不同基因型煙草的細胞毒性與致突變性分析

張永健，魏克強，楊進文

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.山西農業(yè)大學農學院，山西太谷030801）

不同基因型煙草的細胞毒性與致突變性分析

張永健1，魏克強1，楊進文2

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.山西農業(yè)大學農學院，山西太谷030801）

為了解不同基因型煙草的毒理學效應，分別采用中性紅試驗和Ames試驗分析比較3個遠緣雜交品系GZY-4，GZY-6，GZY-9和1個主栽烤煙品種NDY-1的煙霧提取物（CSE）對中國倉鼠卵巢細胞（CHO）和鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株的細胞毒性與致突變性。結果顯示，與NDY-1相比，GZY-4，GZY-6和GZY-9誘導的CHO存活率較高，其中，GZY-4和GZY-6的EC50顯著增大（P＜0.05），4個材料的細胞毒性大小依次為NDY-1＞GZY-9＞GZY-6＞GZY-4。CSE加S9后的致突變性明顯高于不加S9的致突變性；與NDY-1相比，GZY-4和GZY-9均降低了CSE的移碼突變和堿基置換能力，但GZY-6降低致突變的作用尤為顯著（P＜0.05）；不同雜交品系的CSE致突變性也存在一定的差異。通過遠緣雜交技術對煙草進行遺傳改良，對提高煙草的安全性與可用性具有重要的意義。

煙草；煙霧提取物；細胞毒性；致突變性

煙草（N.tobacum）是重要的經濟作物，然而，吸煙有害健康，世界煙草業(yè)正面臨著巨大的挑戰(zhàn)。長期以來，世界各國致力于研制“低毒少害，相對安全”的卷煙制品[1]。研究表明，煙草通過燃燒、裂解、蒸餾、冷凝等一系列復雜的物理化學過程，形成的煙霧氣溶膠含有4 800余種化學成分，其中，既有提供香氣、吃味和生理作用的物質，也有產生雜氣、刺激的物質，還有苯并芘、亞硝胺、煙堿等有害的物質[2-4]。煙草化學成分的形成與生態(tài)環(huán)境、品種類型、栽培技術等多種因素密切相關[5-6]。不同基因型煙草品種的化學成分存在較大的差異，直接影響了卷煙制品的安全性和可用性，培育低毒少害的品種已成為當前我國煙草育種的主攻方向[7-8]。

煙草化學成分的差異會導致釋放的煙霧產生不同的毒理學效應[9]。目前，國內外對卷煙制品的毒理學研究，通常采用國際煙草科學研究合作中心（CORESTA）推薦的體外毒性測試方法，即以哺乳動物細胞系細胞毒性分析（中性紅試驗）和細菌誘變分析（Ames試驗）來評價煙氣部分化學成分（主流煙氣粒相凝集物）的相對毒性[10]。比較不同基因型煙草的體外毒性對優(yōu)良品種的選育具有重要的指導意義。

本研究以GZY-4，GZY-6和GZY-9等3個遠緣雜交品系為材料，以主栽烤煙品種NDY-1為對照，分析其煙霧提取物（CSE）的細胞毒性與致突變性，旨在為煙草品種的遺傳改良提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料

GZY-4，GZY-6和GZY-9為煙草遠緣雜交品系，NDY-1為煙草栽培品種[11]，均由山西農業(yè)大學煙草育種研究室提供，測試所用的單料煙由山西昆明煙草有限責任公司卷制；中國倉鼠卵巢細胞（CHO），購自上海通派生物科技有限公司；鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型標準菌株TA97，TA98，TA100和TA102，由中國檢驗檢疫研究院提供；健康、清潔級SD雄性大鼠，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。

1.2 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基（HyClone）；胎牛血清（Hyclone）。胰蛋白酶（TransGen）；二氨基芴、敵克松（Sigma）。二甲基亞砜、中性紅染料、多氯聯(lián)苯等均為國產分析純。

1.3 儀器

多功能酶標儀（Spectra Max M5，美國）；倒置顯微鏡（Olympus BX 51，日本）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Galaxy 170S，上海創(chuàng)奕）；超凈工作臺（VS-840-1，上海博迅）；水浴振蕩器（HZS-H，哈爾濱東聯(lián)）；微量振蕩器（MH-2，上海博迅）；高速冷凍離心機（KDC-140HR，安徽中科中佳）；高速勻漿機（S10，寧波新芝）。

1.4 方法

1.4.1 香煙煙霧提取物（CSE）的制備 其按照陸葉珍[12]、李威[13]的方法進行。先將卷煙樣品置于溫度22℃、濕度60%的培養(yǎng)箱中水分平衡48 h；然后采用溶液吸收法制備CSE：將香煙與2支串聯(lián)的吸收管相接，管內各裝5 mL DMSO和5 mL磷酸鹽緩沖液（PBS），抽吸裝置為50 mL注射器；一次燃燒1支煙，每次抽吸2 s，35 mL抽吸容積，抽吸間隔為58 s，采集過程中應沒有煙霧泄露；重復采集10支煙制備成1.0支/mL的CSE溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 中性紅細胞毒性試驗 中性紅細胞毒性試驗參考SHIN等[14]的方法進行。調節(jié)CHO細胞濃度為5×104個/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，去除細胞培養(yǎng)液，加入200 μL含不同濃度CSE的培養(yǎng)液（0×10-3，2.0×10-3，2.5×10-3，3.3×10-3，4.0×10-3，5.0×10-3支/mL），同時設置相應的空白對照組，每組設置4個復孔，孵育（22±2）h后，倒置顯微鏡下觀察CHO的細胞形態(tài)。棄去培養(yǎng)液，每孔加入中性紅RPMI 1640無血清培養(yǎng)液（50 μg/mL）200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。培養(yǎng)結束后，去除中性紅溶液，每孔加入1%的甲醛溶液200 μL，固定1 min。去除固定液，每孔加入150 μL中性紅萃取液（V蒸餾水∶V乙醇∶V乙酸＝49∶50∶1，現配），置于微量振蕩器上振蕩10 min，采用酶標儀測量540 nm處的吸光度值。

式中，X表示細胞存活率，ODn，ODc，ODo分別為樣品、細胞對照、空白的多孔平均吸光度值。

1.4.3 細菌誘變分析（Ames）試驗 參考GB 15193.4—2003《鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗》[15]的方法進行。

1.4.3.1 大鼠肝微粒體酶S9誘導及制備 多氯聯(lián)苯（PCB）溶于玉米油（質量濃度為200 mg/mL），按500 mg/kg給大鼠腹腔注射，5 d后頸椎脫臼處死。無菌條件下取出肝臟，用冰冷的0.15 mol/L氯化鉀溶液沖洗干凈，稱質量，每克肝加0.1 mol/L的氯化鉀溶液3 mL，用高速勻漿機制成肝勻漿，在4℃高速離心機上以9 000 r/min離心10 min，吸出上清液即為S9原液，臨用時按照1∶9的比例配制成10%的S9混合液。

1.4.3.2 平板摻入法檢測 在加（＋）S9或不加（－）S9活化系統(tǒng)下，用生物學鑒定合格的菌株（TA97，TA98，TA100和TA102）檢測CSE的致突變性。將提取的CSE原液分別稀釋0倍、2倍、4倍、8倍、16倍作為測試劑量組；二氨基芴、敵克松作陽性對照物；用DMSO和PBS緩沖液1∶1混合液作陰性對照物；每組設置3個重復。分別取2 mL保溫的頂層培養(yǎng)基于無菌試管中，依次加入0.1 mL測試菌株，混勻；加入不同濃度的CSE 0.1 mL（需活化時加0.5 mL S9混合液），迅速混合后倒入底層培養(yǎng)基上，平鋪固化后于37℃培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計細菌突變菌落數。

1.5 數據統(tǒng)計

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析處理，數據以均值±標準差表示；各組間比較采用單因素方差分析（P＜0.05為差異顯著）。利用線性回歸計算EC50。

2 結果與分析

2.1 不同煙草CSE對CHO細胞毒性的影響

各測試組的CHO形態(tài)學觀察顯示，對照組細胞以短梭形為主，邊界清晰可見，排列整齊，細胞大小均勻，相鄰細胞間連接較為緊密，貼壁良好，細胞生長旺盛（圖1-A）；而CSE染毒組細胞出現死亡、數量較少，細胞群體呈無序的生長狀態(tài)。GZY-4，GZY-6染毒組細胞形態(tài)多為長梭形，有部分細胞變?yōu)閳A形，細胞排列分散，細胞膜不清晰（圖1-B，1-C）；GZY-9和NDY-1染毒組細胞形態(tài)大多數變?yōu)閳A形，細胞邊界模糊，胞體扁平且寬大，并且NDY-1組出現大量的細胞死亡（圖1-D，1-E）。

從圖2可以看出，4種煙草的CSE對CHO的細胞毒性具有明顯的劑量-效應關系，隨著CSE濃度的增加，各組的細胞存活率均逐漸降低；但與NDY-1相比，各測試組同濃度的CSE呈現出較高的細胞存活率，其大小依次為GZY-4＞GZY-6＞ GZY-9＞NDY-1。

比較4種煙草CSE的EC50值（半最大效應濃度，即50%細胞產生毒性效應的測試樣品濃度）顯示（表1），NDY-1的細胞毒性顯著高于GZY-4和GZY-6（P＜0.05），GZY-9與NDY-1的EC50差異不顯著（P＞0.05），CSE對CHO溶酶體膜的損傷程度依次為NDY-1＞GZY-9＞GZY-6＞GZY-4，這與圖2的分析結果一致。

表1 不同煙草CSE對CHO細胞EC50值的影響

2.2 不同煙草CSE對S.typhimurium （his-）菌株致突變性的影響

Ames分析顯示，與－S9相比，＋S9有助于CSE樣品中某些物質的活化，從而提高其致突變性。無論是－S9還是＋S9，NDY-1對TA97和TA98的致突變性最大；各組CSE的移碼突變能力表現為：與NDY-1相比，GZY-4，GZY-6對TA97，TA98菌株的回復突變數呈現出降低的趨勢；雖然GZY-9也降低了對TA97的回復突變數，但對TA98的回復突變數基本一致；GZY-4，GZY-6和 GZY-9對TA100的堿基置換突變力較NDY-1顯著降低，降低程度依次為GZY6＞GZY-4＞GZY-9；3種CSE對TA102的致突變性也較NDY-1明顯降低。初步表明，CSE對鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株的致突變性大小呈現出NDY-1＞GZY-9＞GZY-4＞GZY-6的趨勢（圖3）。

3 討論

中性紅是一種弱陽離子染料，極易被正常細胞攝取并在溶酶體內聚集。當細胞受到毒物作用，導致細胞膜和溶酶體膜發(fā)生損傷時，細胞的中性紅攝入能力會下降，可以間接反映細胞的存活情況，因此，中性紅試驗被廣泛地用于香煙煙霧的生物學活性檢測[16]。CHO細胞是加拿大衛(wèi)生部推薦用于評估香煙煙霧細胞毒性的細胞系，對香煙煙霧提取物（CSE）的敏感度適中，測試結果比較穩(wěn)定[17]。香煙煙霧中含有大量的自由基，能引起細胞膜中不飽和脂肪酸的脂質過氧化反應，生成對細胞具有毒性作用的過氧化物，直接影響膜結構，以致膜通透性增大，使溶酶體等細胞器膜腫脹、溶解及破壞，導致細胞的廣泛性損傷。本研究結果顯示，高濃度的CSE能夠引起細胞存活率顯著降低，而且不同基因型煙草的細胞毒性存在一定的差異，這與BOMBICK等[18]的研究結果一致。4種煙草的細胞毒性大小依次為NDY-1＞GZY-9＞GZY-6＞GZY-4。GZY-4，GZY-6和GZY-9與NDY-1相比，半最大效應濃度（EC50）分別增加了148.0%，45.9%和8.9%，表明GZY-4和GZY-6能顯著降低對CHO溶酶體膜的損傷（P＜0.05）；GZY-9也降低了其對CHO的細胞毒性，但與NDY-1相比，毒性差異不顯著（P＞0.05）。

Ames試驗以組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌為標準菌株，TA97，TA98用于檢測能發(fā)生移碼突變的誘變劑，TA100用于檢測引起堿基對置換的誘變劑，TA102能檢測出其他測試菌株不能檢出或極少檢出的某些誘變劑。當無組氨酸的培養(yǎng)基中有致突變物存在時，該菌株能回復突變?yōu)橐吧停跓o組氨酸的培養(yǎng)基中生長；香煙煙霧中的NNK、焦油等致癌物，具有較強的致突變作用，故可以根據菌落的回復突變數來衡量香煙煙霧的基因毒性[9，19-20]。本研究結果顯示，CSE加S9后的致突變活性均明顯高于不加S9的致突變活性，這與PREFONTAINE等[21]的研究結果一致；GZY-4，GZY6和GZY-9較NDY-1對TA97的致突變性降低，而GZY-9對TA98的回復突變性無顯著影響；GZY-4，GZY-6和GZY-9也能顯著降低對TA100的致突變活性；在+S9的情況下，GZY-4，GZY6和GZY-9對TA102的致突變性較NDY-1降低，這可能與各基因型煙草的化學成分差異有關[9]。

綜上所述，對煙草品種進行遺傳改良，能夠降低煙草制品的相對毒性。煙草燃燒后，固有化學成分的差異會造成釋放的香煙煙霧化學成分在組成和含量上發(fā)生變化，最終導致不同的毒理學效應[22]，培育優(yōu)良品種可能是提高煙草安全性與可用性的有效措施之一。

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In vitro Analysis on Cytotoxicity and Mutagenicity of Different Genotypes Tobacco

ZHANGYongjian1，WEI Keqiang1，YANGJinwen2

（1.College ofLife Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

To analyze the toxic effects of different genotypes tobacco,including GZY-4,GZY-6,GZY-9 and NDY-1,the neutral red assay and Ames test were used to assess the cytotoxicity and mutagenicity oftheir cigarette smoke extract（CSE）.The results showed that the Chinese hamster ovary（CHO）viability of GZY-4,GZY-6 and NDY-9 was higher than that of NDY-1.Compared with NDY-1, the EC50of GZY-4 and GZY-6 was significantly increased（P＜0.05）.The sequence of the various cytotoxic ability was as follows: NDY-1＞GZY-9＞GZY-6＞GZY-4.S9activation could amplify the mutagenicity response to the Salmonella typhimurium（his-）strains,which were treated by CSE.Compared with NDY-1,the two CSE samples（GZY-4 and GZY-9）could decrease the ability of frameshift mutation and base substitution.Especially,the mutagenic properties of GZY-6 was significantly decreased（P＜0.05）.These results suggested that it was an important meaning to enhance the safety and availability oftobacco by the genetic improvement.

tobacco;CSE;cytotoxicity;mutagenicity

S572

A

1002-2481（2017）03-0374-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.03.14

2016-10-31

國家煙草專賣局重點科技項目（110199901005）；山西省回國留學人員科研資助項目（2013-024）

張永?。?991-），男，山西孝義人，在讀碩士，研究方向：動物分子細胞生物學。魏克強為通信作者。