高壓勻質(zhì)法破碎小球藻細(xì)胞工藝優(yōu)化

魯 龍,畢生雷,金洪波,吳 娟,張鵬飛

(河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司,車用生物燃料技術(shù)國家重點實驗室,河南南陽 473000)

高壓勻質(zhì)法破碎小球藻細(xì)胞工藝優(yōu)化

魯 龍,畢生雷*,金洪波,吳 娟,張鵬飛

(河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司,車用生物燃料技術(shù)國家重點實驗室,河南南陽 473000)

利用小球藻發(fā)酵液作為實驗原料,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以小球藻破碎后的油脂得率為指標(biāo),采用響應(yīng)面實驗研究藻液濃度、勻質(zhì)壓力和勻質(zhì)時間對小球藻破碎后油脂得率的影響。通過建立高壓勻質(zhì)法破碎小球藻細(xì)胞工藝的多元回歸模型,優(yōu)化破碎過程的工藝參數(shù),得到的最佳的工藝條件:藻液濃度140 g/L、勻質(zhì)壓力940 bar、每升藻液勻質(zhì)時間14 min。在此工藝條件下,油脂得率最高可達(dá)51.25%±0.23%。

小球藻,高壓勻質(zhì)法,破碎,響應(yīng)面法

小球藻(Chlorella)屬綠藻門小球藻屬,細(xì)胞組成中脂類占10%～48%。正常和饑餓條件下生長的小球藻在脂肪酸的組成上沒有明顯的差異,脂類物質(zhì)含量的增加主要是脂肪酸積累的結(jié)果[1]。小球藻的研究目前較為成熟,它具有分布廣泛、生長迅速、油脂含量高、環(huán)境適應(yīng)力強等特點,可以作為原料應(yīng)用于生物柴油產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),是目前生產(chǎn)生物柴油最有希望和前途的原料。

為了得到小球藻的油脂,首先要對藻體進(jìn)行破壁,由于藻細(xì)胞較小,具有細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),油脂都包裹在藻細(xì)胞內(nèi),因此如何破碎藻細(xì)胞提取油脂是目前利用微藻生產(chǎn)生物能源的一個難點。目前運用較多的細(xì)胞破碎方法可分為機械法和非機械法[2-3]。機械法包括研磨法、高壓均質(zhì)法、超聲法、反復(fù)凍融法等,這些方法雖然破壁效率高但存在能耗高的問題;而酸熱法、堿熱法、酶解法則屬于非機械法,這些方法的使用則容易影響油脂的質(zhì)量,而且廢水排放存在著明顯的環(huán)保壓力。因此,現(xiàn)階段在進(jìn)行較大規(guī)模的細(xì)胞破碎時,依舊是機械破碎方法應(yīng)用比較廣泛。章瑩穎等[4]將生物法與高速勻漿法、反復(fù)凍融法、超聲法、酸熱法進(jìn)行對比,結(jié)果細(xì)胞破碎率由高到低依次為酸熱法(84%)>超聲法(63%)>反復(fù)凍融法(60%)>高速勻漿法(57%)>生物法(51%);油脂提取率由高到低依次為超聲法(41%)>生物法(35%)>酸熱法(27%)>反復(fù)凍融法(23%)>高速勻漿法(21%)。黃雄超[5]選用小球藻細(xì)胞破碎率為指標(biāo),比較了超聲破碎法、高速勻漿法、反復(fù)凍融法、溶脹法、微波破碎法和酸熱法這6種破壁方法,小球藻細(xì)胞破碎率最高可達(dá)到80.57%。

高壓勻質(zhì)法的應(yīng)用多見于破碎藻類細(xì)胞提取藻類蛋白,在破碎小球藻提取油脂方面報道較少。本實驗采用高壓勻漿法破碎小球藻的細(xì)胞壁,選取影響破碎效果的關(guān)鍵因素,通過進(jìn)行單因素實驗和正交實驗,優(yōu)化高壓勻質(zhì)法破碎小球藻細(xì)胞的工藝條件,提高破碎效率,為微藻油脂的破碎提取提供實驗參考,為生物油脂的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

異養(yǎng)小球藻(Heterotrophicchlorella) 清華大學(xué)生命科學(xué)院提供;無水乙醇、正己烷等試劑 均為分析純。

50 L發(fā)酵罐 上海國強生化工程裝備有限公司;101A-3型電熱鼓風(fēng)烘箱 上海森信實驗儀器有限公司;DK-S28型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;ME3002E型電子天平 梅特勒托利多儀器(上海)有限公司;R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司;TG16型臺式高速離心機 長沙英泰儀器有限公司;BCD-215KCM型冰箱 青島海爾股份有限公司;panda plus 2000H型高壓勻質(zhì)機 意大利尼魯。

1.2 實驗方法

1.2.1 小球藻藻液的培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖30,酵母粉3,KH2PO40.075,MgSO40.075,CaCl20.025,K2HPO40.175,蛋白胨3,(NH4)2SO41,Fe2(SO4)33,ZnSO40.072,MnCl20.581,鉬酸鈉 0.044[6-7]。

發(fā)酵實驗采用50 L發(fā)酵罐,接種量10%,發(fā)酵溫度28 ℃,pH6.5,通風(fēng)量2 m3/(L·h),發(fā)酵過程中每隔12 h取樣一次,監(jiān)測發(fā)酵液的小球藻細(xì)胞數(shù)、pH、干物質(zhì)濃度、葡萄糖含量的變化。攪拌轉(zhuǎn)速為間歇調(diào)節(jié)(干重<20 g/L,轉(zhuǎn)速為200 r/min;20 g/L<干重<50 g/L,轉(zhuǎn)速為300 r/min;50 g/L<干重<70 g/L,轉(zhuǎn)速為400 r/min;干重>70 g/L,轉(zhuǎn)速為450 r/min),采用間歇補料,葡萄糖含量低于10 g/L時補料。發(fā)酵進(jìn)行15 d,發(fā)酵結(jié)束后,測得干物質(zhì)濃度為132 g/L,下罐后密封放入4 ℃的冰箱中備用[8]。

1.2.2 不同濃度藻液的配制 下罐后,小球藻藻液的干物質(zhì)濃度為132 g/L。使用離心機,在7000 r/min的條件下,離心15 min,發(fā)酵液分層后,倒出部分上清液,用此方法將藻液濃縮[9]。濃縮后的藻液的干物質(zhì)濃度為327 g/L,取一定量濃縮后的藻液,通過計算后,按一定的比例加水稀釋,即可得到不同濃度的藻液。

1.2.3 小球藻細(xì)胞破碎 使用高壓勻質(zhì)機對小球藻細(xì)胞進(jìn)行破碎,最大工作壓力2000 bar,連續(xù)進(jìn)樣,正常工作處理量9～20 L/h,最小處理量15 mL。破碎時調(diào)節(jié)壓力控制手輪至實驗所需的壓力后,從進(jìn)樣管將配制的不同濃度的藻液吸入進(jìn)行勻質(zhì)破碎,破碎后從出樣口流出[10]。藻液經(jīng)勻質(zhì)破碎流出后,根據(jù)破碎效果,進(jìn)料以及勻漿破碎過程可不間斷循環(huán)進(jìn)行。

1.2.4 油脂得率的測定 在破碎后的藻液中加入100 mL正己烷和30 mL無水乙醇,振蕩搖勻,油脂溶解在正己烷和乙醇中。隨后在7000 r/min下離心10 min,棄去殘渣,將上清液轉(zhuǎn)入分液漏斗中,同樣的方法重復(fù)三次,將得到的上清液合并至分液漏斗中。此時,細(xì)胞破碎后釋放出的油脂就全部溶解在分液漏斗內(nèi)的正己烷中[11-13]。

在分液漏斗中,水在下層,正己烷在上層,將水層放出,留下正己烷層。然后轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中將正己烷蒸干,留下的即為提取出的小球藻油脂,稱重后得到油脂的質(zhì)量。使用下面的公式計算油脂得率:

其中:y代表油脂得率,%;m0為破碎的藻液的干物質(zhì)質(zhì)量,g;m1為通過實驗提取出的油脂質(zhì)量,g。

當(dāng)實驗結(jié)果得到的得率較小時,說明小球藻細(xì)胞未能完全破碎,該條件下破壁能力較弱;當(dāng)實驗結(jié)果達(dá)到穩(wěn)定的最大值時,說明小球藻細(xì)胞被完全破碎,所用方法破壁能力最強[14-15]。

1.2.5 單因素實驗設(shè)計 選取細(xì)胞破碎過程中的三個關(guān)鍵因素進(jìn)行單因素實驗,這三個因素分別為:藻液濃度、勻質(zhì)壓力和勻質(zhì)時間。通過設(shè)置梯度實驗,研究這三個因素單獨變化時對油脂得率的影響。

1.2.5.1 藻液濃度對油脂得率的影響 取濃度分別為50、100、150、200、250 g/L的藻液1 L進(jìn)行實驗,設(shè)置高壓勻質(zhì)機的壓力為1000 bar,1 L小球藻藻液勻質(zhì)破碎一次需4 min,每個濃度的藻液在破碎時都不間斷循環(huán)破碎8 min,考察不同的藻液濃度對細(xì)胞破碎后油脂得率的影響。

1.2.5.2 勻質(zhì)壓力對油脂得率的影響 選擇濃度為100 g/L的藻液1 L進(jìn)行實驗,高壓勻質(zhì)機的壓力分別設(shè)置為700、800、900、1000、1100 bar,循環(huán)破碎8 min,考察不同的勻質(zhì)壓力對細(xì)胞破碎后油脂得率的影響。

1.2.5.3 勻質(zhì)時間對油脂得率的影響 選擇濃度為100 g/L的藻液1 L進(jìn)行實驗,高壓勻質(zhì)機的壓力設(shè)置為900 bar,勻質(zhì)時間分別為4、8、12、16、20 min,考察不同的勻質(zhì)時間對細(xì)胞破碎后油脂得率的影響。

1.2.6 響應(yīng)面實驗設(shè)計 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,結(jié)合實際條件,應(yīng)用Design Expert V8.0.6.1軟件,根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計方案,以藻液濃度(X1)、勻質(zhì)壓力(X2)、勻質(zhì)時間(X3)為影響因素,油脂得率(Y)為響應(yīng)值,進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面實驗,并對實驗結(jié)果進(jìn)行回歸和優(yōu)化,因素水平及編碼如表1所示。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平及編碼

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Design Expert V8.0.6.1軟件進(jìn)行實驗設(shè)計,得到實驗結(jié)果后,將實驗數(shù)據(jù)輸入軟件,根據(jù)軟件功能進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,輸出分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 不同藻液濃度對破碎效果的影響 破碎結(jié)束后,提取分離出油脂,計算油脂得率。實驗結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同藻液濃度對油脂得率的影響Fig.1 Effect of raw material concentration on the extraction yield of oil

由圖1可知,藻液濃度越低,破碎后的油脂得率就越高。這是因為,濃度越低,黏度越小,在進(jìn)行勻質(zhì)破碎時,藻液通過勻質(zhì)閥后更易分散,剪切力和撞擊力作用效果更好。但是在50～250 g/L的范圍內(nèi),藻液濃度的不同,對油脂得率的影響不大,破碎后油脂得率都能達(dá)到48%以上。藻液濃度大于250 g/L時,藻液過于黏稠,不利于實驗操作。因此為提高破碎效率,選擇150 g/L作為最適宜的藻液濃度。

2.1.2 不同勻質(zhì)壓力對破碎效果的影響 破碎結(jié)束后,提取分離出油脂,計算油脂得率,實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同勻質(zhì)壓力對油脂得率的影響Fig.2 Effect of homogenization pressure on the extraction yield of oil

由圖2可知,當(dāng)勻質(zhì)壓力在900 bar以下時,油脂得率隨著勻質(zhì)壓力的增大而逐漸升高。這是因為勻質(zhì)壓力越高,藻液通過勻質(zhì)閥前后的壓力差也就越高,受到的剪切力和撞擊力也就越大,破碎效果就越好。勻質(zhì)壓力超過900 bar后,壓力的進(jìn)一步提高對破碎的影響不明顯,油脂得率的增大幅度明顯放緩,基本維持不變。所以選擇900 bar作為最適宜的勻質(zhì)壓力。

2.1.3 不同勻質(zhì)時間對破碎效果的影響 破碎結(jié)束后,提取分離出油脂,計算油脂得率,實驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同勻質(zhì)時間對油脂得率的影響Fig.3 Effect of homogenization time on the extraction yield of oil

由圖3可知,當(dāng)勻質(zhì)時間不超過12 min時,油脂得率隨勻質(zhì)時間的增長而升高,這是因為勻質(zhì)時間越長,藻細(xì)胞通過勻質(zhì)閥的次數(shù)越多,破碎效果越好。超過12 min后,已經(jīng)將小球藻細(xì)胞完全破碎,油脂得率基本穩(wěn)定,升高幅度很小。因此,為提高效率,不再進(jìn)一步增加勻質(zhì)時間,選擇12 min作為最適宜的勻質(zhì)時間。

2.2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)表1設(shè)置的三因素三水平實驗,利用Design-Expert V8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面中心旋轉(zhuǎn)組合實驗設(shè)計,分別進(jìn)行17組實驗,每個實驗做3個重復(fù)。響應(yīng)面實驗順序與實驗結(jié)果以及方差分析如表2、表3所示。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

注:**表示差異極顯著(p<0.01);*表示差異顯著(p<0.05)。

通過Design-Expert V8.0.6.1軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到油脂得率Y對藻液濃度X1、勻質(zhì)壓力X2、勻質(zhì)時間X3的二次多項回歸模型為:Y=49.80-0.20X1+2.16X2+3.13X3-0.14X1X2-0.067X1X3-1.16X2X3-0.84X12-1.55X22-1.54X32

由表3可以看出,該模型回歸極顯著(p<0.01),失擬項p=0.0813>0.05,差異不顯著,并且該模型決定系數(shù)R2為99.30%,調(diào)整后決定系數(shù)RAdj為98.40%,變異系數(shù)為0.80%,說明該模型擬合精確、可信,可用于分析和預(yù)測高壓勻質(zhì)法破碎小球藻的情況。X2、X3、X2X3、X12、X22、X32對油脂得率的影響極顯著(p<0.01),X1、X1X2、X1X3對油脂得率的影響不顯著(p>0.05),表明油脂得率(Y)與藻液濃度(X1)、勻質(zhì)壓力(X2)和勻質(zhì)時間(X3)之間為非線性關(guān)系。另外,從表3也可以看出,各因素對油脂得率的影響大小順序為:勻質(zhì)時間(X3)>勻質(zhì)壓力(X2)>藻液濃度(X1)。

2.3 最優(yōu)工藝條件確定及驗證

2.3.1 最優(yōu)工藝條件的確定 采用Design Expert V8.0.6.1統(tǒng)計軟件作出藻液濃度(X1)、勻質(zhì)壓力(X2)和勻質(zhì)時間(X3)兩兩之間的響應(yīng)曲面圖見圖4。

圖4 兩因素的交互作用對油脂得率的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots of variable parameters on the extraction yield of oil

通過對3個曲面的觀察可以預(yù)測和檢驗變量的響應(yīng)值以及確定變量之間的相互關(guān)系,響應(yīng)面越陡,反映出各因素之間的兩兩交互作用越顯著[16-17]。同樣,等高線的形狀也可反映出交互效應(yīng)的強弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則與之相反[18-19]。前兩個比較平緩,最后一個比較陡峭,說明勻質(zhì)壓力和勻質(zhì)時間對油脂得率的影響均較大,由等高線圖可知,兩者交互作用非常明顯,而藻液濃度與勻質(zhì)壓力、藻液濃度與勻質(zhì)時間之間的交互作用不顯著,這與表3的顯著性分析一致。

2.3.2 驗證實驗 在選取的因素范圍內(nèi),根據(jù)回歸模型通過Design Expert V8.0.6軟件分析得出,高壓勻質(zhì)機破碎小球藻的最佳條件為:藻液濃度141.27 g/L、勻質(zhì)壓力938.91 bar、勻質(zhì)時間13.64 min,在此條件下,油脂得率的理論值為51.59%。根據(jù)最佳條件,考慮實際操作性,調(diào)整工藝條件為:藻液濃度140 g/L、勻質(zhì)壓力940 bar、勻質(zhì)時間14 min。經(jīng)過三次重復(fù)實驗得到的油脂得率為51.25%±0.23%,這與預(yù)測值相差不大。即該模型與實際情況擬合較好,說明通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的回歸方程具有一定的實踐指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論與討論

通過單因素實驗,確定了藻液濃度、勻質(zhì)壓力和勻質(zhì)時間這三個因素對小球藻細(xì)胞壁破碎的影響規(guī)律。運用Design-Expert V8.0.6軟件,使用響應(yīng)面分析法對各因素的最佳水平范圍及其交互作用進(jìn)行研究,建立了高壓勻質(zhì)法提取小球藻油脂的二次多項式回歸模型,結(jié)合實際操作確定最優(yōu)提取工藝參數(shù)為:藻液濃度140 g/L、勻質(zhì)壓力940 bar、勻質(zhì)時間14 min。在此條件下小球藻的油脂得率為51.25%±0.23%。

在大規(guī)模生產(chǎn)中,藻細(xì)胞破碎方法的選擇不僅需要考慮細(xì)胞破碎后能提取出來的油脂得多少,還需要考慮成本和效率等問題[20-21]。高壓勻質(zhì)法與酸熱法、堿熱法相比,機械破碎法不使用強酸強堿,環(huán)境壓力小;與酶解法相比,所需時間短;與反復(fù)凍融法相比,操作簡便;與超聲波破碎法相比,油脂得率較高。綜合考慮,此方法可在未來微藻油脂的商業(yè)化運用時有一定的優(yōu)勢,并且可以為微藻油脂的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

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Optimization ofChlorellacell disruption process by high pressure homogenization

LU Long,BI Sheng-lei*,JIN Hong-bo,WU Juan,ZHANG Peng-fei

(National Key Laboratory of Vehicle Biofuel Technology,Henan Tianguan Group Co.,Ltd.,Nanyang 473000,China)

Chlorellafermentation liquid was used as the experiment substrate and oil yield was chosen as the index of disruptive effect in this research. Based on the results of single-factor experiments,response surface methodology were carried out in order to study the effects of liquid concentration,homogenization pressure and homogenization time on the oil yield of disruptedChlorellaliquid. Multivariate regression model was established and the disruptive conditions were optimized as follows:liquid concentration was 140 g/L,homogenization pressure was 940 bar,homogenization time of per literChlorellafermentation liquid was 14 min. Under these conditions,the max oil yield could reach 51.25%±0.23%.

Chlorella;high pressure homogenization;disruption;response surface methodology

2016-08-09

魯龍(1988-)，男，碩士，助理工程師，研究方向：生物質(zhì)能源開發(fā)，E-mail：lulong21@163.com。

*通訊作者:畢生雷(1981-)，男，碩士，工程師，研究方向：生物化工，E-mail：bishenglei@163.com。

TS201.3

B

1002-0306(2017)06-0304-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.049