD公司，API-20E試條購自法國梅里埃生物公司，分型血清O∶3、O∶8、O∶9單克隆抗體由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所提供，O∶4、O∶5血清型分型血清購自日本生研株式會社，生物分型試劑購自丹麥ROSCO公司。耶爾森增菌液PBS、改良克氏雙糖瓊脂、半固體瓊脂均購自北京陸橋生物科技有限公司。尿素培基購自日本榮研化學株式會社。聚合酶鏈反應PCR所有試劑均購自上海生物工程有限公司。

1.5 菌株分離培養(yǎng)和鑒定 常規(guī)操作參考小腸結腸炎耶爾森菌書中的介紹[2]。在生物安全柜中接種增菌樣品于耶爾森選擇性培基平板，25 ℃培養(yǎng)48 h；選擇形態(tài)可疑菌落接種于改良克氏雙糖瓊脂培養(yǎng)基中，在25 ℃條件下培養(yǎng)24 h；改良克氏雙糖斜面；黃/黃、不產H2S的菌落接種于尿素培基，在25 ℃條件下培養(yǎng)3 h，將分解尿素的菌株分別接種于兩管半固體培養(yǎng)基，分別在25 ℃和37 ℃條件下培養(yǎng)24 h；取25 ℃培養(yǎng)有動力且37 ℃培養(yǎng)無動力的疑似菌株，進行革蘭氏染色；對革蘭氏染色為陰性的桿菌或球桿菌進行AP1-20E系統(tǒng)生化鑒定，最后確定為小腸結腸炎耶爾森菌株。血清分型采用玻片法，生物型鑒定采用小腸結腸炎耶爾森菌生物分型指標[2]。

1.6 毒力基因檢測 常規(guī)PCR操作方法，并參照文獻[3]設計引物，引物由生物工程(上海)股份有限公司合成,所用引物序列見表1。PCR反應體系中，模板1 μL，Premix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL(20 μmol)，純水定容至20 μL，PCR反應擴增條件為：94 ℃， 5 min，94 ℃,15 s，54 ℃,30 s，72 ℃,30 s，25個循環(huán),最后72 ℃ 10 min。

表1 PCR擴增引物序列

Tab.1 Primers used in PCR amplification

引物引物序列(5'-3')產物大小/bpailForwardTAATGTGTACGCTGCGAG351ReverseGACGTCTTACTTGCACTGystAForwardATCGACACCAATAACCGCTGAG79ReverseCCAATCACTACTGACTTCGGCTystBForwardGTACATTAGGCCAAGAGACG146ReverseGCAACATACCTCACAACACCyadAForwardCTTCAGATACTGGTGTCGCTGT849ReverseATGCCTGACTAGAGCGATATCCvirFForwardGGCAGAACAGCAGTCAGACATA561ReverseGGTGAGCATAGAGAATACGTCGrfbcForwardCGCATCTGGGACACTAATTCG405ReverseCCACGAATTCCATCAAAACCA

2 結 果

2.1 菌株分離鑒定結果 從3 260份樣本中分離培養(yǎng)共檢出小腸結腸炎耶爾森菌65株，陽性檢出率為1.99%。血清學、生物化學分析，所獲65株小腸結腸炎耶爾森菌，包含了O∶3,O∶5,O∶4 3個血清型和3、4、1A三個生物型。其中O∶3/3血清生物型菌株占64.62%(42/65)，O∶5/1A血清生物型菌株占33.84%(22/65)，O∶4/4血清生物型菌株占1.54%(1/65)。結果見表2、表3。

2.2 菌株分布情況 3種不同的生境均可檢出小腸結腸炎耶爾森菌，其中牧區(qū)17株，檢出率為0.69%，半農半收區(qū)檢出7株，檢出率為1.84%；農區(qū)檢出41株，檢出率為9.95%。呈現(xiàn)牧區(qū)、半農半牧區(qū)、農區(qū)的檢菌率依次升高的趨勢，且不同生境的檢菌率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=155.05P<0.005)。豬的帶菌率最高，為6.28%(62/988)。在牧區(qū)、半農半牧區(qū)、農區(qū)3個不同環(huán)境的菌株O∶3/3血清生物型分別占各檢出菌株的5.88%(1/17)、28.57%(2/7)和95.12%(39/41)。

2.3 毒力基因檢測結果 對65株小腸結腸炎耶爾森菌進行毒力基因檢測，在65株菌中共檢測了6種毒力基因，其中22株中檢出了ystB基因,42株菌種檢出了ail、ystA、yadA、virF、rfbc基因，1株菌檢出ail、ystA、rfbc基因。詳見表3。

表2 達烏爾黃鼠鼠疫疫源地小腸結腸炎耶爾森菌宿主動物檢菌情況

Tab.2 Detection ofY.enterocoliticain animal hosts inCitellucsdauricusplague focuses

時間牧區(qū)半農半牧區(qū)農區(qū)檢測數(shù)(份)陽性數(shù)(份)陽性率%檢測數(shù)(份)陽性數(shù)(份)陽性率%檢測數(shù)(份)陽性數(shù)(份)陽性率%20094651(豬糞)0.14201097600.00201174416(鼠3、豬13)1.392297(豬)3.0625641(豬)16.02201218200.0015200.0015600.00201310000.00+-合計2467170.6938171.84412419.95

總檢出率：1.99%(65/3 260,3 260=2 467+381+412) χ2=155.05>10.60，P<0.005

表3 黃鼠鼠疫疫源地動物中小腸結腸炎耶爾森菌分型及毒力測定結果

Tab.3 Classification ofY.entorocaliticaand detection of toxicity genes inCitellusdauricusplague focuses

樣品采集時間地點宿主菌株數(shù)血清型生物型毒力基因ailystAystByadAvirFrfbc2009.07牧區(qū)豬糞1O∶51A--+---2011.04牧區(qū)豬糞5O∶51A--+---2011.05牧區(qū)黃鼠腸1O∶51A--+---2011.05牧區(qū)豬糞7O∶51A--+---2011.05牧區(qū)豬糞1O∶33++---+2011.07牧區(qū)家鼠腸2O∶51A--+---2011.09半農半牧區(qū)豬糞3O∶51A--+---2011.09半農半牧區(qū)豬糞1O∶33++-+++2011.10半農半牧區(qū)豬咽拭1O∶33++-+++2011.10半農半牧區(qū)豬咽拭2O∶51A--+---2011.10農區(qū)豬咽拭1O∶51A--+---2011.10農區(qū)豬咽拭39O∶33++-+++2011.10農區(qū)豬咽拭1O∶44++-+++合計65

※致病性菌株占42/65×100%=64.6%

3 討 論

通過對該地區(qū)小腸結腸炎耶爾森菌的分布及病原特征檢測結果分析，共在3種不同生境采集的3 260份樣本中獲得小腸結腸炎耶爾森菌65株，總檢出率為1.99%。證實了內蒙古達烏爾黃鼠鼠疫疫源地內小腸結腸炎耶爾森菌的存在，但檢出率較低。65株小腸結腸炎耶爾森菌62株分離自豬糞樣本，表明豬是小腸結腸炎耶爾森菌的主要貯存宿主，這一結果與先前報道一致[4]。65株小腸結腸炎耶爾森菌均分離自2011年，該結果可能是由采樣質量偏差或其他原因，導致究其原因有待進一步調查證實。本次調查結果顯示小腸結腸炎耶爾森菌在農區(qū)、半農半牧區(qū)、牧區(qū)均有分布。在農區(qū)、半農半牧區(qū)、牧區(qū)的檢出率依次為9.95%，1.84%、0.69%，以農區(qū)最高。因為豬是該地區(qū)小腸結腸炎耶爾森菌的主要宿主，其結果一方面可能與3種不同環(huán)境牲豬飼養(yǎng)數(shù)量的多少以及飼養(yǎng)方式有關，另一方面可能與小腸結腸炎耶爾森菌的地域性分布有一定關系[5]。

本次對65株菌的病原特征分析顯示，該疫源地內的小腸結腸炎耶爾森菌共有O∶3/3、O∶5/1A、O∶4/4三個血清生物型。O∶3/3血清生物型菌株，是我國已確定的對人有很強致病性菌株，它攜帶了ail，ystA，yadA，virF，rfbc等毒力基因[6-9]；由該菌株引發(fā)的人間疾病暴發(fā)，國內外不乏相關報道[7，10]。調查結果提示當?shù)厝巳簯攲υ摬∫鹬匾?，謹防致病性小腸結腸炎耶爾森菌感染，造成暴發(fā)流行。本次調查在農區(qū)的豬體中還發(fā)現(xiàn)了O∶4/4血清生物型小腸結腸炎耶爾森菌，經鑒定它攜帶了ail，ystA，yadA，virF，rfbc毒力基因，與其相關的分布情況及致病性等問題有待進一步調查研究。

由于布魯氏菌桿菌病與致病性小腸結腸炎耶爾森菌存在交叉免疫，所以在布魯氏菌桿菌病的診斷檢驗中應采用多種檢驗方法，提高檢驗準確性，避免誤診。本次調查未發(fā)現(xiàn)O∶9血清型小腸結腸炎耶爾森菌，但赤峰市與遼寧省相毗鄰，而同屬于達烏爾黃鼠鼠疫疫源地的遼寧省某地區(qū)曾因O∶9血清型致病性小腸結腸炎耶爾森菌感染引起該病流行，應強化監(jiān)測。

本試驗共檢測了1 500余只達烏爾黃鼠的舌根和腸內容物，僅在靠近村莊的黃鼠體中檢到一株O∶5/1A血清生物型非致病性小腸結腸炎耶爾森菌，可能除黃鼠自身帶菌外,不排除該菌株可能來自豬的交叉感染。在疫源地內鼠疫主要貯存宿主體內未檢出致病性小腸結腸炎耶爾森菌，應進一步加大達烏爾黃鼠感染小腸結腸炎耶爾森菌的監(jiān)測力度，同時開展血清學調查，從而佐證致病性耶爾森菌僅限于初次感染的觀點，為該地區(qū)的小腸結腸炎耶爾森菌引起的疾病防控提供依據(jù)。

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Pathogenic characteristic and distribution ofYersiniaenterocoliticainCitellusdauricusplague focuses,Inner Mongolia

DONG Li1,YU Hui-xia1，CHEN Cai-yu1，WANG Li-xin1，WANG Hua-bin1,JING Huai-qi2,WANG Xin2

(ChifengCenterforDiseaseControlandPrevention,Chifeng024000，China)

In order to investigate the distribution ofYersiniaenterocoliticainCitellusdauricusplague focuses in Inner Mongolia,three different ecological environ/ments were chosen as the sampling area.Feces，tongue roots throat swabs，and intestinal contents of rodent，livestock，and poultry were separately collected，and differentY.enterocoliticastrains were isolated,and identified.PCR analysis was conducted to detect the toxicity genes ofY.enterocolitica.Statiscal analysis was performed by chi-square test.Of the 3 260 samples,65Y.enterocoliticastrains were isolated and the overall detection rate was 1.99%.To include O∶3/3,O∶5/1A,O∶4/4 serum biological type,the pathogenic strain of serotype O∶3 and biological typt 3 carryinq toxicity genes ail，ystA,VirF yadA and rfbc was isolated from pigs inCitellusdauricusplague focuses， Inner Mongolia are the major carrier of pathogenicY.enterocoliticadistributed in three different ecological environment,and distributed mainly in agricultural area.

Citellusdauricusplague focuses;Yersiniaenterocolitica;pathogenic character istics;distribution Supported by the National Science and Technology Major Project (No.2009-2012ZX10004-201) Corresponding author:Wang Hua-bin，Email：wanghuabin00@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.03.012

王化彬，Email：wanghuabin00@163.com

1.內蒙古自治區(qū)赤峰市疾病預防控制中心，赤峰 024000； 2.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，北京 102206

R379

A

1002-2694(2017)03-0256-04

2016-04-21 編輯：梁小潔

國家科技重大專項課題(No.2009-2012ZX10004-201)