家蠶微粒子檢測(cè)新方法的探索

鄒邦興 周安蓮 肖文福 張友洪 肖金樹

家蠶微粒子檢測(cè)新方法的探索

鄒邦興 周安蓮 肖文福 張友洪 肖金樹

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，四川 南充 637000）

目前，蠶種質(zhì)檢單位在微粒子檢測(cè)上都沿用巴斯德提出的母蛾顯微鏡檢法，而該方法的使用在很大程度上取決于鏡檢人員的操作技能、專業(yè)判斷、業(yè)務(wù)素質(zhì)及設(shè)備情況，其檢測(cè)結(jié)果與人員的操作息息相關(guān)。因此，當(dāng)下能否找到一種實(shí)用、簡(jiǎn)單、對(duì)人員要求低、高效快速的新方法值得蠶業(yè)工作者去探索。

蠶種 微粒子檢測(cè) 方法

蠶桑行業(yè)在我國(guó)有著幾千年的歷史底蘊(yùn)，封建社會(huì)時(shí)期栽桑養(yǎng)蠶成為養(yǎng)蠶農(nóng)家的主要經(jīng)濟(jì)來源，然而隨著現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，我國(guó)的蠶桑行業(yè)受到極大影響。從20世紀(jì)90年代開始，蠶桑行業(yè)逐年下滑，其中主要的因素是勞動(dòng)力外出和蠶病危害，尤以微粒子病破壞嚴(yán)重。根據(jù)巴斯德的研究，家蠶微粒子病的病原是原生動(dòng)物中的家蠶微粒子蟲，在顯微鏡下觀察其孢子一般為卵圓形，呈淡綠色，有折光性（如圖1）。微孢子由孢子壁，極膜層，極絲，孢原質(zhì)和后極泡組成［1］。此外還發(fā)現(xiàn)微粒子是唯一可以通過母蛾胚胎傳播給下一代的蠶病。為了避免該病的發(fā)生，每年蠶種生產(chǎn)單位都必須對(duì)產(chǎn)卵母蛾對(duì)號(hào)入座進(jìn)行顯微鏡檢查，將帶毒的母蛾所產(chǎn)下的蠶卵按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定嚴(yán)格淘汰，保證蠶種健康。顯微鏡檢法多年來一直為各國(guó)蠶桑行業(yè)用來檢疫微粒子病的有效途徑，其效果也是有目共睹的。該方法的使用主要依靠鏡檢人員對(duì)每個(gè)玻片觀察5至10個(gè)左右視野來判斷母蛾是否帶毒而進(jìn)行淘汰，因此蠶種檢測(cè)工作對(duì)鏡檢人員的操作技能、專業(yè)判斷、業(yè)務(wù)素質(zhì)及設(shè)備情況要求很高，而這些人為因素和客觀條件都有可能造成我們?cè)阽R檢環(huán)節(jié)中把帶毒不合格蠶卵當(dāng)成健康蠶卵投放到生產(chǎn)上去，從而給蠶業(yè)行業(yè)帶來災(zāi)難性破壞。

圖1 顯微鏡檢下的微孢子

1 當(dāng)前母蛾鏡檢中存在的問題

1.1 鏡檢視野是否不足

目前鏡檢單位通常按蠶種分類來制定鏡檢標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)于一代雜交種，其鏡檢視野一般在5至10個(gè)左右，如果觀察的視野中沒發(fā)現(xiàn)微粒子孢子，我們可以初步判定該母蛾不帶毒，其產(chǎn)下的蠶卵也就表示健康，待按標(biāo)準(zhǔn)抽取對(duì)應(yīng)批次蠶卵催青后對(duì)蟻蠶進(jìn)行檢驗(yàn)檢疫后方可最終確定該批蠶種是否可以投入生產(chǎn)使用；對(duì)于原種、原原種的檢驗(yàn)，我們則更為嚴(yán)格，采取對(duì)檢方法，每各玻片通常觀察10個(gè)視野。無論是一代雜交種還是原種、原原種的檢驗(yàn)，都是需要耗費(fèi)大量人力，且檢驗(yàn)過程也相對(duì)繁瑣。每年的蠶種檢測(cè)工作時(shí)間比較集中，工作量大，我們的檢測(cè)人員長(zhǎng)時(shí)間在顯微鏡下觀看，難免會(huì)出現(xiàn)視野不足，從而不能全面判斷。同時(shí)，有的玻片里面微粒子孢子較少，不易發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)人員個(gè)人原因就有可能把帶毒的蠶種誤判為健康蠶卵，從而讓其流入生產(chǎn)。這也解釋了我們每年進(jìn)行嚴(yán)格的蠶種檢測(cè)與淘汰，而微粒子依然存在的原因（當(dāng)然這其中不乏養(yǎng)蠶過程中遭到微粒子的入侵，但是也不能否認(rèn)蠶卵自身帶微粒子）。

1.2 根據(jù)帶毒率進(jìn)行蠶種淘汰

目前蠶種檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的有毒淘汰率比較嚴(yán)格，若原種檢測(cè)出有毒母蛾數(shù)在全部母蛾數(shù)中超過2‰這一比例，則整批原種就必須淘汰；對(duì)于一代雜交種，則按有毒母蛾集團(tuán)數(shù)不超過5‰為淘汰標(biāo)準(zhǔn)。這種寧錯(cuò)勿放的原則給制種單位帶了極大挑戰(zhàn)，本來生產(chǎn)的一批原種中只有幾個(gè)蛾區(qū)檢測(cè)出帶毒，而這一比例剛好超過2‰，都必須把這批蠶種中健康的蠶種全部一起銷毀，這不僅是一種資源浪費(fèi)，而且對(duì)制種單位來講更是耗材耗力。

1.3 對(duì)人員要求高

我們的微粒子孢子鏡檢工作主要是通過專業(yè)人員對(duì)鏡檢區(qū)域觀察，然后判定我們的樣品是否帶毒，而這一環(huán)節(jié)與檢測(cè)人員專業(yè)操作技能、專業(yè)判斷、業(yè)務(wù)素質(zhì)有很大關(guān)聯(lián)。因此母蛾顯微鏡檢對(duì)人員要求極高，不僅要求檢測(cè)人員要有豐富的理論知識(shí)，而且還需具備多年鏡檢經(jīng)驗(yàn)。在當(dāng)前從事蠶桑行業(yè)的各個(gè)單位，專業(yè)新生力量缺乏，人員結(jié)構(gòu)不合理，急需大量的專業(yè)人才加入來充實(shí)行業(yè)隊(duì)伍。

2 微粒子檢測(cè)新方法的發(fā)展探索

當(dāng)前科學(xué)技術(shù)發(fā)達(dá)，我們可以充分利用科學(xué)技術(shù)帶來的便利，找到一種高效、快速、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確無誤、檢測(cè)靈敏度高的新方法來取代母蛾顯微鏡檢法。對(duì)于微粒子檢測(cè)新方法的探索，本文主要從以下三個(gè)方向闡述目前在微粒子檢測(cè)中研發(fā)的新方法、新技術(shù)。

2.1 試紙顯色檢驗(yàn)法

該方法目前在很多檢測(cè)領(lǐng)域都有使用，其特點(diǎn)是快速、高效、易鑒別、且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確無誤，最明顯的例子就是pH試紙?jiān)跈z測(cè)液體酸堿性方面的使用，根據(jù)所取樣本在試紙上的顯色情況，在酸堿顯色圖上對(duì)比顏色就能簡(jiǎn)單判斷該樣本液體的pH值大小。同理我們也可以根據(jù)微粒子孢子的結(jié)構(gòu)分析，找到其中一種物質(zhì)能夠用顯色反應(yīng)來來鑒定，然后制作試紙，在檢測(cè)微粒子孢子時(shí)只需要把母蛾研磨，取一滴研磨液置于試紙上，如有顯色則判定為該母蛾帶毒，對(duì)應(yīng)淘汰所產(chǎn)蠶卵。這種方法在使用上省時(shí)省力，操作簡(jiǎn)單，對(duì)人員要求不高，符合當(dāng)前檢種需要，而且檢測(cè)結(jié)果比顯微鏡檢法可靠。目前已有報(bào)道的是微粒子試紙檢測(cè)研究｛2｝，只是該研究中使用的試紙對(duì)檢測(cè)的微粒子顯色較淺，不容易觀察，但是至少證實(shí)了該方法可以在家蠶微粒子診斷上得到應(yīng)用。

2.2 熒光染色法

劉吉平［3］等探討了應(yīng)用熒光染色劑CalcofluorWhiteM2R鑒別微孢子，結(jié)果證明在顯微鏡下微孢子被染上青藍(lán)色熒光，而寄主的組織碎片、病毒、細(xì)菌等均不被染色，具有高度特異性。但該方法只局限于實(shí)驗(yàn)室使用，因?yàn)樗鼘?duì)操作設(shè)備要求高，對(duì)于生產(chǎn)檢測(cè)尚無法投入。該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。

2.3 PCR檢測(cè)技術(shù)

目前有報(bào)道的關(guān)于使用PCR技術(shù)在微粒子檢測(cè)上的研究有許多，如魯興萌［4］等應(yīng)用PCR在微粒子檢測(cè)應(yīng)用中的研究；劉駿［5］等應(yīng)用PCR試劑盒診斷微粒子等。這些新興方法的研究確實(shí)能夠檢測(cè)出微粒子，但其不足之處在于應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)微孢子的問題主要集中在檢測(cè)的靈敏度不高、特異性不夠及成本高等，由此限制了PCR技術(shù)在生產(chǎn)上的應(yīng)用，不過這也為今后的檢測(cè)方法指明了一個(gè)方向。

3 討論

傳統(tǒng)的顯微鏡檢法雖然是當(dāng)前各蠶種檢驗(yàn)單位主要的檢測(cè)方法，但是經(jīng)過多年使用，其存在的問題也越來越多。為了有效解決當(dāng)前母蛾鏡檢法中存在的不足，確保在檢查過程中做到檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確無誤，我們有必要找到一種高效、快速、省時(shí)省力的新方法來代替母蛾顯微鏡檢法。新方法的使用必須具備高效快速、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確無誤、操作簡(jiǎn)單、對(duì)人員不高，同時(shí)也省時(shí)省力，符合目前蠶種生產(chǎn)檢驗(yàn)需求。文中提到的三個(gè)方向均是在實(shí)驗(yàn)室條件下應(yīng)用研究的，具體落實(shí)在生產(chǎn)上還需大量研究，其中試紙顯色檢測(cè)法最有可能成為今后取代母蛾顯微鏡檢法的一種新技術(shù)，相比其他兩種方法，試紙顯色檢測(cè)具備操作簡(jiǎn)單、高效快速、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，相信經(jīng)過全國(guó)蠶桑行業(yè)從業(yè)人員共同努力，新方法、新技術(shù)終究會(huì)有來臨的一天。

［1］金偉.家蠶病理學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001：148－150.

［2］蘆琨.家蠶微粒子病免疫學(xué)快速檢測(cè)試紙條的研制［D］.［碩士學(xué)位論文］.重慶：西南大學(xué)，2009.

［3］劉吉平，曾玲.CalcofluorWhiteM2R熒光染色法識(shí)別家蠶微孢子蟲［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2007，50（11）：1185－1186.

［4］魯興萌，李光才，孟祥坤等.家蠶微粒子病的PCR檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2011，37（5）；0878－0882.

［5］劉駿，錢科，沈中元.家蠶微粒子病PCR快速檢測(cè)技術(shù)研究及診斷試劑盒的研制［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2009，26（10）：49.

鄒邦興（1989－），男，本科，研究實(shí)習(xí)員，主要從事家蠶品種選育及推廣。

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（蠶桑）專項(xiàng)；四川省“十三五”農(nóng)作物育種攻關(guān)項(xiàng)目；四川省“十三五”財(cái)政創(chuàng)新能力提升工程專項(xiàng)。