不同誘導(dǎo)子對黃芪有效成分積累的影響

劉惠娟，梁建萍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

不同誘導(dǎo)子對黃芪有效成分積累的影響

劉惠娟，梁建萍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

為了篩選可以促進(jìn)黃芪有效成分積累的誘導(dǎo)子種類及濃度，以大同渾源蒙古黃芪的種子為原料，用不同濃度SA，SNP，NAA浸種，進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，并對黃芪根部多糖、黃酮、皂苷含量及苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性進(jìn)行測定，應(yīng)用單因素方差分析和相關(guān)性分析法，對不同誘導(dǎo)子處理下黃芪的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了綜合評價(jià)分析。結(jié)果表明，15 μmol/L SA，15 mmol/L SNP，1.0 mg/L NAA可以顯著促進(jìn)黃芪有效成分的積累，其中，SA對黃酮效果明顯；SNP對皂苷效果明顯；NAA對多糖效果明顯，并且PAL活性和黃酮含量之間存在正相關(guān)性。

誘導(dǎo)子；有效成分；單因素方差分析

黃芪為豆科植物膜莢黃芪的根[1]，主要藥效成分為黃酮、皂苷和多糖等，有補(bǔ)氣固表、脫毒排膿、生肌等功效[2]。但由于其一味依賴野生，疏于人工管理，且品質(zhì)混雜，種質(zhì)退化，直接造成黃芪有效成分差異較大，生長年限加長，產(chǎn)量降低。誘導(dǎo)子是一類能通過選擇性誘導(dǎo)植物特定基因的表達(dá)，進(jìn)而活化特定的次生代謝途徑，從而提高植物次生代謝物含量的物質(zhì)[3]，根據(jù)性質(zhì)可將其分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子。早期有學(xué)者的研究表明，不同誘導(dǎo)子可以顯著影響作物的生長和有效成分的積累[4-14]。

本試驗(yàn)參照誘導(dǎo)子對其他中藥材有效成分的影響，選用水楊酸（Salisalic acid，SA）、萘乙酸（Naphthalene acetic acid，NAA）和硝普鈉（Sodium Nitroprusside，SNP）作為非生物誘導(dǎo)子，研究不同濃度的SA，NAA和SNP對蒙古黃芪次生代謝產(chǎn)物積累的影響，以期提高黃芪有效成分含量、質(zhì)量，解決黃芪種植遇到的瓶頸，從而滿足國內(nèi)外對我國中藥材的需求。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試黃芪種子來自大同渾源麗珠黃芪基地，經(jīng)鑒定為蒙古黃芪。

1.2 供試土壤

土壤取自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中藥材基地，基本理化性質(zhì)為：水解氮0.133 mg/100 g；速效P 303.45 mg/kg；有機(jī)質(zhì)1.71%；速效K 158 mg/kg。對黃芪需肥特性的研究表明[15]，每生產(chǎn)100 kg黃芪藥材需從土壤和肥料中吸收2.32 kg N，0.323 kg P2O5，1.62 kg K2O，優(yōu)化施肥方案為N138～156 kg/hm2，P2O579～85 kg/hm2，K2O 122～143 kg/hm2，配比為1∶0.5∶0.87。通過添加基質(zhì)并且按照土∶基質(zhì)為2∶1的比例進(jìn)行混合，得到的混合種植土壤基本能滿足黃芪栽培的最適N，P，K配比。

所用SA，NAA，SNP由天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

黃芪種子用濃硫酸處理，稍微晾干后備用。用已經(jīng)配制好的不同濃度梯度的SA，SNP及NAA進(jìn)行浸種處理，空白對照用自來水浸種（表1）。7 d以后，將種子均勻播種于花盆中，花盆中土壤距離盆頂10 cm，為保證土壤濕潤，在播種前2 d澆透水。播種時(shí)每盆均勻撒10粒種子，用土薄薄蓋一層，以保證呼吸作用順暢。之后不定期進(jìn)行澆水、除草、除蟲，保證黃芪幼苗可以正常生長。由于幼苗抵抗陽光能力弱，要在幼苗期前后搭建遮陽棚，避免太陽直射，燒壞幼苗。待長出2片真葉以后可以逐漸移除遮陽網(wǎng)，讓黃芪充分利用陽光進(jìn)行光合作用。

表1 不同處理水平

1.4 測定項(xiàng)目及方法

在黃芪生長至100 d（到達(dá)干物質(zhì)積累最高時(shí)期）時(shí)進(jìn)行采樣，選擇同一處理下長勢相近的黃芪植株15株，分為3組，為3個(gè)重復(fù)。采集的鮮樣采用紫外吸收法[16]測定PAL活性。烘干的樣品用FW100型高速萬能粉碎機(jī)研磨成粉，過0.6 mm篩，用于有效成分的測定，黃酮含量的測定采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[17]；皂苷含量的測定采用香草醛-硫酸比色法；多糖含量的測定采用蒽酮-硫酸比色法[18]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

通過對試驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集整理，使用SPSS 19.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了處理與統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對黃酮含量及黃酮經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的影響

由表2可知，SA處理下黃酮含量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量都極顯著高于空白對照，平均值分別為11.402 mg/g和21.167 mg，尤以SA15效果明顯；其次是NAA處理，4個(gè)濃度下，黃酮含量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量都極顯著高于空白對照，平均值分別為4.705 mg/g和8.063 mg，其中，NAA1.0處理最為明顯；SNP10，SNP15，SNP20處理下，黃酮含量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量都高于空白對照，平均值分別為2.432 mg/g和4.759 mg，SNP25由于濃度過高，抑制黃酮合成。因此，SA可以有效提高黃芪黃酮含量及經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。

表2 不同處理對黃酮含量及黃酮經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的影響

2.2 不同處理對皂苷含量及皂苷經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的影響

由表3可知，SNP處理下皂苷含量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量都極顯著高于空白對照，平均值分別為4.141 mg/g和7.813 mg，尤其以SNP15的效果最為明顯；其次是NAA處理，4個(gè)濃度下，皂苷含量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量都極顯著高于空白對照，平均值分別為3.877 mg/g和 6.857 mg，以NAA1.0處理的效果最為明顯；SA10，SA15處理下皂苷含量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量均高于空白對照，SA20處理由于濃度過高，抑制了皂苷合成。因此，SNP可以有效地提高黃芪的皂苷含量及經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。

表3 不同處理對皂苷含量及皂苷經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的影響

2.3 不同處理對多糖含量及多糖經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的影響

由表4可知，NAA處理下多糖含量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量都極顯著高于空白對照，平均值分別為3.899 mg/g和8.124 mg，尤以NAA1.0效果明顯；其次是SA處理，3個(gè)濃度下，多糖含量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量都極顯著高于空白對照，平均值分別為3.680 mg/g和6.563 mg，其中SA15處理最為明顯；SNP處理下多糖含量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量都高于空白對照，平均值分別為2.928 mg/g和5.806 mg，但是相比于SA和NAA較低。因此，NAA可以有效提高黃芪多糖含量及經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。

表4 不同處理對多糖含量及多糖經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的影響

2.4 不同處理對PAL活性的影響

由表5可知，SA，SNP，NAA處理下PAL活性都極顯著高于空白對照，依次為SNP＞NAA＞SA，平均值分別為972.153，943.153，804.815 U/（g·min），其中，SNP15的效果最為顯著。說明3種外源物質(zhì)均可以有效提高黃芪體內(nèi)PAL活性，其中，SNP效果最為顯著。

表5 不同處理對PAL活性的影響 U/（g·min）

2.5 PAL與黃酮含量的相關(guān)性分析

通過SPSS 19.0軟件進(jìn)行PAL與黃酮的相關(guān)性分析，結(jié)果得出，PAL與黃酮含量之間相關(guān)系數(shù)為0.337，表明2個(gè)變量低度相關(guān)（0.3≤r＜0.5）；但二者之間不相關(guān)的雙尾檢驗(yàn)值（s）為0.310（s＞0.05），否定了二者不相關(guān)的假設(shè)，因此，PAL與黃酮含量之間存在正相關(guān)性。

3 討論與結(jié)論

水楊酸是一種常用的外源物質(zhì)，可以有效促進(jìn)植物體內(nèi)次生代謝活動及次生代謝產(chǎn)物的積累。本試驗(yàn)結(jié)果表明，通過不同濃度梯度的水楊酸浸種，可以極顯著地促進(jìn)黃芪體內(nèi)黃酮的積累，這與已有的研究結(jié)果一致。梅興國等[19]試驗(yàn)證實(shí)，SA可提高苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性，且20 mg/L SA對紫杉醇的促進(jìn)效果最明顯，此時(shí)紫杉醇含量是對照的13倍。楊世海等[20]研究表明，SA對毛狀根生長的影響作用不顯著，但對總黃酮的積累有明顯的促進(jìn)作用，濃度為20 μmol/L的SA可使總黃酮量達(dá)到83.561 μg/mg，是原植物的2.9倍，是未加激素處理毛狀根總黃酮量的1.9倍。

硝普鈉是NO的前體物質(zhì)，徐茂軍等[21]研究外源NO對金絲桃懸浮細(xì)胞生長及金絲桃素生物合成的影響，結(jié)果表明，在15.0 mmol/L的SNP處理下，金絲桃懸浮細(xì)胞中的苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性顯著升高，推測NO可能通過觸發(fā)金絲桃懸浮細(xì)胞的防衛(wèi)反應(yīng)，激活了細(xì)胞中金絲桃素的生物合成途徑。劉軍等[22]研究表明，液體培養(yǎng)基中NH4+∶NO3－的濃度比為1∶2時(shí)，金鐵鎖毛狀根的生物量和皂苷積累量為最佳。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，通過SNP浸種，黃芪中皂苷含量顯著提高，而且效果明顯優(yōu)于SA和NAA。

黃芪作為一種重要的傳統(tǒng)中藥，其干燥根中有很高的黃酮含量。PAL催化了苯丙烷合成途徑的第一步，并且也是限速酶，為包括黃酮在內(nèi)的多種次生代謝提供了前體物質(zhì)。一個(gè)PAL基因，從黃芪中分離而來的AmPAL1，帶有2 562個(gè)核苷酸的cDNA及2 154個(gè)堿基對的開放閱讀框。一種存在于不同年齡黃芪中的黃酮，與PAL酶活性有關(guān)。轉(zhuǎn)AmPAL1基因煙草在花椰菜病毒35S啟動子的控制下PAL活性顯著提高，表明PAL可能是黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶。通過相關(guān)性分析也得出，PAL與黃酮含量之間存在正相關(guān)性。

藥用植物有效成分合成積累研究是中藥材GAP種植的核心內(nèi)容，通過有效成分合成與環(huán)境條件相關(guān)性研究，可以確定藥材適宜的生產(chǎn)環(huán)境，建立系統(tǒng)而標(biāo)準(zhǔn)化的田間管理和采收加工規(guī)程，進(jìn)而提高中藥材的質(zhì)量，促進(jìn)中藥材產(chǎn)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化和現(xiàn)代化發(fā)展。本研究將植物逆境生理與有效成分積累結(jié)合起來，取得了不錯(cuò)的結(jié)果。SA，SNP及NAA均可以明顯促進(jìn)黃芪3種有效成分的積累，SA更能作用于黃酮積累，以15 μmol/L最佳；SNP更能作用于皂苷積累，以15 mmol/L最佳；NAA對多糖效果更加明顯，以1.0 mg/L最佳。因此，可以在黃芪種植中添加合適的外源物質(zhì)，針對性地提高某些有效成分的積累，從而達(dá)到黃芪產(chǎn)量、質(zhì)量雙豐收。

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Effects of Different Elicitors on Accumulation of Astragalus membranaceus Effective Components

LIUHuijuan，LIANGJianping

（College ofLife Science，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

For collecting the elicitors that can promote accumulation of Astragalus effective components,the paper chooses seeds from Datong as experimental materials,soaks seeds with different concentrations of SA,SNP,NAA,plants in flowerpots,then determines the contents of polysaccharide,flavonoids,astragalosides and activity of PAL,comprehensively evaluates every index under different elicitors by ANOVA and the methods of correlation analysis.The results show that 15 μmol/L SA,15 mmol/L SNP,1.0 mg/L NAA can significantly promote the accumulation ofeffective components,SAhas more obvious effect on flavonoids,SNP on astragalosides and NAA on polysaccharide,and there is a positive correlation between PALactivity and flavonoids content.

elicitors;effective components;one-way analysis ofvariance（one-way ANOVA）

S567.23＋9

A

1002-2481（2017）03-0394-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.03.18

2016-11-04

劉惠娟（1992-），女，山西壽陽人，在讀碩士，研究方向：植物逆境生理與分子生物學(xué)。梁建萍為通信作者。