黨參可溶性粉對小鼠抗應(yīng)激和免疫功能的影響

楊絨娟，石軼男，扆妍妍，孫耀貴，孫 娜，李宏全

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801）

黨參可溶性粉對小鼠抗應(yīng)激和免疫功能的影響

楊絨娟，石軼男，扆妍妍，孫耀貴，孫 娜，李宏全

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801）

研究旨在評價黨參可溶性粉的抗應(yīng)激和免疫調(diào)節(jié)能力，為申報新獸藥提供藥效學(xué)資料。通過觀測小鼠負(fù)重游泳時間和常壓耐缺氧時間來評價黨參可溶性粉的抗應(yīng)激作用，通過測定小鼠免疫臟器指數(shù)、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能和溶血素抗體水平評價其免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，黨參可溶性粉能極顯著延長小鼠的負(fù)重游泳時間（P＜0.01）和常壓缺氧條件下的存活時間（P＜0.01），能顯著或極顯著提高免疫器官指數(shù)（P＜0.05）、吞噬指數(shù)和吞噬系數(shù)（P＜0.01或P＜0.05），并可顯著或極顯著提高綿羊紅細(xì)胞所致小鼠溶血素抗體水平（P＜0.01或P＜0.05）。黨參可溶性粉具有抗應(yīng)激和免疫增強功能，可為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

黨參可溶性粉；抗應(yīng)激；免疫功能

黨參為桔?？浦参?，性味甘平，為補氣良藥，是傳統(tǒng)中醫(yī)常用的藥材[1]。其在我國分布廣泛，為滿足臨床使用需要，栽培量大。根據(jù)產(chǎn)地的不同，黨參可分為西黨、川黨、白黨、甘孜黨、新疆黨等多種商品品種[2]。山西潞黨非常有名，山西是黨參的主產(chǎn)地之一，多糖是黨參的主要活性成分，其作用研究較為廣泛和深入。針?gòu)筟3]測定了10批不同基源潞黨的多糖含量，其均值為18.39%，其中長治市壺關(guān)縣所生產(chǎn)的黨參多糖含量最高可達(dá)38.11%。據(jù)報道，黨參多糖具有調(diào)節(jié)免疫[4]、抗炎[5]、降血糖[6]、抗衰老[7]、保護(hù)腸粘膜[8]等功能。而黨參可溶性粉的有效成分即為多糖。

本試驗通過給小鼠灌胃不同劑量的黨參可溶性粉，觀測小鼠負(fù)重游泳時間、常壓耐缺氧時間，從而評價黨參可溶性粉的抗應(yīng)激能力；通過測定小鼠免疫臟器指數(shù)、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能、溶血素抗體水平評價黨參可溶性粉的免疫調(diào)節(jié)能力。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

KM小鼠，SPF級，雌雄各占1/2，體質(zhì)量18～20 g，由中國食品藥品檢定研究院提供，許可證號為SCXK（京）2014-0013。正式試驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。在清潔級動物室中飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度20～24℃，濕度50%～70%。

1.2 試驗器材及試劑

玻璃缸（40 cm×30 cm×60 cm）、灌胃針、注射器、負(fù)重物（每個2 g）、電子臺秤、電子天平、溫度計、秒表、250 mL磨口廣口瓶、分光光度計、離心機、水浴鍋。

黨參可溶性粉由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)臨床實驗室提供（規(guī)格：每1 g含黨參多糖不少于500 mg）。原藥材黨參購自安國市建宇中藥材有限公司，批號140701；陽性藥物為黨參多糖口服液，購自江西新世紀(jì)民星動物保健品有限公司，獸藥字（2014）140125283，批號：20140915；生理鹽水；鈉石灰；凡士林；碳酸鈉；豚鼠血清；都氏試劑。

1.3 綿羊紅細(xì)胞稀釋液的配制

無菌條件下采用頸靜脈采血法對成年綿羊進(jìn)行采血，為去除纖維蛋白，將新鮮血液置于滅菌錐形瓶中，加入滅菌玻璃球搖動10 min，再加入Alsever溶液（V羊血∶VAlsever溶液＝1∶2）混勻，放置4℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲凭d羊紅細(xì)胞稀釋液（SRBC）時需現(xiàn)用現(xiàn)配，用生理鹽水將保存的綿羊紅細(xì)胞液洗滌3次，3 000 r/min離心5 min，棄上清。再用生理鹽水稀釋紅細(xì)胞（V生理鹽水∶V紅細(xì)胞＝3∶5），使紅細(xì)胞濃度為20億個/mL。

1.4 試驗方法

各試驗分組及給藥方式為：將小鼠隨機分為5組，即空白對照組，陽性藥物對照組，黨參可溶性粉低、中、高劑量組（2，4，8 g/kg）；每組10只，雌雄各占1/2，各給藥組連續(xù)灌胃5 d，每天一次，空白對照組灌胃等容量的生理鹽水。

1.4.1 黨參可溶性粉對小鼠負(fù)重游泳時間的影響[9]

各組小鼠于末次給藥60 min后，尾部負(fù)重2 g鉛線，置水溫25℃、水深20 cm的玻璃缸水中游泳，觀察小鼠游泳至力竭所用的時間，即小鼠在水下10 s不能上浮，該時間即為小鼠游泳時間。

1.4.2 黨參可溶性粉對小鼠常壓耐缺氧的影響[9]稱量10 g鈉石灰于250 mL磨口廣口瓶內(nèi)備用，各組小鼠于末次灌胃給藥60 min后，將單只小鼠分別放進(jìn)各廣口瓶內(nèi)，用凡士林將瓶口密封，肥皂水檢查確保不漏氣后，開始計時，直至小鼠呼吸停止，即為小鼠常壓耐缺氧時間。

1.4.3 黨參可溶性粉對小鼠免疫臟器指數(shù)的影響[10]各組小鼠于末次給藥24 h后，稱體質(zhì)量。脫頸處死，摘出胸腺及脾臟稱質(zhì)量，計算胸腺或脾指數(shù)。

1.4.4 黨參可溶性粉對小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響[11]各組小鼠于末次給藥24 h后，稱體質(zhì)量，將稀釋的印度墨汁（0.1 mL/10 g）經(jīng)尾靜脈注射后開始計時，第30秒及第6分鐘時用微量采血吸管在小鼠眼眶后靜脈叢取25 μL血量，立即打入2 mL 0.1%Na2CO3液中，吹打數(shù)次。取正常小鼠血液25 μL，打入2 mL 0.1%Na2CO3液中校零，用分光光度計在675 nm處測定各組吸光度。脫頸處死小鼠，剝離肝臟及脾臟稱質(zhì)量，計算吞噬指數(shù)（K）及吞噬系數(shù)（α）。

式中，OD1表示T1時小鼠血液吸光度值，OD2表示T2時小鼠血液吸光度值；T1表示第1次取血時間，T2表示第2次取血時間；W表示小鼠體質(zhì)量，WLS表示肝與脾質(zhì)量之和。

1.4.5 黨參可溶性粉對綿羊紅細(xì)胞所致小鼠溶血素抗體生成的影響[10]各組小鼠于末次給藥48 h后，各組采用腹腔注射SRBC（0.2 mL/鼠）進(jìn)行免疫，免疫后第6天，眼球采血，將其放入4℃冰箱，4 h后，用4℃離心機以3 500 r/min離心5 min取血清。將血清稀釋后（V血清∶V生理鹽水＝1∶500）參照表1進(jìn)行加樣處理，于37℃恒溫箱中孵育10 min后，立即冰浴終止反應(yīng)，3 000 r/min離心10 min，取上清1 mL，加都氏試劑3 mL于試管中，充分搖勻，放置10 min，以對照管校準(zhǔn)調(diào)零，用分光光度計在540 nm處測定樣品管吸光度。

表1 溶血素測定方法

式中，HC50表示小鼠的半數(shù)溶血值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

將數(shù)據(jù)用Excel整理后，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計。運用單因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）計算各項指標(biāo)平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，用LSD法和Duncan's多重比較對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。試驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黨參可溶性粉對小鼠負(fù)重游泳時間的影響

由表2可知，與空白對照組相比，黨參可溶性粉中、高劑量組和陽性藥物對照組均能極顯著延長小鼠的負(fù)重游泳時間（P＜0.01）；黨參可溶性粉低劑量組負(fù)重游泳時間比空白對照組延長了21.42%，但差異不顯著（P＞0.05）。與陽性藥物對照組相比，黨參可溶性粉中、高劑量組無顯著性差異（P＞0.05）。說明黨參可溶性粉可增加小鼠負(fù)重游泳時間，且呈劑量依賴性。

表2 黨參可溶性粉對小鼠游泳時間的影響

2.2 黨參可溶性粉對小鼠常壓耐缺氧的影響

由表3可知，與空白對照組相比，黨參可溶性粉中、高劑量組均能極顯著延長小鼠常壓耐缺氧時間（P＜0.01）；黨參可溶性粉低劑量組和陽性藥物對照組常壓耐缺氧時間比空白對照組分別延長了10.79%和18.76%，但差異不顯著（P＞0.05）。與陽性藥物對照組相比，黨參可溶性粉中劑量和高劑量組常壓耐缺氧時間分別延長了11.54%和7.52%，但差異不顯著（P＞0.05）。

表3 黨參可溶性粉對小鼠常壓耐缺氧的影響

2.3 黨參可溶性粉對小鼠免疫臟器指數(shù)的影響

表4 黨參可溶性粉對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

從表4可以看出，與空白對照組相比，黨參可溶性粉中、高劑量組和陽性藥物對照組均顯著提高了脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)（P＜0.05）；黨參可溶性粉低劑量組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均有增高趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）。小鼠胸腺指數(shù)的增高呈劑量依賴性。

2.4 黨參可溶性粉對網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響

從表5可以看出，與空白對照組相比，黨參可溶性粉中、高劑量組和陽性藥物對照組均能極顯著提高吞噬指數(shù)和吞噬系數(shù)（P＜0.01）；黨參可溶性粉低劑量組均顯著提高了吞噬指數(shù)和吞噬系數(shù)（P＜0.05）。小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的增強呈藥物劑量依賴性。

表5 黨參可溶性粉對小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響

2.5 黨參可溶性粉對小鼠溶血素水平的影響

由表6可知，與空白對照組相比，黨參可溶性粉中、高劑量組均可顯著提高小鼠血清溶血素的水平（P＜0.05）；陽性藥物對照組極顯著提高了小鼠血清溶血素的水平（P＜0.01）；黨參可溶性粉低劑量組溶血素水平提高了26.0%，但差異不顯著（P＞0.05）。黨參可溶性粉中、高劑量組的溶血素水平均低于陽性藥物對照組，但差異不顯著性（P＞0.05）。

表6 黨參可溶性粉對小鼠溶血素水平的影響

3 討論

3.1 黨參可溶性粉的抗應(yīng)激作用

廣義的應(yīng)激是機體為維持平衡穩(wěn)態(tài)發(fā)生的積極反應(yīng)過程，是從一種平衡穩(wěn)態(tài)過渡到另一種平衡穩(wěn)態(tài)的反應(yīng)過程。而一般在動物飼養(yǎng)生產(chǎn)過程中所講的應(yīng)激是有害刺激[12]。狹義的應(yīng)激是動物機體受到不良刺激時發(fā)生的一種非特異性反應(yīng)，當(dāng)動物遭受應(yīng)激原刺激后，由中樞神經(jīng)系統(tǒng)識別刺激，使機體生物學(xué)機能發(fā)生變化，機體產(chǎn)生代償性代謝，使原本用于生產(chǎn)繁殖的動物機體生產(chǎn)下降、繁殖受阻、免疫力降低，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的收益和動物福利[13]。疲勞、缺氧等是常見的應(yīng)激原，所以，觀測小鼠負(fù)重游泳時間和常壓缺氧條件下的存活時間是評價藥物抗應(yīng)激能力的重要指標(biāo)。近年來研究表明，植物多糖具有抗應(yīng)激的作用，比如山藥多糖[14]、刺梨多糖[15]。本試驗結(jié)果表明，黨參可溶性粉組、陽性對照組與空白對照組相比，小鼠的負(fù)重游泳時間和常壓耐缺氧時間都有所延長，且對小鼠負(fù)重游泳時間的延長呈劑量依賴性。黨參可溶性粉中劑量與陽性對照組相比，原藥材的用量相當(dāng)，但常壓耐缺氧時間延長了11.54%，表明黨參可溶性粉在常壓耐缺氧時間上優(yōu)于黨參多糖口服液，且具有抗應(yīng)激能力。

3.2 黨參可溶性粉的免疫增強作用

本試驗在特異性免疫和非特異性免疫2個方面研究了黨參可溶性粉的免疫增強能力。胸腺和脾在動物機體中是舉足輕重的免疫器官，胸腺是中樞免疫器官，主要發(fā)育、分化、成熟T淋巴細(xì)胞，被運輸至全身各個淋巴結(jié)、脾臟等外周組織參與細(xì)胞免疫。脾是機體最大的免疫器官，含有大量的B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，參與機體體液免疫和細(xì)胞免疫。大量研究表明，免疫器官指數(shù)增加可以反映非特異性免疫能力的增強[16-19]，黨參可溶性粉組和陽性對照組與空白對照組相比，均能提高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。黨參可溶性粉中劑量和高劑量與空白對照組相比，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著提高，且與胸腺指數(shù)的提高呈劑量依賴性。

網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)又名單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，其吞噬能力是反映機體非特異性免疫的指標(biāo)之一，是動物重要的防御系統(tǒng)[20]。當(dāng)顆粒異物或某些可溶性異物作為抗原性物質(zhì)進(jìn)入機體時，單核巨噬細(xì)胞對抗原進(jìn)行加工、吞噬、處理，將抗原遞呈給淋巴細(xì)胞后產(chǎn)生抗體，增強清除體內(nèi)有害物質(zhì)的能力。尾靜脈注射恒定的印度墨汁后，迅速被脾和肝上的巨噬細(xì)胞吞噬和清除，血流中異物被清除的速率可反映單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力[21]。本試驗中黨參可溶性粉組和陽性對照組與空白對照組相比，吞噬指數(shù)和吞噬系數(shù)均提高，雖然黨參可溶性粉中、高劑量組的溶血素水平低于陽性對照組，但差異不顯著。說明黨參可溶性粉和陽性藥物對照可在一定程度上提高單核巨噬細(xì)胞的吞噬異物能力，進(jìn)而提高網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的防御能力，增強機體免疫能力。

小鼠血溶素水平是反映機體特異性免疫的重要指標(biāo)。綿羊紅細(xì)胞作為小鼠的抗原性異物，免疫小鼠后使它的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體，并釋放至外周血，免疫小鼠血清和綿羊紅細(xì)胞一同孵育，在補體參與下發(fā)生溶血現(xiàn)象，血紅蛋白被釋放出來，則可以通過液體顏色的深淺測得小鼠血溶素抗體水平，由此反映機體的體液免疫能力[22]。本試驗結(jié)果表明，黨參可溶性粉組和陽性對照組與空白對照組相比，均可提高小鼠血清溶血素的水平。

本試驗通過特異性免疫和非特異性免疫的研究，全面說明了黨參可溶性粉具有免疫增強作用。陽性藥物對照組結(jié)果與晏永新等[23]的研究結(jié)果相符。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，黨參可溶性粉能使小鼠的負(fù)重游泳時間和常壓缺氧條件下的存活時間顯著延長；能不同程度提高免疫器官指數(shù)和增強網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，提高綿羊紅細(xì)胞所致小鼠溶血素抗體水平。表明黨參可溶性粉具有增強小鼠抗應(yīng)激和免疫調(diào)節(jié)作用的功能。

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Effects of Codonopsis Soluble Powder on the Anti-stress and Immunologic Function in Mice

YANGRongjuan，SHI Yinan，YI Yanyan，SUNYaogui，SUNNa，LI Hongquan

（College ofAnimal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The assay aims to evaluate the effect of codonopsis soluble powder on the anti-stress and immunologic function,which provides information for the application ofnew veterinary drugs.The loaded swimming time and anti-hypoxia under atmospheric pressure time ofmice were observed to assess the anti-stress effect ofcodonopsis soluble powder.The immune organ index,phagocytic function of reticuloendothelial system and hemolysin antibody level in mice were measured to evaluate the regulating immune function of the codonopsis soluble powder.The results showed that codonopsis soluble powder significantly increased the loaded swimming time（P＜0.01）and the anti-hypoxia under atmospheric pressure time（P＜0.01）.The immune organ index（P＜0.05）,phagocytic index and phagocytic coefficient（P＜0.01 or P＜0.05）significantly enhanced.There were significant increase hemolysin antibody level of mice induced by sheep erythrocyte（P＜0.01 or P＜0.05）.In conclusion,codonopsis soluble powder enhanced anti-stress and regulated immune function in mice,which provided a theoretical basis for clinical application.

codonopsis soluble powder;anti-stress;immunologic function

R285

A

1002-2481（2017）03-0398-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.03.19

2016-12-29

農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目（2014GB2A300003）

楊絨娟（1991-），女，山西運城人，在讀碩士，研究方向：中藥調(diào)節(jié)免疫及其分子機制。李宏全為通信作者。