寵物食品中肉毒桿菌LAMP檢測(cè)方法的研究

陳宇飛，楊 柳，杜德偉，王 磊，孫如一，隋 馨

（1.吉林工商學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130507； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；3.吉林省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，吉林長(zhǎng)春 130062）

寵物食品中肉毒桿菌LAMP檢測(cè)方法的研究

陳宇飛1，楊 柳1，杜德偉1，王 磊1，孫如一2，隋 馨3

（1.吉林工商學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130507； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；3.吉林省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，吉林長(zhǎng)春 130062）

為研究寵物食品中肉毒桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法，本試驗(yàn)根據(jù)肉毒桿菌特異性基因片段（NtnH）設(shè)計(jì)1組引物，應(yīng)用LMAP技術(shù)，通過(guò)擴(kuò)增肉毒桿菌和14種非肉毒桿菌基因片段，對(duì)建立的LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行最佳溫度及反應(yīng)時(shí)間篩選試驗(yàn)、采用濁度法和染色法進(jìn)行特異性試驗(yàn)以及與PCR對(duì)比的敏感性試驗(yàn)。結(jié)果表明：建立的LAMP反應(yīng)體系只擴(kuò)增肉毒桿菌基因，特異性良好；體系最佳反應(yīng)溫度為64℃，最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min；最低檢測(cè)濃度為0.0001 pg/μL，比PCR高出10倍。本試驗(yàn)所建立的方法特異性好、靈敏度高，反應(yīng)時(shí)間短，適用于寵物食品中肉毒桿菌的檢測(cè)。

肉毒桿菌；LMAP技術(shù)；PCR；濁度法

肉毒中毒主要是由肉毒桿菌（Clostridium Botulinum）產(chǎn)生的肉毒神經(jīng)毒素引起的一種病死率極高的周圍神經(jīng)麻痹性疾病[1]。肉毒桿菌按其產(chǎn)生毒素的血清學(xué)特性可分為A～G 7個(gè)型，其中引起人肉毒中毒的主要是A、B、E 3個(gè)型，且不同的國(guó)家及地區(qū)肉毒中毒的型別具有地域性差別，我國(guó)以A型的發(fā)生頻率居首位[2]。肉毒毒素對(duì)酸的抵抗力特別強(qiáng)，胃酸溶液24 h內(nèi)不能將其破壞，繼而可被胃腸道吸收，損害身心健康[3]。純的1 mg肉毒毒素能殺死2億只小鼠，毒性極大。

寵物食品專門為寵物、小動(dòng)物提供，是介于人類食品與傳統(tǒng)畜禽飼料之間的高檔動(dòng)物食品[4]。若寵物食品及其原料污染了肉毒桿菌，其產(chǎn)生的菌毒素A將會(huì)對(duì)寵物造成極大的傷害。近些年，寵物市場(chǎng)逐步興起，因此寵物食品中肉毒桿菌的檢測(cè)對(duì)寵物保健行業(yè)的發(fā)展十分重要。

Notomi等[5]在2000年發(fā)明環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技 術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP），可以在等溫條件下實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增。LAMP技術(shù)的反應(yīng)原理是根據(jù)序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)的1對(duì)外引物、1對(duì)內(nèi)引物和1對(duì)環(huán)引物特異性識(shí)別靶序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在60～65℃條件下60 min內(nèi)，大量合成目標(biāo)DNA 的同時(shí)，伴隨有副產(chǎn)物白色的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生。由于LAMP擴(kuò)增過(guò)程依賴識(shí)別靶序列6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，所以反應(yīng)特異性強(qiáng)。核酸擴(kuò)增過(guò)程是在恒溫條件下進(jìn)行，檢測(cè)時(shí)間大大縮短，反應(yīng)快速敏感。目前，LAMP技術(shù)在細(xì)菌和病毒檢測(cè)、耐藥基因檢測(cè)[6]、寄生蟲檢測(cè)[7]、胎兒性別鑒定等方面被廣泛應(yīng)用。黃金海等[8]研究了食品中沙門菌LAMP 快速檢測(cè)方法，可用于沙門氏菌污染食品的快速檢測(cè)；孫園園等[9]建立了動(dòng)物飼料中沙門菌LAMP快速診斷方法，對(duì)24份樣品的3次檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法完全一致；苑昊[10]將LAMP技術(shù)與微流控技術(shù)結(jié)合，檢測(cè)環(huán)境中的金黃色葡萄球菌，使DNA的釋放、擴(kuò)增以及結(jié)果的觀察集成在一個(gè)長(zhǎng)寬均為厘米級(jí)別的芯片中，完成高通量的檢測(cè)。本研究根據(jù)肉毒桿菌特異性基因序列，建立寵物食品中肉毒桿菌LAMP快速檢測(cè)方法，專門對(duì)寵物食品及原料進(jìn)行特異性檢測(cè)，對(duì)肉毒桿菌的監(jiān)測(cè)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌種 菌種來(lái)源于北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司，菌種的活化、核酸提取等在該公司的二級(jí)病原微生物實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 試劑與儀器 LAMP法熒光檢測(cè)試劑盒（DNA Amplification Kit）產(chǎn)自日本榮研化學(xué)株式會(huì)社；LAMP反應(yīng)管（Reaction Tube）產(chǎn)自日本榮研化學(xué)株式會(huì)社；熒光染料（Fluorescent Detection Reagent，F(xiàn)D）產(chǎn)自日本榮研化學(xué)株式會(huì)社；Chelex-100、甜菜堿來(lái)自Sigma 公司；氯化錳、硫酸鎂、氯化鉀、氫氧化鈉、EDTA、硫酸銨購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Tris-HCl來(lái)自上海生科生物科技有限公司； Triton X-100來(lái)自北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司；dNTP來(lái)自Pharmacia公司；NP-40來(lái)自Fluka公司；2×Tap MIX試劑盒產(chǎn)自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖來(lái)自Amresco公司。

La-320C實(shí)時(shí)濁度儀來(lái)自日本榮研化學(xué)株式會(huì)社；CHB-100HB-100型恒溫金屬浴來(lái)自杭州博日科技有限公司；NanoDrop ND-1000型分光光度計(jì)來(lái)自凱樂(lè)博（北京）科技發(fā)展有限公司；ST5型凝膠成像儀來(lái)自VILBER公司；ETC811型基因擴(kuò)增儀來(lái)自蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA 模板的制備 使用TIANGEN 核酸提取試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)菌基因組 DNA。其中通過(guò)對(duì)肉毒桿菌基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，自行設(shè)計(jì)肉毒桿菌靶基因序列，并對(duì)此靶序列在美國(guó)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行比對(duì)檢索，其特異性較好。根據(jù)該基因序列，人工合成該基因片段。

1.3.2 LAMP反應(yīng)引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)LAMP引物設(shè)計(jì)軟件網(wǎng)址（http://primerexplorer.jp/e/）進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)，將待擴(kuò)增的DNA 分為6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，根據(jù)這6個(gè)區(qū)域分別設(shè)計(jì)LAMP 反應(yīng)所需引物（內(nèi)引物FIP和BIP、外引物F3和B3、環(huán)引物L(fēng)B和LF），設(shè)計(jì)LAMP引物擴(kuò)增靶基因：

肉毒桿菌基因序列片段及引物合成由上海生工生物科技有限公司完成。

1.3.3 LAMP 反應(yīng)體系的建立 25 μL反應(yīng)混合物包括：12.5 μL 2×反應(yīng)液(終反應(yīng)液離子濃度：20 mmol/L Tris-HCl ,pH為 8.8，10 mmol/L KCl，10 mmol/L（NH4）2SO4，0.1% Triton X-100，0.8 mol/L 甜菜堿，8 mmol/L MgSO4，1.4 mmol/L dNTP)，1 μL 8 U Bst DNA 聚合酶，2.6 μL引物混合液（終引物濃度：40 pmol/L FIP 和BIP，5 pmol/L F3 和B3，20 pmol/L LB和LF），2 μL引物模板，6.9 μL雙蒸水補(bǔ)齊 。將混合物置于60～65℃恒溫反應(yīng)60 min左右。以雙蒸水為陰性對(duì)照。

表1 試驗(yàn)用對(duì)照菌種

1.3.4 LAMP檢測(cè)方法 濁度法的反應(yīng)過(guò)程:

其中，Mg2P2O7為焦磷酸鎂，為白色沉淀。利用實(shí)時(shí)濁度儀LA-320c進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)量，每隔6 s測(cè)定反應(yīng)管的濁度，繪制成曲線來(lái)判斷反應(yīng)的陰陽(yáng)性。

熒光染色法：鈣黃綠素是一種金屬離子指示劑，根據(jù)反應(yīng)液中鎂離子的變化而呈現(xiàn)出不同的顏色，陰性時(shí)為橙色，陽(yáng)性時(shí)為綠色。

1.3.5 最佳溫度篩選試驗(yàn) 利用建立的LAMP反應(yīng)體系，對(duì)引物進(jìn)行最佳溫度篩選試驗(yàn)，設(shè)置溫度從60～67℃，梯度為1℃，根據(jù)起峰時(shí)間和出峰高點(diǎn)，測(cè)定LAMP最佳反應(yīng)溫度。

1.3.6 特異性試驗(yàn) 利用建立的LAMP反應(yīng)體系，肉毒桿菌基因組為陽(yáng)性樣品，以福氏志賀氏菌、大腸埃希氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌、肺炎鏈球菌、屎腸球菌、副溶血性弧菌、表皮葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、乳房鏈球菌等14株菌（表1）以及雙蒸水樣品作為對(duì)照，進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.3.7 LAMP 、PCR方法敏感性對(duì)比試驗(yàn) 為了驗(yàn)證LAMP 方法的檢測(cè)靈敏度，以肉毒桿菌基因組為檢測(cè)對(duì)象，定量后將總DNA進(jìn)行10 倍稀釋度稀釋，使得最終核酸濃度分別為1、100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001 pg/μL，并以雙蒸水作為陰性對(duì)照。然后進(jìn)行LAMP反應(yīng)，分別采用染色法和濁度法來(lái)檢測(cè)結(jié)果。

將10倍梯度稀釋的基因組用于PCR反應(yīng)。引物為F3、 B3。PCR 反應(yīng)總體積25 μL：1 μL模板、10 pmol各引物、12.5 μL 2×Taq MIX。擴(kuò)增循環(huán)條件：95℃預(yù)變性5 min，之后95℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后延伸7 min。取PCR 產(chǎn)物10 μL，在1%含EB瓊脂糖凝膠電泳上120 V 電泳35 min，在凝膠成像系統(tǒng)下照像檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳溫度篩選 由圖1可以看出，在60～67℃時(shí)，都能發(fā)生LAMP反應(yīng)。但不同溫度下，LAMP反應(yīng)的起峰時(shí)間和出峰高點(diǎn)不同。隨著溫度的升高，呈現(xiàn)出峰時(shí)間先縮短，之后再增長(zhǎng)的趨勢(shì)。當(dāng)溫度為64℃時(shí)，出峰時(shí)間最短（18 min）。該溫度下，當(dāng)LAMP反應(yīng)60 min時(shí)，出峰最高。因此，將最佳溫度定在64℃，反應(yīng)時(shí)間定為60 min。

圖1 最佳溫度篩選試驗(yàn)結(jié)果

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果 由圖2可以看出，只有肉毒桿菌基因組樣品發(fā)生了LAMP反應(yīng)，其他14個(gè)菌種的核酸及陰性對(duì)照樣本均未發(fā)生LAMP反應(yīng)。因此，可以確定本試驗(yàn)建立的LAMP反應(yīng)體系特異性良好。由圖3也可以看出，只有第15號(hào)（肉毒桿菌）離心管發(fā)生了顏色反應(yīng)，即具有較好的特異性。

圖2 特異性試驗(yàn)結(jié)果（濁度檢測(cè)）

2.3 最佳引物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果及與PCR的比較將10倍梯度稀釋的肉毒桿菌基因組模板用于LAMP反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果見圖4～5。濁度法與染色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，LAMP最低檢測(cè)濃度為0.0001 pg/μL。由圖6可知，PCR最低檢測(cè)濃度為0.001 pg/μL?？梢?，LAMP反應(yīng)的敏感性要優(yōu)于PCR反應(yīng)。

3 結(jié) 論

圖3 特異性試驗(yàn)結(jié)果（目視熒光檢測(cè)）

圖4 最佳引物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果（濁度檢測(cè)）

圖5 最佳引物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果（目視熒光檢測(cè)）

圖6 PCR敏感性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本文研究了寵物食品中肉毒桿菌LAMP檢測(cè)方法。根據(jù)肉毒桿菌特異性基因序列，人工合成肉毒桿菌基因片段，以14種食品中常見細(xì)菌作對(duì)照，對(duì)建立的LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行溫度篩選試驗(yàn)、最佳反應(yīng)時(shí)間試驗(yàn)、采用濁度法和染色法進(jìn)行特異性試驗(yàn)以及與PCR對(duì)比的敏感性試驗(yàn)。結(jié)果表明，建立的LAMP反應(yīng)體系只擴(kuò)增肉毒桿菌，對(duì)其他14種食品中常見的細(xì)菌均沒(méi)有擴(kuò)增，特異性良好；體系最佳反應(yīng)溫度為64℃，最早出峰時(shí)間為18 min，最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min；最低檢測(cè)濃度為0.0001 pg/μL，比PCR（0.001 pg/μL）高出10倍。本方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便，可以用來(lái)檢測(cè)寵物食品中的肉毒桿菌。

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Study on Detection Method for LAMP Technique in Clostridium Botulinum of Pet Food

CHEN Yu-fei1, YANG Liu1, DU De-wei1, WANG Lei1, SUN Ru-yi2,SUI Xin3
(1.Department of Food Engineering, Jilin Business and Technology College, Jilin Changchun 130507, China; 2. College of Life Science, Jilin Agricultural University, Jilin Changchun 130118, China; 3. Jilin Medical Instrument Inspection Institute, Jilin Changchun 130062,China)

The detection method for LAMP technique in Clostridium botulinum of pet food was studied in the paper. A set of primers was designed according to the specif i c gene(NtnH)fragments of Clostridium botulinum. Through ampilifying gene fragments of Clostridium botulinum and 14 nonClostridium botulinum, screening test of optimum temperature and response time on LAMP reaction system, specif i c test by using nephelometry and staining method, sensitivity test of that compared to PCR were studied. The result demonstrated that LAMP only amplif i ed gene of Clostridium botulinum, and had a good specif i city. The optimum response temperature of the system was 64℃, and the optimum response time was 60 min. The minimum detectable concentration was 0.0001 pg/μL, which was 10 times higher than PCR. The method established by the study had a good specificity and high sensitivity and short response time, which was adapt to the detection for Clostridium botulinum of pet food.

Clostridium botulinum; LAMP technique; PCR; Nephelometry

TS207.4

A

10.19556/j.0258-7033.2017-04-127

2016-11-02；

2016-11-15

中國(guó)農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2016開放基金；吉林省科技廳2015年重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（20150204064NY）

陳宇飛（1968-），男，教授，本科，主要從事食品安全檢測(cè)研究，E-mail:254447088@163.com