美洲大蠊提取物對大鼠卵巢卵泡發(fā)育的影響

隋世燕，張成桂，徐取尉，梁 先，楊杰予

（1. 大理大學(xué)云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000；2. 大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

美洲大蠊提取物對大鼠卵巢卵泡發(fā)育的影響

隋世燕1,2，張成桂1，徐取尉2，梁 先2，楊杰予2

（1. 大理大學(xué)云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000；2. 大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

實(shí)驗(yàn)旨在研究美洲大蠊提取物是否對大鼠卵巢卵泡發(fā)育產(chǎn)生影響。將成年SD大鼠隨機(jī)分為3組，對照組（9 mL/kg，生理鹽水）5只，低劑量組（9 mL/kg，0.03 g/mL美洲大蠊提取物）6只、高劑量組（9 mL/kg，0.09 g/mL美洲大蠊提取物）6只。每隔1 d灌胃一次，30 d后采集卵巢。結(jié)果表明：與對照組相比，低劑量組大鼠的卵巢重和卵巢體重比以及高劑量組大鼠的體重和卵巢重均顯著增加（P<0.05）；高、低劑量組大鼠卵巢原始卵泡的數(shù)目均顯著減少（P<0.05），成熟卵泡顯著增多（P<0.05）；生長發(fā)育相關(guān)基因BMP4、GDF9的表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）；低劑量組IGF-Ⅰ基因的表達(dá)有升高的趨勢（P=0.058），但高劑量組則顯著上調(diào)（P<0.05）； 3個組間凋亡相關(guān)基因Bcl-2、BAX、Fas、FasL和Caspase-3的表達(dá)均無顯著性差異；但高劑量組使增殖相關(guān)基因的表達(dá)有升高的趨勢（P=0.06），使Ki67基因的表達(dá)顯著升高PCNA（P<0.05）。本實(shí)驗(yàn)條件下，美洲大蠊提取物能夠加快大鼠卵泡的發(fā)育，促進(jìn)卵巢卵泡的成熟。

美洲大蠊提取物；卵巢發(fā)育；基因表達(dá)；卵泡數(shù)目；卵巢；大鼠

在養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐中，營養(yǎng)、環(huán)境和管理因素均可以引起豬機(jī)體氧自由基過量生成或細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損而產(chǎn)生氧化應(yīng)激[1]。氧化應(yīng)激會降低母豬的繁殖性能，使其產(chǎn)仔性能降低[2]。

美洲大蠊（Periplaneta Americana）俗稱蟑螂，其提取物具有顯著的抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗肝硬化和增強(qiáng)免疫的作用[3-4]，有文獻(xiàn)報(bào)道，日糧中添加2%的美洲大蠊蟲粉能夠使4、6、8、10周齡雞的血清總SOD活力和GSH-PX活力顯著升高，血清MDA含量顯著降低[5]?？梢?，美洲大蠊具有較強(qiáng)的抗氧化功能。卵巢是影響雌性動物繁殖性能的重要器官，但是美洲大蠊提取物對卵巢發(fā)育方面的研究卻未見報(bào)道。

在卵泡發(fā)生過程中，生長分化因子-9（Growth Differentiation Factor-9，GDF-9）是原始卵泡進(jìn)一步發(fā)育的必須信號[6]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BoneMorphogenetic Protein 4，BMP4）能夠促進(jìn)卵巢原始卵泡向初級卵泡轉(zhuǎn)變[7]，BMP15能夠調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的募集，促進(jìn)其發(fā)育[8]，卵泡的發(fā)育成熟還需要IGF-Ⅰ的推動[9]。

卵泡在發(fā)育的過程中伴隨著閉鎖和細(xì)胞凋亡，異常的細(xì)胞凋亡能夠減少可用卵泡的數(shù)目，抑制動物的繁殖性能。目前，細(xì)胞凋亡有3種機(jī)制：一種是細(xì)胞表面受體通路，如凋亡蛋白-1/Fas配體（Fas/FasL）通路[7]；第2種是線粒體介導(dǎo)的機(jī)制，如Bcl-2家族[10]，BAX與Bcl-2二者的比值常被用來評價卵泡的凋亡水平[11]；第3種是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的死亡通路。這3種機(jī)制最終都激活Caspase通路，引起細(xì)胞凋亡[12]。Caspase-3位于這些級聯(lián)反應(yīng)的下游，是細(xì)胞發(fā)生死亡的實(shí)施者[12]。PCNA和Ki-67抗原作為增殖基因能夠促進(jìn)卵巢上卵泡的發(fā)育 [10,13]。

因此，本實(shí)驗(yàn)以SD大鼠為研究對象，通過研究美洲大蠊提取物對成年大鼠卵巢卵泡數(shù)目和卵巢發(fā)育、凋亡以及增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討其對動物卵巢功能的生理作用，為下一步的機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 研究對象

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)使用17只體重為230～250 g的成年雌性SD大鼠，均購自大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。大鼠適應(yīng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表并結(jié)合體重隨機(jī)分為3組，分別為對照組5只、高劑量組6只、低劑量組6只。將大鼠按組分籠喂養(yǎng)，自由采食和飲水，動物房溫度控制在20～24℃。

1.1.2 美洲大蠊提取物的制取和稀釋 成年美洲大蠊處死后，晾干，將蟲體粉碎，用15倍量的95%乙醇進(jìn)行冷浸提取3次，然后去除脂肪，沉淀物放入-40℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)前，用蒸餾水將美洲大蠊提取物分別稀釋為高劑量組（0.09 g/mL）和低劑量組（0.03 g/mL）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)大鼠處理 大鼠適應(yīng)1周后進(jìn)行灌胃，對照組灌胃生理鹽水，高劑量組、低劑量組分別灌胃相應(yīng)劑量的美洲大蠊提取物?；谇叭搜芯縖14]，試驗(yàn)確定3個組的添加劑量為每千克體重添加9 mL生理鹽水或美洲大蠊提取物。每隔1 d灌胃1次，每4 d測1次體重，實(shí)驗(yàn)大鼠喂養(yǎng)30 d后進(jìn)行采樣。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)材料的采集 采樣時腹腔注射10%的水合氯醛（2 mL/kg體重）麻醉大鼠，打開腹腔后快速摘取兩側(cè)的卵巢，稱重后將左側(cè)的卵巢和右側(cè)的一半卵巢放入EP管中，右側(cè)的另一半卵巢放入4%的多聚甲醛中，將卵巢置-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 多聚甲醛購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；Trizol試劑盒購自上海Life Technologies生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；含SYBR Green的DNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司；引物由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成；美洲大蠊提取物；10%水合氯醛；生理鹽水；75%酒精。

表1 基因表達(dá)引物序列

表2 大鼠的體重、卵巢重及卵巢體重比

1.3 主要儀器 光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，CX21），美國Thermo Fisher Scientific公司；NanoDrop分光光度計(jì)（ND-1000），美國Thermo公司；普通PCR儀（Gene Amp PCR system 9600）， 美 國 Perkins Elmer公司；實(shí)時熒光定量PCR儀（Mx3000P），美國Stratagene公司。玻璃勻漿器，電子天平，移液槍，超凈工作臺，高壓消毒鍋，干燥箱，冰箱。

1.4 方法

1.4.1 組織切片的制作 卵巢固定12 h后，送到大理學(xué)院附屬醫(yī)院病理科制作組織切片，每個卵巢切4張片子。

1.4.2 卵泡數(shù)目的分析 依據(jù)Cheng等[15]報(bào)道的方法進(jìn)行卵泡分類。在顯微鏡下記錄各個切片中各級卵泡的數(shù)目，每張片子數(shù)2遍。

1.4.3 RNA的提取 根據(jù)商品說明書，使用Trizol試劑盒提取卵巢總RNA，然后用NanoDrop分光光度計(jì)測定總RNA的濃度，測得的值控制在2 000 ng/μL之內(nèi)，最后取5 μg RNA稀釋到500 ng/μL，用于RNA反轉(zhuǎn)錄。

1.4.4 反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，在普通PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物放于4℃冰箱。

1.4.5 引物設(shè)計(jì) 內(nèi)參基因GAPDH和目的基因的引物根據(jù)GenBank上大鼠的相關(guān)cDNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，軟件為Primer premier 5.0，引物序列見表1。

1.4.6 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 將cDNA原液稀釋10倍，使用實(shí)時熒光定量PCR檢測目的基因的mRNA表達(dá)，其體系：cDNA 2 μL，1 μmol/L目的或內(nèi)參引物2 μL，高壓三蒸水6 μL，含SYBR Green的DNA聚合酶10 μL，共20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，64℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)。統(tǒng)計(jì)方法使用2-ΔΔCt法[16]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 計(jì)算每張切片上各級卵泡的比例，分別把對照組化為1，基因表達(dá)的數(shù)據(jù)也把對照組化為1。所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS17.0 for Windows軟件中單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與對照組相比較，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 美洲大蠊提取物對大鼠體重、卵巢重及卵巢體重比的影響 由表2可知，實(shí)驗(yàn)開始時3個組大鼠的平均體重?zé)o顯著差異（P>0.05），而實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，高劑量組大鼠的平均體重顯著高于對照組（P<0.05），高劑量組和低劑量組大鼠的卵巢重也顯著高于對照組（P<0.05），而低劑量組卵巢體重比顯著高于對照組（P<0.05）。

2.2 美洲大蠊提取物對大鼠卵巢卵泡數(shù)目的影響由圖1A和1E知，與對照組相比，高劑量組和低劑量組的美洲大蠊提取物均使大鼠卵巢原始卵泡的數(shù)目顯著減少（P<0.05），成熟卵泡的數(shù)目顯著增加（P<0.05），高劑量組和低劑量組之間沒有顯著性差異（P>0.05）。由圖1B、1C和1D知，卵巢上初級卵泡、次級卵泡和有腔卵泡的數(shù)目在3個組之間均沒有顯著性差異（P>0.05）。

2.3 美洲大蠊提取物對大鼠卵巢發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響 由圖2A、2B可知，與對照組相比，高劑量組和低劑量組均顯著升高了大鼠卵巢GDF9和BMP4基因的表達(dá)（P<0.05）。由圖2C可知，3個組間BMP15基因的表達(dá)均無顯著差異（P>0.05）。由圖2D可知，與對照組相比，低劑量組有上調(diào)大鼠卵巢IGF-Ⅰ基因表達(dá)的趨勢（P=0.058），而高劑量組則顯著升高了該基因的表達(dá)（P<0.05）。

2.4 美洲大蠊提取物對卵巢凋亡和增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響 由圖3A、3B和3C知，3個組間卵巢凋亡相關(guān)基因BAX、Bcl-2、BAX/Bcl-2、Fas、FasL和Caspase-3的表達(dá)均無顯著差異（P>0.05）。但是，由圖3D知，與對照組相比，高劑量組大鼠卵巢PCNA基因的表達(dá)有升高的趨勢（P=0.06），Ki67基因的表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）。

圖1 美洲大蠊提取物對卵巢卵泡數(shù)目的影響

3 討 論

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高劑量組的美洲大蠊提取物能夠增加大鼠的體重和卵巢重，低劑量組的美洲大蠊提取物則提高了大鼠的卵巢重和卵巢體重比，說明一定劑量的美洲大蠊提取物對大鼠卵巢發(fā)育具有潛在的影響。

盡管有報(bào)道[17]稱成年動物卵巢上有生殖系干細(xì)胞可以分化為原始卵泡，但目前仍然普遍認(rèn)為雌性動物在出生時便擁有了一生中所有的原始卵泡，而且每一個原始卵泡均有3種狀態(tài)：保持靜止；被激活后在某一階段發(fā)生閉鎖；能夠正常發(fā)育、成熟，最后排卵。原始卵泡按一定的速率不斷發(fā)育成為初級卵泡、次級卵泡、有腔卵泡和成熟卵泡等各期生長卵泡，成熟卵泡的數(shù)目在一定程度上決定著動物的產(chǎn)子數(shù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量組和低劑量組的美洲大蠊提取物均使大鼠卵巢原始卵泡的數(shù)目顯著減少，成熟卵泡的數(shù)目顯著增加，這是因?yàn)槊乐薮篌固崛∥锟赡芗铀倭舜笫舐殉猜雅莸陌l(fā)育，促進(jìn)了成熟卵泡的形成，增加了大鼠可排卵的卵泡數(shù)目。為了初步探明原因，對卵巢發(fā)育和凋亡、增殖相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。

GDF9對早期卵母細(xì)胞分化和生長有重要的調(diào)節(jié)作用。在小鼠和綿羊上有研究發(fā)現(xiàn)，GDF9缺陷會導(dǎo)致卵巢雖能形成原始卵泡和初級卵泡，但初級卵泡形成后卵泡發(fā)育將停滯于單層顆粒細(xì)胞的初級階段，卵泡不再繼續(xù)發(fā)育，母體不能孕育后代[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高劑量組和低劑量組的美洲大蠊提取物均使大鼠卵巢GDF9基因表達(dá)顯著升高，說明美洲大蠊提取物能夠促進(jìn)卵巢卵泡的發(fā)育。

圖2 美洲大蠊提取物對卵巢發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖3 美洲大蠊提取物對卵巢凋亡和增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響

BMP4能夠促進(jìn)原始卵泡向初級卵泡的轉(zhuǎn)變。已有研究發(fā)現(xiàn)，使用外源BMP4體外培養(yǎng)大鼠，卵巢上初級卵泡的比例顯著增加，而原始卵泡顯著減少[18]；相反，使用BMP4的抗體在體處理小鼠，卵巢上初級卵泡的數(shù)目顯著減少，而原始卵泡的數(shù)目顯著增加[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量組和低劑量組的美洲大蠊提取物均使大鼠卵巢BMP4基因的表達(dá)顯著升高，與GDF9基因的結(jié)果一致。

Bachelot等[18]研究發(fā)現(xiàn)，敲除IGF-Ⅰ基因后，小鼠的卵泡在無腔卵泡期或有腔卵泡的早期即停止了發(fā)育，并且不排卵，說明IGF-Ⅰ能夠促進(jìn)小鼠卵泡的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低劑量組的美洲大蠊提取物使大鼠卵巢IGF-Ⅰ基因的表達(dá)有顯著升高的趨勢，而高劑量組則顯著上調(diào)了該基因的表達(dá)，進(jìn)一步說明美洲大蠊提取物對卵巢卵泡發(fā)育的促進(jìn)作用。

卵泡閉鎖是一種正常的生理過程，細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖的主要原因[20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物高、低劑量組對BAX、Bcl-2、BAX/Bcl-2、FasL、Fas和Caspase-3凋亡相關(guān)基因的表達(dá)均沒有顯著影響，但是高劑量組顯著上調(diào)了卵巢增殖相關(guān)基因Ki67的表達(dá)，對PCNA基因的表達(dá)有顯著升高的趨勢。Ki-67被認(rèn)為是細(xì)胞增殖的重要標(biāo)記物[13]，PCNA的表達(dá)對鑒別卵巢細(xì)胞的增殖有一定的實(shí)用價值[10]。

綜上所述，一定量的美洲大蠊提取物能夠加快大鼠卵巢卵泡的發(fā)育，促進(jìn)成熟卵泡的形成，GDF9、BMP4和IGF-Ⅰ基因可能參與了其調(diào)控過程。但本實(shí)驗(yàn)只是從卵泡數(shù)目和相關(guān)基因表達(dá)方面進(jìn)行了初步探討，其分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Ef f ect of Periplaneta Americana Extract on Follicular Development of Ovary in Rats

SUI Shi-yan1,2, ZHANG Cheng-gui1, XU Qu-wei2, LIANG Xian2, YANG Jie-yu2
(1. Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R＆D, Dali University, Yunnan Dali 671000, China; 2. College of Agronomy and Bioscience, Dali University, Yunnan Dali 671003, China)

To study the ef f ect of periplaneta americana extract on follicular development of ovary in rats. The adult SD rats were randomly assigned to three groups. The control group of 5 rats were only f i lled with physiological saline (9 mL/ kg) through stomach perfusion. The 6 rats were used respectively in Low dose group (9 mL/kg, 0.03g/mL) and High dose group (9 mL/kg, 0.09 g/mL) which were f i lled with periplaneta Americana extract through stomach perfusion. Rats were treated every other day. After 30 days, the ovaries were collected. Compared with control group, Low dose group showed signif i cantly increased ovary weight and ovary weight relative to body weight, and High dose group showed signif i cantly increased ovary weight and body weight (P<0.05). High and low dose group all signif i cantly decreased the number of primordial follicles of rat ovaries (P<0.05), increased the number of graaf i an follicles (P<0.05). High and low dose group signif i cantly up-regulated mRNA expression of GDF9 and BMP4 (P<0.05). But the expression of IGF-Ⅰgene tended to be higher in Low dose group (P=0.058), and was up-regulated signif i cantly in High dose group (P<0.05). It had no signif i cant dif f erence about the expression of Bcl-2, BAX, Fas, FasL and Caspase-3 among the three groups. However, High dose group had significantly higher trend about the experssion of PCNA gene (P=0.06), and significantly up-regulated the mRNA expression of ki67 (P<0.05). Periplaneta americana extract can accelerate the development of ovarian follicles of rats, and promot the formation of graaf i an follicles.

Periplaneta americana extract; The development of ovary; Gene expression; The number of follicles; Ovary; Rats

S865.1+20.3

A

10.19556/j.0258-7033.2017-04-063

2016-11-25；

2016-12-17

云南省教育廳項(xiàng)目（2014C110Y）；大理大學(xué)博士科研啟動基金項(xiàng)目（KYBS201406）；大理大學(xué)名師工作室校內(nèi)訪問學(xué)者項(xiàng)目（201518）

隋世燕（1981-），男，博士，講師，主要從事動物營養(yǎng)與繁殖方面的研究，E-mail：sysui569@163.com