綿羊血漿催產(chǎn)素水平定量檢測(cè)方法的建

立席麗 閆永鋒 +秦新喜+韓進(jìn)誠(chéng)+瞿紅俠+張進(jìn)良

摘要：建立采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）測(cè)定綿羊血漿中催產(chǎn)素（oxytocin，OT）的方法。經(jīng)乙腈沉降法提取血漿樣品，在多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式下進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)加入法定量。通過該方法獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=1.448x+544.400，相關(guān)系數(shù)為0.998，線性范圍在50～10 000 pg/mL，方法檢出限為10 pg/mL，定量限為50 pg/mL。應(yīng)用 HPLC-MS/MS法測(cè)定醋酸去甲雄三烯醇酮-17β雌二醇（trenbolone acetate and estradiol-17β，TBA-E2）聯(lián)合處理閹公羊血漿中OT濃度變化，其中對(duì)照組催產(chǎn)素濃度為55～80 pg/mL，TBA-E2處理組為75～160 pg/mL，表明TBA-E2可提高閹公羊血漿中的OT濃度。該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于血漿樣品中OT的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；乙腈沉降法；催產(chǎn)素；血漿

中圖分類號(hào)： S858.267.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）05-0157-04

OT是一種環(huán)狀的九肽類神經(jīng)垂體激素，由下丘腦視上核和室旁核的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞合成和分泌，經(jīng)下丘腦-垂體軸投射到垂體后葉，再釋放入血。大腦是產(chǎn)生OT的主要部位，但子宮、生殖腺、心肌、胸腺等組織也能合成OT[1]。OT作為激素和神經(jīng)遞質(zhì)具有重要的生物學(xué)作用，臨床上主要用于催生引產(chǎn)，產(chǎn)后止血、縮短第三產(chǎn)程和刺激泌乳。此外還具有廣泛的生理作用，尤其是對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，例如，通過對(duì)垂體的分泌功能起作用，從而調(diào)節(jié)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的釋放，促進(jìn)催乳素、促性腺激素的分泌，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)激素的分泌[2]。研究顯示，OT與動(dòng)物的“社會(huì)行為”，包括配偶選擇、交配、親本育幼等行為相關(guān)[3-5]。據(jù)報(bào)道，OT能增加人與人之間的信任感、影響社會(huì)關(guān)系的建立并調(diào)節(jié)情感行為[6-7]。

目前，用于定量分析生物樣品中OT的方法有放射免疫法（radioimmunoassay，RIA）[8]、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[9]、液相色譜-紫外法[10]、庫(kù)倫電化學(xué)高效液相色譜法[11-13]、毛細(xì)管區(qū)帶電泳-紫外法[14]等。RIA、ELSIA法靈敏度高，但需要制備待測(cè)物的特異性抗體，而且容易受到來源于生物樣品中特異性（如結(jié)構(gòu)類似物-賴氨加壓素）和非特異性（如pH值、離子濃度、基質(zhì)其他成分等）的干擾[15]。即使應(yīng)用特異性非常高的抗體，RIA獲得的數(shù)據(jù)所反映的是分析物免疫活性水平，而非分析物本身的水平。HPLC-MS/MS具有高靈敏度、選擇性、特異性等優(yōu)點(diǎn)，被越來越廣泛地應(yīng)用于生物樣品中蛋白質(zhì)和多肽的分析研究中[16-17]。本研究建立了HPLC-MS/MS測(cè)定綿羊血漿中OT的方法，采用乙腈方法提取和凈化OT，利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式下進(jìn)行檢測(cè)，本方法有效去除了干擾，提高了靈敏度，定性與定量分析準(zhǔn)確，能夠滿足血漿中催產(chǎn)素水平的快速檢測(cè)和確證的要求。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

Ultimate 3000型高效液相色譜系統(tǒng)（Dionex公司）；GracesmartTM RP C18色譜柱（150mm×2 mm，5 μm，Grace Davison公司）；電噴霧電離源-API 4000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（Applied Biosystems公司）；VM1型漩渦混合器（Ratek公司）；PS-20型超聲清洗機(jī)（Unisonic公司）；5424R型臺(tái)式高速離心機(jī)、微量移液器（Eppendorf公司）；Heto型真空離心干燥機(jī)（Medos公司）；Sep-Pak C8、C18和Oasis HLB固相萃取柱（Waters公司）；YM-3 Microcon型離心超濾裝置（Millipore公司）。

催產(chǎn)素標(biāo)準(zhǔn)品（Auspep公司）；綿羊血漿凍干粉（Sigma公司）；乙腈（色譜純，Labscan公司）；甲酸、甲醇（分析純，Univar 公司）；超純水經(jīng)美國(guó)Millipore公司超純水系統(tǒng)處理。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

催產(chǎn)素標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備：稱取催產(chǎn)素標(biāo)準(zhǔn)品0.5 mg，用超純水稀釋并定容到1 mL，配制成0.5 mg/mL的儲(chǔ)備液，置于-20 ℃冰箱保存。移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制10、25、50、100、250、500、1 000、2 500、5 000 pg/mL的催產(chǎn)素標(biāo)準(zhǔn)工作液系列。

質(zhì)量控制樣品的制備：配制50、500 pg/mL溶液作為血漿催產(chǎn)素提取方法比較的質(zhì)量控制樣品。

1.3血漿樣品的處理

將5 mg綿羊血漿凍干粉溶于5 mL超純水中，置于 -20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

血漿質(zhì)量控制樣品分別采用固相萃取法、乙腈沉降法、3 ku 超濾法提取催產(chǎn)素，用于比較各提取方法的回收率及優(yōu)化提取該多肽的方法。

1.3.1乙腈沉降法

吸取300 μL乙腈到100 μL分別含有50、500 pg/mL催產(chǎn)素的血漿樣品中，渦旋振蕩5 min后于 4 ℃ 放置30 min，4 ℃、13 200 g離心20 min，上清液轉(zhuǎn)入新的Eppendorf管中，并在4 ℃真空離心干燥，100 μL 1%甲酸溶液重新溶解，取20 μL進(jìn)樣分析。

1.3.2離心超濾法

將100 μL血漿樣品加入到3 ku MWCO規(guī)格的Microcon離心超濾管中，14 000 g離心100 min，回收超濾液于4 ℃真空離心干燥，100 μL 1%甲酸溶液重新溶解，取20 μL進(jìn)樣分析。

1.3.3固相萃取法

取100 μL血漿樣品置于冰上，分別加入5 μL 100 mmol/L PMSF和3 μL CompleteTM蛋白酶抑制劑混合液，用pH值3.0的0.1 mol/L乙酸銨溶液900 μL稀釋成1 mL上樣血漿樣品。HLB、C8和C18固相萃取小柱分別經(jīng)1 mL甲醇預(yù)處理，1 mL 75%乙腈/0.1%甲酸溶液活化和2%乙腈/0.1%甲酸溶液平衡后，將100 μL上述血漿樣品加入柱內(nèi)，經(jīng)6 mL 2%乙腈/0.1%甲酸溶液淋洗后，用50%乙腈/01%甲酸溶液將分析物洗脫下來，洗脫液經(jīng)4 ℃真空離心干燥，100 μL 1%甲酸溶液重新溶解，取20 μL進(jìn)樣分析。

1.4色譜和質(zhì)譜條件

1.4.1高效液相色譜條件

色譜柱：GracesmartTM RP C18色譜柱；柱溫45 ℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈-0.1%甲酸溶液（體積比9 ∶[KG-*3]1）。梯度洗脫程序：0～12 min，0～40% B；12～15 min，40%～80% B；15～20 min，80% B；20～20.1 min，80%～0 B；20.1～30 min，0% B。流速0.25 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

采用MRM方式，測(cè)定催產(chǎn)素質(zhì)子化的準(zhǔn)分子離子經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離產(chǎn)生產(chǎn)物離子的反應(yīng)。離子化方式：電噴霧正離子掃描（ESI+）；毛細(xì)管電壓5.3 kV；離子源溫度450 ℃；氣簾氣20 psi；霧化氣35 psi；輔助氣25 psi；去簇電壓20 V；射入電壓10 V；碰撞室射出電壓15 V。

1.5數(shù)據(jù)處理

在上述優(yōu)化后的LC-MS/MS條件下測(cè)定樣品，記錄質(zhì)量色譜圖中OT的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析。

2結(jié)果與分析

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源的正離子檢測(cè)模式下，催產(chǎn)素在一級(jí)增強(qiáng)型全掃描質(zhì)譜中獲得m/z為1 007.3和504.2，分別對(duì)應(yīng)[M+H]1+和[M+2H]2+準(zhǔn)分子離子峰（圖1）。采用產(chǎn)物離子掃描方式，對(duì)[M+2H]2+峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析（圖2），獲得的主要碎片峰m/z分別為285.2、723.2、820.3，對(duì)應(yīng)y3+、b6+、b7+，為-S-S-鍵之外的X-pro不穩(wěn)定肽鍵經(jīng)碰撞裂解后的碎片離子，具有較高的信號(hào)強(qiáng)度和重現(xiàn)性。因此將上述2個(gè)母離子和產(chǎn)生的主要子離子組合，作為后續(xù)催產(chǎn)素多反應(yīng)監(jiān)測(cè)的母-子離子對(duì)。

試驗(yàn)中對(duì)流動(dòng)相及洗脫梯度進(jìn)行優(yōu)化。HPLC級(jí)乙腈吸光度低，產(chǎn)生的噪聲?。慌c水混合后引起的柱壓低；洗脫能力高，因此選用乙腈作為有機(jī)相。在流動(dòng)相中加入少量的甲酸（0.1%），可改善色譜峰形和提高離子化效率。1 μmol/L OT經(jīng)30 min梯度洗脫后保留時(shí)間為9.33 min

2.3血漿樣品提取方法的優(yōu)化

應(yīng)用“1.3”中提到的多種方法對(duì)QC樣品進(jìn)行提取，選擇最佳提取方法。對(duì)于固相萃取方法，回收率為血漿QC樣品經(jīng)50%乙腈洗脫產(chǎn)物干燥、重溶后OT面積之和與未經(jīng)提取的1%甲酸溶液QC樣品OT面積比值的百分率。對(duì)于乙腈蛋白質(zhì)沉降法，回收率為上清液經(jīng)干燥、重溶后OT面積與未經(jīng)提取的1%甲酸溶液QC樣品OT面積比值的百分率。對(duì)于3 ku超濾法，回收率為超濾液經(jīng)干燥、重溶后OT面積與未經(jīng)提取的1%甲酸溶液QC樣品OT面積比值的百分率。結(jié)果顯示，乙腈蛋白質(zhì)沉淀法對(duì)血漿OT的回收率優(yōu)于固相萃取法，且重復(fù)性較好（變異系數(shù)<4.0%）。

2.4校準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按上述優(yōu)化過的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物峰面積值為縱坐標(biāo)，用Graphpad Prism 4.0繪圖軟件求得的線性回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法檢出限（limit of detection，LOD）以待測(cè)物確證離子的信噪比等于3（S/N=3）時(shí)待測(cè)物濃度表示，定量限（limit of quantitation，LOQ）以待測(cè)物確證離子的信噪比等于10（S/N=10）時(shí)待測(cè)物濃度表示。分析方法的校準(zhǔn)曲線見圖5。根據(jù)校準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=1.448x+544.400，r2=0.998。OT線性范圍為 50～10 000 pg/mL，LOD為10 pg/mL，LOQ為50 pg/mL，CV<15%。

2.5方法的特異性

測(cè)定生物樣品中某種物質(zhì)，需要排除其他干擾而顯示出方法的特異性。上述建立的MRM檢測(cè)方法中，在OT保留時(shí)間9.33 min處未見干擾離子對(duì)的色譜出峰，證明該方法對(duì)OT的檢測(cè)具有特異性。

2.6方法的精確度

2.7綿羊血中OT濃度測(cè)定

18只7月齡閹公羊，體質(zhì)量為37.1 kg，分為TBA-E2處理組和對(duì)照組。TBA-E2處理為耳部埋植60 mg醋酸去甲雄三烯醇酮（trenbolone acetate，TBA）和6 mg雌激素（estradiol，E2）。試驗(yàn)期85 d，試驗(yàn)結(jié)束后采血，置于肝素抗凝劑管中，4 ℃、3 000 g離心20 min，取上清于-80 ℃貯存?zhèn)溆?。利用上述定量檢測(cè)方法測(cè)定血漿中OT濃度。對(duì)照組OT濃度為55～80 pg/mL，TBA-E2處理組為75～160 pg/mL，表明 TBA-E2 可提高閹公羊血漿中的OT濃度。

3結(jié)論與討論

本研究串聯(lián)質(zhì)譜掃描中OT（Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2）母離子[M+H]+經(jīng)碰撞誘導(dǎo)裂解后主要產(chǎn)生了y3+（Pro-Leu-Gly-NH2）和b6+（Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys）子離子，可見C1和C7位的二硫鍵所形成的碳環(huán)非常穩(wěn)固，經(jīng)氣體碰撞后仍然保持較好的完整性。因此本研究在篩選多反應(yīng)監(jiān)測(cè)母子離子對(duì)時(shí)，主要選取了信號(hào)強(qiáng)度大且穩(wěn)定的y3+、b6+、b7+作為子離子，可在一定程度上保證所建立方法的靈敏度和重現(xiàn)性。

在LC-MS分析過程中，通常會(huì)遇見基質(zhì)抑制效應(yīng)，造成被測(cè)化合物的靈敏度低，測(cè)定結(jié)果重復(fù)性、定量準(zhǔn)確度差，有時(shí)還會(huì)影響質(zhì)譜碎片的相對(duì)豐度，從而影響定性判斷。目前從生物樣品中提取蛋白質(zhì)和多肽以獲得更純凈樣品的方法已經(jīng)在LC-MS定量分析中得到廣泛應(yīng)用并不斷發(fā)展。蛋白質(zhì)沉淀法快速、簡(jiǎn)便，但其在沉淀大分子蛋白的同時(shí)易引起待測(cè)物質(zhì)的共沉淀從而導(dǎo)致響應(yīng)值降低；固相萃取方法能夠有效降低抑制干擾，但是其對(duì)某一特定多肽的提取效率因多肽的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)以及分離柱和洗脫方法的選擇而不同；超濾法僅采用壓力作為膜分離的動(dòng)力，具有流程短、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，但小分子物質(zhì)容易與大分子物質(zhì)黏附在一起，從而被阻斷在膜上方，導(dǎo)致濾液中待測(cè)物濃度降低。因此，對(duì)于某一特定多肽，需要比較和優(yōu)化蛋白質(zhì)和多肽的方法后才能獲得最大回收率和重復(fù)性。本研究通過比較乙腈蛋白質(zhì)沉淀法、固相萃取法（C8柱、C18柱、HLB柱）和3 ku超濾法的回收率和重復(fù)性，發(fā)現(xiàn)乙腈蛋白質(zhì)沉淀法在提取血漿中OT時(shí)具有較高的回收率（98.4%）和較好的重復(fù)性（CV<4.0%）。

為了消除試樣基質(zhì)或干擾組分的影響，提高測(cè)定準(zhǔn)確度，往往應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)加入法來測(cè)定復(fù)雜生物基質(zhì)中目標(biāo)物含量。本研究采用標(biāo)準(zhǔn)加入法構(gòu)建血漿OT定量校準(zhǔn)曲線，通過方法學(xué)驗(yàn)證表明，該方法具備較高的特異性和精確度，并在測(cè)定臨床血漿樣品時(shí)得到應(yīng)用。本研究建立了一種應(yīng)用HPLC-MS/MS檢測(cè)血漿中OT含量的方法，并在臨床樣品分析中得到驗(yàn)證。該方法通過對(duì)OT血漿樣品的前處理，結(jié)合OT在HPLC的保留時(shí)間及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)對(duì)OT及其碎片離子質(zhì)量的分析這一多重篩選，可以最大程度降低信號(hào)干擾，提高定量檢測(cè)方法的靈敏度。本研究建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為 y=1.448x+544.400，相關(guān)系數(shù)為0.998，線性范圍在50～10 000 pg/mL，方法檢出限為10 pg/mL，定量限為50 pg/mL，該方法具有較好的特異性、精確性、可重復(fù)性，可應(yīng)用于臨床中動(dòng)物施用OT后血漿中OT濃度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Mccarthy M M，Altemus M. Central nervous system actions of oxytocin and modulation of behavior in humans[J]. Molecular Medicine Today，1997，3（6）：269-275.

[2]Nachum Z，Garmi G，Kadan Y，et al. Comparison between amniotomy，oxytocin or both for augmentation of labor in prolonged latent phase：a randomized controlled trial[J]. Reproductive Biology and Endocrinology，2010，8（1）：136-143.

[3]Gross M M，F(xiàn)roemke C，Hecker H. The timing of amniotomy，oxytocin and neuraxial analgesia and its association with labour duration and mode of birth[J]. Archives of Gynecology and Obstetrics，2014，289（1）：41-48.

[4]Gohil J T，Tripathi B. A study to compare the efficacy of misoprostol，oxytocin，methyl-ergometrine and ergometrine-oxytocin in reducing blood loss in active management of 3rd stage of labor[J]. The Journal of Obstetrics and Gynecology of India，2011，61（4）：408-412.

[5]Iqbal Z，Rahman Z U，Muhammad F，et al. Effect of oxytocin on serum biochemistry，liver enzymes，and metabolic hormones in lactating Nili Ravi buffaloes[J]. Tropical Animal Health and Production，2015，47（1）：21-27.

[6]Lv Y L，F(xiàn)eng M，Che T T，et al. CCK mediated the inhibitory effect of oxytocin on the contraction of longitudinal muscle strips of duodenum in male rats[J]. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology，2010，460（6）：1063-1071.

[7]Borg J，Ohlsson B. Oxytocin prolongs the gastric emptying time in patients with diabetes mellitus and gastroparesis，but does not affect satiety or volume intake in patients with functional dyspepsia[J]. BMC Research Notes，2012，5（1）：148-155.

[8]Coiro V，Saccani-Jotti G，Rubino P A，et al. Oxytocin inhibits the stimulatory effect of ghrelin on circulating neuropeptide Y levels in [JP3]humans[J]. Journal of Neural Transmission，2008，115（9）：1265-1267.[JP]

[9]Blevins J E，Ho J M. Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight[J]. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders，2013，14（4）：311-329.[ZK）]

[10]Akther S，Korshnova N，Zhong J，et al. CD38 in the nucleus accumbens and oxytocin are related to paternal behavior in mice[J]. Molecular Brain，2013，6（1）：41-50.

[11][JP2]Zhou Z B，Yang X Y，Yuan B L，et al. Sevoflurane-induced down-[JP]regulation of hippocampal oxytocin and arginine vasopressin impairs juvenile social behavioral abilities[J]. Journal of Molecular Neuroscience，2015，56（1）：70-77.

[12]張珍瑞，葉鑫先，郭凡溪，等. 飼料中輔酶Q10反相高效液相色譜檢測(cè)方法的建立[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2016，37（1）：47-50.

[13]肖文華，方玉桂，常婷婷，等. 雞可食性組織中癸氧喹酯殘留的HPLC檢測(cè)方法[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2014，35（4）：41-45.

[14]Reimert I，Bolhuis J E，Kemp B，et al. Emotions on the loose：emotional contagion and the role of oxytocin in pigs[J]. Animal Cognition，2015，18（2）：517-532.

[15]Larsimont V，Bogaards M，Mulleneers P，et al. Analysis of leucine enkephalin by high-performance liquid chromatography using enzymatic derivatization by tyrosinase and electrochemical or fluorescence detection[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，1999，19（6）：855-864.

[16]Karbiwnyk C M，F(xiàn)aul K C，Turnipseed S B，et al. Determination of oxytocin in a dilute IV solution by LC-MSn[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2008，48（3）：672-677.

[17]Baliyan P K，Singh R P，Arora S. Liquid chromatography-mass spectrometry determination of oxytocin in cow milk[J]. Asian Journal of Chemistry，2009，21（1）：397-402.