地黃飲子對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織超氧化物歧化酶、丙二醛及其空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

周景慧

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)· ·論著·

地黃飲子對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織超氧化物歧化酶、丙二醛及其空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

周景慧

目的 探討地黃飲子對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法 選取健康清潔級(jí)Wistar大鼠72只，雌雄不限，體質(zhì)量260～280 g，隨機(jī)分為A組、B組、模型組、正常組，每組18只。A組：在造模后每日灌服地黃飲子36 g/kg。B組：每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg。模型組：造模后胃灌鹽水1次/d。正常組：正常飲食。前3組造模：夾閉大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈，大鼠發(fā)生腦缺血再灌注損傷。灌藥3周后檢測腦組織內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)比較大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，測量大鼠腦梗死面積。結(jié)果 模型組中SOD含量[(93.42±18.78) kU/g prot]明顯低于正常組[(158.36±22.32) kU/g prot]，MDA含量[(6.35±2.04) μmol/g prot]明顯高于對(duì)照組[(2.63±1.86) μmol/g prot]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，本實(shí)驗(yàn)造模成功。A組[(135.34±20.12) kU/g prot]和B組[(132.78±19.56) kU/g prot]的SOD含量明顯高于模型組，MDA含量[A組：(3.46±1.75) μmol/g prot]，B組：(3.82±1.82) μmol/g prot]明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組和B組的學(xué)習(xí)能力和記憶能力的錯(cuò)誤次數(shù)、潛伏期均明顯少于模型組，A組和B組的潛伏期均明顯少于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組和B組的腦梗死面積均明顯小于模型組，且A組的腦梗死面積明顯小于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 地黃飲子能夠改善受損的腦細(xì)胞血液循環(huán)減少梗死面積，改善大腦的能量代謝，改善被抑制的神經(jīng)細(xì)胞，修復(fù)神經(jīng)功能缺損，保護(hù)受損的神經(jīng)元。

地黃飲子；腦缺血再灌注損傷；保護(hù)作用

地黃飲子出自《圣濟(jì)總錄》五十一卷[1]，地黃飲子具有驅(qū)毒化瘀、滋腎陰、補(bǔ)腎陽、化痰等功效，能夠促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖和遷移，補(bǔ)充缺血區(qū)的神經(jīng)元，修復(fù)神經(jīng)損傷[3]。近年來，發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，部分神經(jīng)功能缺失[4]。本研究通過地黃飲子治療腦缺血再灌注大鼠，觀察大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及對(duì)腦組織的保護(hù)作用。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

由中國醫(yī)科大學(xué)提供健康清潔級(jí)Wistar大鼠72只，編號(hào)：SCXK-LN2013-0007，雌雄不限，體質(zhì)量260～280 g。按數(shù)字表法隨機(jī)分為A組、B組、模型組、對(duì)照組，每組18只。A組、B組、模型組制造腦缺血再灌注模型。A組：每日灌服地黃飲子湯36 g/kg。B組：每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg(天津藥業(yè)生產(chǎn)，批號(hào)：20130067，規(guī)格：20 mg/片。與注射用水溶解)。模型組：造模后每日胃灌鹽水1次。正常組：正常飲食。均灌藥3周。

1.2 動(dòng)物模型的建造

用10%水合氯醛腹腔麻醉、固定，頸部正中切開，兩側(cè)分別分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并鉗夾30 min(紗布覆蓋切口創(chuàng)面)，松開動(dòng)脈夾30 min，再次鉗夾30 min，松開動(dòng)脈鉗，模型完成。

造模完成后每組隨機(jī)取出1只大鼠斷頭，取腦組織稱重，加緩沖液制成1∶9體積的腦組織勻漿液，離心后取上清液，采用羥胺法測定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量(參照南京建成生物研究所的說明書進(jìn)行)。

1.3 藥物配方

參照《黃帝素問宣明論方》配制地黃飲子方法：熟地黃12 g、山茱萸15 g、炮附子15 g、白茯苓12 g、石斛15 g、麥門冬15 g、菖蒲12 g、巴戟天15 g、肉蓯蓉15 g、官桂10 g、五味子10 g、遠(yuǎn)志10 g。煎煮2次，每次1 h，將2次藥液混合，用旋轉(zhuǎn)儀蒸發(fā)濃縮，干燥密封。

1.4 儀器

中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)部提供Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)記錄儀和跳臺(tái)儀，光學(xué)顯微鏡。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)共4 d，每天訓(xùn)練3次，每次1 min，訓(xùn)練場地由一圓形水池和移動(dòng)平臺(tái)組成，水池上方有攝像機(jī)和監(jiān)視器與電腦連接，記錄大鼠的游行軌跡、路程、到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間(潛伏期)。實(shí)驗(yàn)前將池中注入清水和牛奶，使水池變成不透明的顏色，水溫保持在24 ℃，水池分為4個(gè)象限，并在密室內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)前1 d將大鼠放入水池中適應(yīng)環(huán)境2 min。第2天開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，大鼠在池中1 min內(nèi)若未能找到平臺(tái)，潛伏期為60 s，在平臺(tái)上休息60 min后再次重復(fù)訓(xùn)練，每只大鼠訓(xùn)練3次，連續(xù)訓(xùn)練4 d，分別記錄每只的錯(cuò)誤次數(shù)和潛伏期。

1.5.2 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 定位航行實(shí)驗(yàn)后在跳臺(tái)記錄儀上進(jìn)行，檢測大鼠快速記憶的潛伏期。實(shí)驗(yàn)前大鼠先適應(yīng)環(huán)境5 min后通電，每日每只大鼠訓(xùn)練3次，電腦記錄大鼠在3 min內(nèi)雙足同時(shí)跳上絕緣臺(tái)次數(shù)和潛伏期。連續(xù)訓(xùn)練5 d。

1.6 測量大鼠腦梗死面積

定位航行實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭取腦，間隔2 mm連續(xù)冠狀切片，快速加入1%2，3，5-三苯基四氮唑的磷酸液中進(jìn)行TTC染色，用電鏡圖像分析腦組織內(nèi)梗死面積比值(梗死面積/視野下全腦面積)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)使用ANOVA分析，用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 地黃飲子對(duì)大鼠腦組織內(nèi)SOD、MDA含量的影響

模型組中SOD含量明顯低于正常組，MDA含量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，本實(shí)驗(yàn)造模成功。A組和B組的SOD含量明顯高于模型組，MDA含量明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 地黃飲子對(duì)大鼠腦組織內(nèi)SOD、MDA含量的影響(x±s)

注：與正常組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。SOD：超氧化物歧化酶，MDA：丙二醛。A組：每日灌服地黃飲子湯36 g/kg，B組：每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg

2.2 地黃飲子對(duì)大鼠定位航行能力的影響

模型組的學(xué)習(xí)能力和記憶能力的錯(cuò)誤次數(shù)、潛伏期均明顯多于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組和B組的學(xué)習(xí)能力和記憶能力的錯(cuò)誤次數(shù)、潛伏期均明顯少于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 地黃飲子對(duì)大鼠定位航行能力的影響(x±s)

注：與正常組比較aP<0.05;與模型組比較bP<0.05。A組：每日灌服地黃飲子湯36 g/kg，B組：每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg

2.3 地黃飲子對(duì)大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)潛伏期的影響

模型組的潛伏期均明顯長于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組和B組的潛伏期均明顯短于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.4 地黃飲子對(duì)大鼠腦梗死面積的影響

模型組的腦梗死面積為38.36%，正常組腦梗死面積為0。A組和B組的腦梗死面積均明顯小于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且A組的腦梗死面積明顯小于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表3 地黃飲子對(duì)大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)潛伏期的影響(s，x±s)

注：與正常組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。A組：每日灌服地黃飲子湯36 g/kg，B組：每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg

表4 地黃飲子對(duì)大鼠腦梗死面積的影響(%)

注：與正常組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。A組：每日灌服地黃飲子湯36 g/kg，B組：每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg

3 討論

腦缺血再灌注導(dǎo)致腦內(nèi)氧自由基產(chǎn)生、細(xì)胞炎性因子釋放，刺激海馬區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖，但是由于細(xì)胞膜的通透性改變、細(xì)胞水腫、細(xì)胞能量代謝障礙、神經(jīng)功能損傷，增殖的神經(jīng)細(xì)胞很難遷移至缺血區(qū)，分化并補(bǔ)充受損的神經(jīng)元。有研究發(fā)現(xiàn)[5-6]，而地黃飲子對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的增殖和遷移起重要作用，它能夠促進(jìn)缺血區(qū)SDF1、CXCR4、BDNF蛋白表達(dá)增加，SDF1、CXCR4、BDNF均具有調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)元信息傳遞、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖粘附、調(diào)節(jié)新生神經(jīng)元分化、修復(fù)受損的神經(jīng)元等作用，因此，地黃飲子[7]能夠修復(fù)受損的神經(jīng)元，保護(hù)腦神經(jīng)。SOD和MDA是體內(nèi)常見的抗氧化因子，SOD的作用是直接清除因氧化反應(yīng)產(chǎn)生的氧自由基，MDA作用是脂質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)后代謝產(chǎn)物，都代表發(fā)生氧化反應(yīng)的程度[8]。

有研究證實(shí)[9]，腦組織缺血缺氧導(dǎo)致腦組織內(nèi)SOD含量降低、MDA含量增高，而本實(shí)驗(yàn)測得模型組SOD含量減少、MDA含量增高，證實(shí)模型制作成功。因此本實(shí)驗(yàn)證實(shí)地黃飲子能夠提高腦組織內(nèi)抗氧化的能力，減少細(xì)胞發(fā)生氧化損傷；同時(shí)地黃飲子改善腦組織細(xì)胞膜的通透性，延緩大腦衰老，保護(hù)腦細(xì)胞的作用。

水迷宮實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)是較好的測試大腦空間學(xué)習(xí)、記憶能力的工具。本實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果地黃飲子灌喂后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)，腦梗死面積減少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)地黃飲子能夠改善受損的腦細(xì)胞血液循環(huán)減少梗死面積，改善被抑制的神經(jīng)細(xì)胞，修復(fù)神經(jīng)功能缺損，保護(hù)受損的神經(jīng)元，改善大腦的能量代謝，減輕海馬區(qū)損傷的神經(jīng)元，最終提高了學(xué)習(xí)記憶能力，同時(shí)地黃飲子能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和遷移到受損腦區(qū)，修復(fù)腦神經(jīng)細(xì)胞的正常功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與成金枝等[10]的結(jié)果一致，

綜上所述，地黃飲子可改善神經(jīng)細(xì)胞遷移，修復(fù)受損的神經(jīng)元，為研究中藥促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生的作用機(jī)制，提供了新的研究思路。

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(本文編輯：林永麗)

Protective effects of rehmannia Yinzi on ischemic injury induced by reperfusion in rats

ZhouJinghui

(AffiliatedHospitalofLiaoningChineseHerbalMedicineUniversity,Shenyang110032,China)

Objective To explore the protective effects of rehmannia Yinzi on ischemic injury induced by reperfusion in rats.Methods Seventy-two clean-grade Wistar rats with a body weight of 260-280 g were randomly divided into 4 groups: group A, group B, the model group and the normal control group, each consisting of 18 animals. For the animals of group A, rehmannia Yinzi liquid was given by gavage at a dose of 36 g/kg following development of the model, and for animals of group B, nimodipine was given also by gavage at a dose of 12.5 mg/kg. The animals of the model group received physiological saline by gavage following development of the model, and the animals of the control group received normal feed. In the animals of the former 3 groups, bilateral common carotid artery was clipped to develop the ischemia model, and then, blood reperfusion was performed to induce ischemic injury. Three weeks after gavage of rehmannia Yinzi, the levels of superoxide dismutase(SOD)and malondiadehyde(MDA)were detected in the brain tissue. Morris water maze experiment and platform-jump experiment were performed to detect the learning and memory capacity of the rats, and the area of infarction was measured as well.Results SOD level [(93.42±18.78) kU/g prot] in the model group was obviously lower than that of the normal control group [(158.36±22.32) kU/g prot], but MDA level [(6.35±2.04) μmol/g prot] was significantly higher than that of the control group, [(2.63±1.86) μmol/g prot], and statistical significance could be noticed, when comparisons were made between the 2 groups(P<0.05). The animal model was successfully developed. The SOD levels of group A [(135.34±20.12) kU/g prot] and group B [(132.78±19.56) kU/g prot] were significantly higher than those of the model group, and the MDA levels of group A [ (3.46±1.75) μmol/g prot] and group B [ (3.82±1.82) μmol/g prot] were significantly lower than those of the model group. Statistical significance could also be noted, when comparisons were made between the 2 groups(P<0.05). The rate of learning and memory errors, as well as latency were all significantly lower than those of the model group, and the latency of group A and group B were significantly shorter than that of the model group. Statistical significance could be found, when comparisons were made between the 2 groups(P<0.05). The areas of cerebral infarction in group A and group B were significantly smaller than that of the model group, and the area of cerebral infarction in group A was significantly smaller than that in group B, also with statistical significance(P<0.05).Conclusion Rehmannia Yinzi liquid could improve blood circulation in the damaged brain tissues, reduce the area of infarction, improve energy metabolism in the damaged brain, enhance suppressed nerve cells, repair nerve function defect, and also help to protect the damaged neurons.

Rehmannia Yinzi; Cerebral ischemia-reperfusion injury; Protective effect

110032 沈陽，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院

Q95-33

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2017.02.009

2016-04-08)