正交試驗(yàn)優(yōu)化分光光度法測定森林土壤有機(jī)質(zhì)

辜忠春，李光榮，李軍章，杜業(yè)云，王 宵

（湖北省林業(yè)科學(xué)研究院 國家林業(yè)局林產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心（武漢），湖北 武漢430075）

正交試驗(yàn)優(yōu)化分光光度法測定森林土壤有機(jī)質(zhì)

辜忠春，李光榮，李軍章，杜業(yè)云，王 宵

（湖北省林業(yè)科學(xué)研究院 國家林業(yè)局林產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心（武漢），湖北 武漢430075）

為實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確測定森林土壤有機(jī)質(zhì)，以土壤標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為試驗(yàn)對(duì)象，在外加熱條件下，以重鉻酸鉀氧化土壤中有機(jī)質(zhì)，鉻（Ⅵ）被還原為鉻（Ⅲ），用分光光度計(jì)測定鉻（Ⅲ）吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量即可得出有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)?；谡辉囼?yàn)，考察不同消解溫度、消解時(shí)間、硫酸用量等消解條件對(duì)測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明：消解溫度為135℃，消解時(shí)間為60 min，硫酸用量為6 mL為樣品消解的最佳參數(shù)，測定有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)定值范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為1.3%，相對(duì)誤差為－0.6%，加標(biāo)回收率為95.2%～98.6%，方法檢出限LMD=0.5 mg· g－1，與現(xiàn)行林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法的測定結(jié)果進(jìn)行比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，無顯著性差異。該方法可以滿足批量森林土壤有機(jī)質(zhì)的測定要求。表7參11

森林土壤學(xué)；有機(jī)質(zhì)；正交試驗(yàn)；分光光度法

有機(jī)質(zhì)是森林土壤的重要組成成分，其含量水平是衡量土壤肥力的重要指標(biāo)之一，對(duì)土壤物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)有著深刻的影響，對(duì)重金屬、農(nóng)藥等各種有機(jī)、無機(jī)污染物有固定作用，是全球碳平衡過程中非常重要的碳庫［1］。土壤有機(jī)質(zhì)測定方法主要有干燒法、核磁共振法、近紅外光譜法、稀釋熱比色法和容量法等。干燒法的測定結(jié)果雖然比較準(zhǔn)確，但工序繁瑣，需要特殊的儀器設(shè)備，很費(fèi)時(shí)間，普通實(shí)驗(yàn)室無法采用該法［2］。稀釋熱比色法受土壤類型和環(huán)境溫度影響較大，準(zhǔn)確度低，應(yīng)用受到限制［3］。核磁共振法和近紅外光譜法可以對(duì)有機(jī)質(zhì)的種類、成分等進(jìn)行定性和定量分析，也需特殊的儀器設(shè)備［4－5］，成本昂貴。容量法為國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)法［6－7］，操作簡單，被廣泛采用，但該法也有一些不足之處：①存在安全隱患，在170～190℃的高溫油浴消解樣品過程中，導(dǎo)熱油會(huì)分解揮發(fā)一些有害氣體，有損實(shí)驗(yàn)員的健康，同時(shí)劇烈沸騰的高溫消解液可能濺出傷人；②批量檢測時(shí)，若土質(zhì)類型不同則沸騰時(shí)間難以同時(shí)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的5 min，從而影響測定結(jié)果，有試驗(yàn)表明土樣消解沸騰4～5 min，沸騰5～6 min之間，測定結(jié)果均值存在顯著性差異［8］；③消解管外壁的油污不易清洗；④滴定法測定效率不高，不適應(yīng)現(xiàn)代林業(yè)檢測技術(shù)的批量快速要求。分光光度法測定土壤有機(jī)質(zhì)的影響因素有：消解溫度、消解時(shí)間、硫酸用量及重鉻酸鉀溶液用量。消解溫度直接影響有機(jī)質(zhì)的氧化率，消解溫度低，有機(jī)質(zhì)氧化反應(yīng)不完全，致使結(jié)果偏低；溫度過高時(shí)，可能促使重鉻酸鉀自我分解，導(dǎo)致測定值偏高。同理，消解時(shí)間過短，氧化不完全，致使結(jié)果偏低，消解時(shí)間過長，重鉻酸鉀會(huì)自我分解，會(huì)使結(jié)果偏高。硫酸在該反應(yīng)體系中提供酸性環(huán)境，以保證有機(jī)質(zhì)氧化完全，硫酸用量不足氧化不完全，結(jié)果偏低，用量過多，造成浪費(fèi)。本研究以標(biāo)準(zhǔn)土樣為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用正交試驗(yàn)，確定消解時(shí)間、消解溫度、硫酸用量及重鉻酸鉀溶液用量等實(shí)驗(yàn)技術(shù)參數(shù)，并對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證，從而建立分光光度法測森林土壤中有機(jī)質(zhì)含量的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及主要試劑

標(biāo)準(zhǔn)土壤樣品GBW 07458（土壤有效態(tài)成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)-黑龍江黑土，中國地質(zhì)科學(xué)院地球物理地球化學(xué)勘查研究所）：有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)認(rèn)定值范圍為（34.5±1.3）mg·g－1；實(shí)驗(yàn)室留存森林土壤樣品3個(gè)（代表有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低、中、高）。

電子天平（精度0.1 mg），721可見分光光度計(jì)，電熱恒溫干燥箱，具塞玻璃消解管（具有100 mL刻度線），油浴消化裝置，常用實(shí)驗(yàn)玻璃器皿。

葡萄糖、重鉻酸鉀、硫酸等均為分析純。重鉻酸鉀溶液，ρ（K2Cr207）=90.00 g·L－1：稱取90.00 g重鉻酸鉀，加蒸餾水溶解，移于1 L容量瓶中，定容。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，ρ（C6H12O6）=13.0 g·L－1：準(zhǔn)確稱13.000 0 g葡萄糖（98～100℃烘2 h），加蒸餾水溶解，無損地移于1 L容量瓶中，加入2 mL硫酸，定容。

1.2 方法

1.2.1 方法原理 分光光度法：在外加熱條件下，土壤樣品中的有機(jī)質(zhì)被過量重鉻酸鉀-硫酸溶液氧化，重鉻酸鉀中的鉻（Ⅵ）被還原為鉻（Ⅲ），鉻（Ⅲ）質(zhì)量分?jǐn)?shù)與樣品中有機(jī)質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正比，用分光光度計(jì)于585 nm波長處測定鉻（Ⅲ）吸光度［9－10］。在一定范圍內(nèi)，吸光度與樣品中有機(jī)質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正比，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量求得有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。反應(yīng)方程式為 2K2Cr2O7+8H2SO4+3C→ 2K2SO4+ 2Cr2（SO4）3+3CO2↑+8H2O。

1.2.2 土壤有機(jī)質(zhì)測定 分別采用容量法和分光光度法進(jìn)行測定。容量法：按照LY/T 1237－1999《森林土壤有機(jī)質(zhì)的測定及碳氮比的計(jì)算》進(jìn)行測定［6］。分光光度法：根據(jù)有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍，準(zhǔn)確稱取過100目篩的風(fēng)干土樣0.100 0～0.500 0 g（有機(jī)質(zhì)高于50 mg·g－1的土樣稱0.1 g，有機(jī)質(zhì)為20～30 mg·g－1的土樣稱0.3 g，有機(jī)質(zhì)低于20 mg·g－1的土樣稱0.5 g）于100 mL消解管底部，加入90.00 g·L－1重鉻酸鉀溶液7.0 mL，沿消解管內(nèi)壁緩緩加入6 mL硫酸，放入已預(yù)先加熱至135℃的電熱恒溫干燥箱中，于（135±1）℃保溫60 min后取出，冷卻，加蒸餾水定容，加塞搖勻，用中速定量濾紙過濾。濾液用分光光度計(jì)于波長585 nm處，用10 mm比色皿，測量吸光度。同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，即分別準(zhǔn)確吸取0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞消解玻璃管中，其對(duì)應(yīng)有機(jī)碳質(zhì)量分別為0.00，2.60，5.20，10.4，15.6，20.8和26.0 mg。其他過程同土樣測定，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)及土樣含水率測定。分光光度法結(jié)果計(jì)算公式：x=［（G－G0－a）/（f×m×k）］×1.724。其中：x為土壤樣品中有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg·g－1；G為土壤樣品溶液吸光度；G0為空白試驗(yàn)溶液吸光度；a為校準(zhǔn)曲線的截距；f為校準(zhǔn)曲線的斜率，mg－1；m為土壤樣品稱取量，g；k為風(fēng)干土壤樣品質(zhì)量換算成烘干土樣質(zhì)量的水分換算系數(shù)；1.724為將有機(jī)碳換算有機(jī)質(zhì)的系數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

重復(fù)測定6次·樣品－1，各平行數(shù)據(jù)以Grubbs檢驗(yàn)法剔除異常值，其算術(shù)平均值為測定結(jié)果。分光光度法與容量法［6］的測定數(shù)據(jù)根據(jù)Excel 2007軟件用t檢驗(yàn)法檢驗(yàn)2種方法的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 消解溶液顏色穩(wěn)定性試驗(yàn)

將1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)土樣和1個(gè)土壤樣品按分光光度法消解后，放置1～24 h測定濾液吸光度（表1），考查在該溶液體系中鉻（Ⅲ）顏色穩(wěn)定性。由表1可見：在24 h內(nèi)測定的吸光度差異很?。ā?.003），表明在此期間內(nèi)鉻（Ⅲ）顏色穩(wěn)定性好。

2.2 實(shí)驗(yàn)技術(shù)參數(shù)的選擇

外加熱重鉻酸鉀氧化-分光光度法測定森林土壤有機(jī)質(zhì)的主要影響因素有：重鉻酸鉀用量、消解溫度、消解時(shí)間和硫酸用量。

本方法需用過量的重鉻酸鉀氧化有機(jī)質(zhì)。根據(jù)文獻(xiàn)［6－7］要求： “在滴定時(shí)樣品消耗硫酸亞鐵量不小于空白用量的1/3”，即重鉻酸鉀所需總量為參與氧化反應(yīng)的重鉻酸鉀的1.5倍以上。采用單因素多水平實(shí)驗(yàn)法，選用90.00 g·L－1重鉻酸鉀溶液5.0，6.0，7.0 mL分別進(jìn)行測定，依據(jù)反應(yīng)方程式，以稱量0.1 g計(jì)，其測定上限分別為317，380，443 mg·g－1。中國森林土壤有機(jī)質(zhì)含量范圍很廣，低者只有10～20 mg·g－1，高者如東北的黑土有機(jī)質(zhì)可達(dá)400 mg·g－1，因此443 mg·g－1的測定結(jié)果能夠滿足中國森林土壤有機(jī)質(zhì)的測定上限要求，故將90.00 g·L－1重鉻酸鉀溶液用量選定為7.0 mL。

其余影響因素，消解溫度、消解時(shí)間和硫酸用量采用3因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)，通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)土樣GBW07458進(jìn)行有機(jī)質(zhì)測定，重復(fù)測定6次·實(shí)驗(yàn)組合－1，得其測量值的算術(shù)平均值x，將x與標(biāo)準(zhǔn)土樣的認(rèn)定值（μ=34.5 mg·g－1）比對(duì)分析，以結(jié)果的絕對(duì)誤差（|x－μ|）作為響應(yīng)值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，|x－μ|數(shù)值越小即越接近認(rèn)定值，以確定消解樣品的最佳實(shí)驗(yàn)技術(shù)參數(shù)（消解時(shí)間、消解溫度、硫酸的用量）。正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析見表2。由極差分析結(jié)果可知：各因素影響由大到小的順序是：B（消解時(shí)間）＞C（硫酸用量）＞A（消解溫度），實(shí)驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化組合為：A2B3C2，即消解溫度135℃，消解時(shí)間60 min，硫酸用量6 mL。方差分析結(jié)果表明，各因素對(duì)測定結(jié)果均無顯著性影響（表3）。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 2 Results of orthogonal test and range analysis

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由于優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)技術(shù)參數(shù)組合不在正交表的上述9組試驗(yàn)中，故還需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（表4）。結(jié)果表明：6次重復(fù)測定結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)土樣的認(rèn)定值（34.5±1.3）mg·g－1范圍內(nèi)，平均值對(duì)標(biāo)準(zhǔn)土樣認(rèn)定值的相對(duì)誤差－0.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.3%，加標(biāo)回收率為95.2%～98.6%。t檢驗(yàn)結(jié)果表明，t=1.067，故 t＜t（0.05,5）=2.571，即與μ之間無顯著性差異，可見采用優(yōu)化組合的分光光度法，沒有引起系統(tǒng)誤差。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、檢出限

以確定的參數(shù)優(yōu)化組合最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)實(shí)驗(yàn)條件下測定標(biāo)準(zhǔn)系列，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的有機(jī)碳質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的0質(zhì)量濃度校正吸光度為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明：有機(jī)碳質(zhì)量濃度在0～260.0 mg·L－1與溶液吸光度呈良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線回歸方程：y=0.019x+0.001，相關(guān)系數(shù) r =0.999 7。重復(fù)7次空白實(shí)驗(yàn)，將各測定結(jié)果換算為有機(jī)質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別計(jì)算7次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，參照文獻(xiàn)［11］中的公式檢出限 LMD=t（n－1,0.99）×S計(jì)算方法檢出限LMD（即能夠被檢出并在被分析物質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0時(shí)能以99%置信度報(bào)告的最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)），LMD=0.5 mg·g－1（按樣品稱量0.5 g計(jì)算），可見該方法檢出限較低，測定上限為443 mg·g－1（以樣品稱量0.1 g計(jì)算），能滿足森林土壤有機(jī)質(zhì)的檢測要求，因而具有廣泛的應(yīng)用范圍。

2.5 樣品測定

為進(jìn)一步考察優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)方法的適用范圍，檢驗(yàn)其可靠性，分別選取代表有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低（砂質(zhì)土，樣品編號(hào)L1），有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)中等（黃壤，樣品編號(hào)L5），有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高（棕壤，樣品編號(hào)L9）的實(shí)驗(yàn)室留存森林土樣各1個(gè)進(jìn)行測試，以標(biāo)準(zhǔn)土樣GBW07458為質(zhì)控樣，分別以本法和容量法［6］同時(shí)測定有機(jī)質(zhì)，各方法重復(fù)6次·樣品－1，結(jié)果的平均值，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD見表5。

對(duì)L1樣品的2種方法測定結(jié)果用Excel2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果見表6，F(xiàn)檢驗(yàn)的單尾P=0.43＞0.05，表明2種方法測定值的精密度無顯著性差異。t檢驗(yàn)結(jié)果（表7）雙尾P=0.20＞0.05，表明2種方法的測定結(jié)果無顯著性差異。依照此法，L5和L9質(zhì)控樣的t檢驗(yàn)的雙尾P值分別為0.10，0.11，0.43（表格略），均大于0.05，表明采用新方法后，沒有引起系統(tǒng)誤差。由此可見：分光光度法對(duì)有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)從低到高的土壤樣品測定具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results

表4 標(biāo)準(zhǔn)土壤樣品的優(yōu)化組合驗(yàn)證測定結(jié)果Table 4 Optimum combination of standard soil samples to verify the results

表5 容量法與分光光度法實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 5 Capacity method and spectrophotometric method（n=6）

3 結(jié)論與討論

應(yīng)用外加熱重鉻酸鉀氧化-分光光度法測定森林土壤有機(jī)質(zhì)，通過正交優(yōu)化試驗(yàn)，確定實(shí)驗(yàn)技術(shù)參數(shù)。所需設(shè)備簡單，僅為實(shí)驗(yàn)室常用的分光光度計(jì)等，無需特殊設(shè)備，操作過程簡便、快捷。通過與行標(biāo)容量法比對(duì)測定，測定結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn)無顯著性差異，標(biāo)準(zhǔn)土樣驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度和精密度較為滿意，同時(shí)檢出限低，測定范圍廣。本研究以標(biāo)準(zhǔn)土樣為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行正交試驗(yàn)，測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)土樣的認(rèn)定值相比有高有低，因而不便于以測定的有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)直接進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，而以測定結(jié)果的絕對(duì)誤差（－μ|）作響應(yīng)值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析是可行的，|x－μ|數(shù)值越?。丛浇咏J(rèn)定值）為優(yōu)。分光光度法會(huì)受到土壤中二價(jià)鐵和氯離子等因素干擾，除去這些干擾的方法與容量法中去干擾的方法相同［6］。

表6 L1樣品有機(jī)質(zhì)測定結(jié)果F檢驗(yàn)（雙樣本方差分析）Table 6 F test for the determination of organic matter in the L1sample（equal variances assumed）

表7 L1樣品有機(jī)質(zhì)測定結(jié)果t檢驗(yàn)（雙樣本等方差假設(shè)）Table 7 t test for the determination of organic matter in the L1sample（equal variances assumed）

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Organic matter in forest soils determined with spectrophotometry and optimized by orthogonal testing

GU Zhongchun,LI Guangrong,LI Junzhang,DU Yeyun,WANG Xiao
（Wuhan Forest Products Quality Inspection Center of State Forestry Administration,Hubei Academy of Forestry, Wuhan 430075,Hubei,China）

To rapidly and accurately measure organic matter in forest soils,organic matter from standard soil material was oxidized by potassium dichromate with external heating conditions,Cr （Ⅳ）was reduced to Cr（Ⅲ）,absorbance of Cr（Ⅲ）was determined by spectrophotometry,and the rate of organic matter was quantified by comparison with a standard curve.Orthogonal testing with digestion temperature,digestion time,and sulfuric acid amount,was utilized and the effects on the determination results were investigated.Results showed that for organic matter digestion in soils,the optimal digestion temperature was 135℃,the digestion time was 60 min,and the amount of sulfuric acid was 6 mL.The determined mass fractions of organic matter in the soil were in agreement with the certified ones with a relative standard deviation（RSD）（n=6）of 1.3%,a relative error of－0.6%,a recovery rate range of 95.2%－98.6%,and a method detection limit（MDL）of 0.5 mg·g－1. Based on the t test,all results determined with this novel method were not significantly different from the standard forestry method.This investigation method was simple,accurate,and could meet the requirements for extensive application when determining organic matter in forest soils.［Ch,7 tab.11 ref.］

forest soil science;organic matter;orthogonal experiment;spectrophotometry

S714.5

A

2095-0756（2017）02-0239-05

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.02.006

2016-04-01；

2016-04-28

湖北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局地方標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目（2014348-53）

辜忠春，高級(jí)工程師，從事林業(yè)分析測試研究。E-mail:nzx800@163.com