基于乳酸菌發(fā)酵法的果坯保藏工藝

李 媛,黃 月,黃 葦

(華南農業(yè)大學,廣東廣州 510000)

基于乳酸菌發(fā)酵法的果坯保藏工藝

李 媛,黃 月,黃 葦*

(華南農業(yè)大學,廣東廣州 510000)

為研究基于乳酸菌發(fā)酵法的果坯保藏工藝,以三華李為對象,通過比較不同乳酸菌的食鹽耐受能力、對數(shù)生長期長短和產酸能力大小來篩選發(fā)酵菌株;通過定期測定發(fā)酵液pH、酸度、乳酸菌活菌數(shù)、霉菌酵母總數(shù)、果坯a值及硬度來比較不同菌株配比的發(fā)酵效果,并利用Box-Benhnken實驗設計方法和響應面分析優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)。結果表明:植物乳桿菌和干酪乳桿菌更適合三華李果坯發(fā)酵,當兩者以植物乳桿菌∶干酪乳桿菌=3∶1的比例混菌發(fā)酵,食鹽用量5.0%,接種量3.5%,葡萄糖用量3.3%,發(fā)酵后的果坯常溫保藏90 d,果坯a值為17.00,硬度為1.51 N,顏色和硬度指標的綜合值表現(xiàn)良好。

三華李,保藏,發(fā)酵

廣東是全國最大的李生產省份,栽培面積約100萬畝,產量約50萬噸,除鮮食外,大量用于蜜餞涼果加工。三華李屬于薔薇科,中國李屬中的一種,是廣東省特色優(yōu)質品種,李果肉呈紫紅色,肉厚核小,味甜微酸,是加工涼果的上好水果[1]。

三華李鮮果上市集中,常溫下鮮果長期保鮮困難,生產上通常采用一次性制作果坯,作為半成品貯藏,供涼果加工周年使用。目前果坯普遍采用硫藏方式進行,易造成產品中的二氧化硫殘留超標，這也是目前廣式涼果產品質量不合格的主要原因。亞硫酸鹽的過量使用還導致水果中的天然色素破壞嚴重,降低了水果的營養(yǎng)價值[2-3]。果坯低硫、無硫保藏成為保障涼果質量安全的關鍵技術之一。

乳酸菌(Lacticacidbacteria)發(fā)酵在蔬菜腌制保藏上廣泛應用,乳酸菌生長過程中產生的代謝產物,能抑制腐敗菌的生長,從而提高產品的保藏性,并賦予發(fā)酵產品特有的風味和營養(yǎng)保健價值[4-6]。乳酸鏈球菌(Lactococcuslactis)可以產生特有的天然抑菌性物質乳酸鏈球素(Nisin),具有廣譜抑菌性,應用于果蔬發(fā)酵可抑制果蔬自帶腐敗菌的生長[7]。干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)被認為是調節(jié)免疫系統(tǒng)最有效的菌株之一,具有多種生物活性功能[8],但在果蔬發(fā)酵方面的應用報道較少。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)有高度的耐鹽耐酸性,是目前果蔬發(fā)酵應用最常見的乳酸菌株[6,9]。本研究將這三種乳酸菌株在果坯發(fā)酵中的應用適性進行比較,并優(yōu)選出發(fā)酵工藝參數(shù),為乳酸菌發(fā)酵法應用于果坯安全保藏提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三華李 廣州市從化區(qū)龍豐園果子食品廠呂田水果生產示范基;植物乳桿菌 1.191、干酪乳桿菌GIM1.204、乳酸鏈球菌 GIM1.196 廣東省微生物菌種保藏中心;PA/PE包裝袋(用于袋裝三華李進行發(fā)酵) 臺州名科塑料有限公司;蔗糖、麥芽糖、紅糖 佛山市南海區(qū)平洲夏西東元食品廠;MRS培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

EZ-SX 500 N質構儀 日本島津公司;X-rite-SP60積分球式分光光度計 愛色麗色彩儀器商貿有限公司;TU-1800紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;雷磁pH-3C數(shù)顯pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)條件的確定

1.2.1.1 最佳生長溫度測定 MRS液體培養(yǎng)基中接入均為2%的植物乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸鏈球菌。分別在20、25、30、37、40 ℃條件下培養(yǎng)24 h,取樣測定菌液OD值,重復三次,取平均值。

1.2.1.2 發(fā)酵最佳碳源測定 以蔗糖、麥芽糖和紅糖替代MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖,接種4%不同乳酸菌37 ℃培養(yǎng)24 h,測定菌液的OD值,重復三次,取平均值。

1.2.1.3 食鹽耐受性測定 在MRS培養(yǎng)基中加入0.0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%的食鹽,接種4%不同乳酸菌培養(yǎng)37 ℃ 24 h,測定菌液的OD值,重復三次,取平均值。

1.2.2 乳酸菌菌種篩選 將供試乳酸菌分別按接種量4%接入MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng),通過定期測定菌株的增殖速率和產酸能力來篩選發(fā)酵菌株。

1.2.3 菌種配比對果坯貯藏品質的影響 參照沈國華、嚴成、鄧國麗等人[10-12]的實驗方法選擇3%葡萄糖添加量及4%接種量,通過乳酸菌食鹽耐受性實驗選擇5%食鹽添加量。以果∶水=1∶1.8(質量比),按果重加入5%食鹽、3%葡萄糖,植物乳桿菌與干酪乳桿菌分別以配比為1∶0、3∶1、1∶1、1∶3、0∶1混合,按照果重4%的量接種,封袋后37 ℃貯藏發(fā)酵,每個處理兩個平行。定期抽樣測定發(fā)酵液的pH、酸度、果坯的色差值a和硬度,以及乳酸菌菌落總數(shù)、霉菌酵母菌菌落總數(shù)。

1.2.4 響應面優(yōu)化實驗 選取糖(X1)、食鹽(X2)和接種量(X3)作為自變量;選擇紅度值a(Y1)和硬度(Y2)為響應值設計了共17個實驗點的響應面實驗。在前述實驗及參考其他文獻的基礎上,選擇3%葡萄糖、5%食鹽、4%接種量作為中心實驗點,根據Box-Benhnken中心組合實驗設計原理,對糖(X1)、食鹽(X2)、接種量(X3)的用量水平編碼如表1所示。

表1 因素水平編碼表

1.2.5 指標測定方法

1.2.5.1 可滴定酸度 食品安全國家標準《GB/T 12456-2008 食品中總酸的測定》,取發(fā)酵液10 mL,去CO2蒸餾水稀釋至50 mL,用0.1N的NaOH滴定,酚酞作為指示劑,結果以乳酸計。

1.2.5.2a值 采用X-rite-SP60積分球式分光光度計,Hunter Lab表色法。a值為正時,數(shù)值越大,表明三華李色澤越紅。

1.2.5.3 硬度 采用島津質構儀,探頭直徑3 mm,刺穿深度8 mm,速度為1 mm/s。

1.2.5.4 乳酸菌、霉菌酵母總數(shù)計數(shù) 食品安全國家標準《食品微生物學檢驗標準匯編 GB4789-2010》。

1.2.5.5 OD值 采用TU-1800紫外可見分光光度計,波長600 nm。

1.3 統(tǒng)計與分析

采用SPSS 19.0 軟件進行差異性顯著分析,Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件對響應面的實驗數(shù)據進行方差分析及顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)條件的優(yōu)選

2.1.1 不同溫度對乳酸菌生長的影響 如圖1所示,三株菌在20～40 ℃范圍內均表現(xiàn)出相同的變化趨勢,隨著溫度的升高菌液濃度增大,達峰值后又減少。植物乳桿菌對溫度更加敏感,隨溫度上升增殖更快,峰值更高。三株乳酸菌的最適生長溫度均為:37 ℃。這也與尚天翠[13]的研究結果相符合。

圖1 不同溫度發(fā)酵后三種乳酸菌液的吸光度值Fig.1 Absorbance value in three kinds of lactic acid bacteria fermented liquid under condition of different temperature

2.1.2 不同碳源底物對乳酸菌生長的影響 如圖2所示,三株乳酸菌增殖速率趨勢一致:葡萄糖>蔗糖>紅糖>麥芽糖,皆表現(xiàn)出當?shù)孜餅槠咸烟菚r生長繁殖更快。蔗糖和麥芽糖為二糖,紅糖的主要成分為蔗糖,因乳酸菌能直接利用單糖,葡萄糖更利于三株乳酸菌的生長[14]。

圖2 不同碳源發(fā)酵后三種乳酸菌液的吸光度值Fig.2 Absorbance value in three kinds of lactic acid bacteria fermented liquid under condition of different carbon source

2.1.3 不同食鹽濃度對乳酸菌生長的影響 食鹽使溶液帶有滲透壓,使微生物細胞脫水,發(fā)生質壁分離,抑制微生物的生理代謝活動,適量添加食鹽有助于抑制發(fā)酵過程中腐敗菌的生長。通過圖3可以看出植物乳桿菌在2.5%食鹽濃度下還能呈現(xiàn)增長趨勢；在0%食鹽濃度與2.5%食鹽濃度下,干酪乳桿菌的菌液吸光度值沒有差異,2.5%低濃度的食鹽對干酪乳桿菌的生長基本不產生不利影響。食鹽濃度升高,菌液OD值降低,菌體生長受到抑制,乳酸鏈球菌對食鹽的耐受性較差,濃度達到5%時其OD值就接近于0;當濃度為10%時,三株菌的OD值均接近于0;菌體生長受到嚴重抑制。三種菌株對食鹽的耐受性表現(xiàn)為:植物乳桿菌>干酪乳桿菌>乳酸鏈球菌。

圖3 不同食鹽濃度發(fā)酵后三種乳酸菌液的吸光度值Fig.3 Absorbance value in three kinds of lactic acid bacteria fermented liquid under condition of different salt concentration注:字母不同,表示具有顯著性差異(p<0.05)。

2.2 乳酸菌菌種篩選

2.2.1 不同菌株生長曲線的測定 生長曲線分為延緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。由圖4可以看出,植物乳桿菌的對數(shù)生長期中期為10 h,增值速率高于干酪乳桿菌和乳酸鏈球菌,干酪乳桿菌的對數(shù)生長期中期為18 h,而乳酸鏈球菌在22 h才到達對數(shù)生長期中期,且延緩期比較長。菌株增殖速率:植物乳桿菌>干酪乳桿菌>乳酸鏈球菌。

圖4 不同乳酸菌的生長曲線圖Fig.4 The growth curve of different lactic acid bacteria

2.2.2 不同菌株產酸能力的比較 由圖5及圖6可知,菌株的產酸能力:植物乳桿菌>干酪乳桿菌>乳酸鏈球菌。

圖5 不同乳酸菌發(fā)酵液pH隨時間的變化Fig.5 Changes of pH of lactic acid bacteria fermentation liquid with time

圖6 不同乳酸菌發(fā)酵液酸度隨時間的變化Fig.6 Changes of acidity of lactic acid bacteria fermentation liquid with time

綜合比較,植物乳桿菌和干酪乳桿菌在更短時間內,迅速達到對數(shù)生長期,增殖速率快,迅速產酸,pH降低,有利于抑制雜菌生長,并且對高濃度食鹽的耐受性較高,適合應用于三華李的發(fā)酵保藏。

2.3 菌種配比對果坯貯藏品質的影響

單一菌落發(fā)酵的純培養(yǎng)技術工藝簡單,多種微生物共同培養(yǎng)的混菌發(fā)酵對于發(fā)酵產品品質更為有利[15-16]。

本實驗研究比較植物乳桿菌、干酪乳桿菌單一菌株發(fā)酵和兩菌株混菌發(fā)酵對三華李果坯品質的影響。

由圖7及圖8可知,當植物乳桿菌和干酪乳桿菌二者比例為3∶1時,發(fā)酵液酸度最高。單一干酪乳桿菌發(fā)酵時,發(fā)酵液酸度最低。

圖7 菌種配比對發(fā)酵液pH的影響Fig.7 Effect of strain ratio on fermentation liquid pH

圖8 菌種配比對發(fā)酵液酸度的影響Fig.8 Effect of strain ratio on fermentation liquid acidity

由圖9可知采用植物乳桿菌和干酪乳桿菌混菌發(fā)酵,當二者比例為3∶1時,果坯的a值在各配比中最高。對比圖8可知,發(fā)酵液酸度高,a值的下降受到抑制,有利于護色,這是因為發(fā)酵產生的乳酸、乙酸等可以延緩酶促褐變的發(fā)生,且能維持花色苷的穩(wěn)定所致[17-18]。

圖9 菌種配比對果坯a值的影響Fig.9 Effect of strain ratio on a value of fruit billets

由圖8及圖10可知,酸度變化與果坯硬度變化呈現(xiàn)負相關關系,酸度越大,果坯硬度越小。這是由于產酸量越高,果膠和纖維素物質水解越快,果坯硬度下降也越快[19]。采用植物乳桿菌和干酪乳桿菌混菌發(fā)酵,當二者比例為3∶1時,果坯硬度最小,但尚在可接受范圍內。

圖10 菌種配比對果坯硬度的影響Fig.10 Effect of strain ratio on hardness of fruit billets

由圖11可知，干酪乳桿菌比例越高,乳酸菌活菌總量降低越快,30 d后檢測不到乳酸菌菌群。干酪乳桿菌產酸能力和耐酸能力低于植物乳桿菌,酸度越大,干酪乳桿菌活菌數(shù)越少,乳酸菌活菌總數(shù)下降越快,致使酵母菌受到的競爭性抑制作用越小,增長越快。如圖12顯示，干酪乳桿菌比例越大,發(fā)酵液中酵母菌活菌數(shù)越多,單一干酪乳桿菌發(fā)酵至30 d時,酵母菌達到1.0×106CFU/mL,容易導致果坯長膜生花,影響果坯品質。

圖11 菌種配比對發(fā)酵液中乳酸菌數(shù)量的影響Fig.11 Effect of lactic acid bacteria number change of fermentation liquid

圖12 菌種配比對發(fā)酵液中霉菌酵母菌數(shù)量的影響Fig.12 Effect of fungal yeast number change of fermentation liquid

綜合各指標考慮,選擇植物乳桿菌和干酪乳桿菌二者比例為3∶1進行混菌接種。

2.4 響應面優(yōu)化混菌發(fā)酵條件

利用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件對響應面的實驗數(shù)據(表2)進行a值的方差分析及顯著性檢驗,具體分析結果見表3。

表3 對果坯a值回歸方程各項回歸分析

注:*表示在0.05水平顯著,**表示在0.01水平顯著;表6同。

表2 響應面法優(yōu)化實驗結果

該模型的不同處理間差異極顯著(p<0.0001),失擬項不顯著(p=0.1822),說明模型顯著,擬合有效,方程能夠反映響應值的變化。食鹽對a值的影響最大,達到極顯著水平,其次是葡萄糖、接種量,均達到顯著水平。在α=0.05顯著水平剔除不顯著項,建立各影響因素X和Y1a值之間的二次多項回歸方程為:Y1=12.06+1.41X1-0.31X2+1.74X3-0.19X1X2-0.2X32。

響應曲面圖可以形象的描述各因素之間的交互作用,當相應曲面坡度比較平滑,說明響應值受因素的影響較小,反之坡度越陡則影響越大,如圖13所示,食鹽添加量與葡萄糖添加量之間存在明顯的交互作用,這與回歸分析結果一致。

圖13 食鹽添加量和葡萄糖添加量對果坯a值的交互影響Fig.13 Interaction of salt content and glucose content on a value

利用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件對響應面的實驗數(shù)據(表2)進行硬度的方差分析及顯著性檢驗,具體分析結果見表4。

該模型的不同處理間差異顯著(p=0.0241),失擬項不顯著(p=0.6224),說明模型顯著,擬合有效,方程能夠反映響應值的變化。食鹽、接種量對硬度有極顯著的影響,葡萄糖對硬度影響不顯著?；貧w分析結果顯示各個因素之間對果坯硬度的影響不存在交互作用。在α=0.05顯著水平剔除不顯著項,建立各影響因素X和硬度Y2之間的二次多項回歸方程為:Y2=1.50+0.038X2-0.041X3

根據統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據,以色差值a值和硬度大為優(yōu),確定各因子的優(yōu)化參數(shù)。分析該優(yōu)化條件下的最佳工藝條件為食鹽用量為5.0%,接種量為3.5%,葡萄糖用量為3.3%,發(fā)酵果坯的 a值為16.60,硬度1.57 N。在最優(yōu)條件下進行實驗驗證,發(fā)酵后,常溫保藏90 d,得到的a值為17.00,硬度1.51 N,說明該模型能較好的預測發(fā)酵效果。

3 結論

三株菌均表現(xiàn)出在37 ℃條件下,以葡萄糖為碳源底物有最佳的生長趨勢。在發(fā)酵過程中,一定的食鹽濃度可以抑制雜菌生長而不會對乳酸菌的生長產生太大的不利影響,發(fā)酵體系的酸度迅速下降有利于抑制初始雜菌數(shù)。相比于乳酸鏈球菌,植物乳桿菌和干酪乳桿菌的食鹽耐受性更高,菌株增殖速率更快,菌株的產酸能力更強。植物乳桿菌和干酪乳桿菌更適用于李果坯的發(fā)酵保藏。

表4 對果坯硬度回歸方程各項回歸分析

當兩種菌株混合發(fā)酵時,隨著植物乳桿菌的比例增大,發(fā)酵液的pH越小,酸度越大,乳酸菌活菌數(shù)越大,腐敗菌數(shù)量越小,果坯a值也基本隨植物乳桿菌的比例增大而增大,硬度則反之。這可能與植物乳桿菌的產酸能力有關,酸性條件有利于果坯花色苷的維持,且能抑制腐敗菌的生長,但果膠和纖維素物質在酸性條件下會加快水解,導致果坯硬度下降。當植物乳桿菌和干酪乳桿菌以3∶1的比例進行混菌發(fā)酵,與單一菌種及其他比例混菌發(fā)酵相比較,發(fā)酵后果坯色澤最佳,發(fā)酵體系產酸相對較量高,能維持一定數(shù)量的乳酸菌活菌數(shù),發(fā)酵液中腐敗菌在安全范圍內,雖然該實驗組果坯硬度最低,但仍能保持整果形狀,尚可接受。植物乳桿菌和干酪乳桿菌在混合發(fā)酵過程中對果坯品質影響的機理還有待進一步的研究。

通過響應面實驗結果分析可知,影響發(fā)酵后果坯a值的主次因素:食鹽濃度>葡萄糖添加量>菌液接種量;影響發(fā)酵后果坯硬度的主次因素:食鹽濃度>菌液接種量,葡萄糖添加量對果坯硬度沒有顯著影響。優(yōu)化后的混菌發(fā)酵條件為:食鹽5.0%,接種量為3.5%,葡萄糖3.3%。發(fā)酵后常溫保藏果坯90 d,a值為17.00,硬度為1.51 N,果坯顏色深紅,果實完好,硬度符合要求。

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Fruit billets stock preservation process based on lactic acid bacteria fermentation

LI Yuan,HUANG Yue,HUANG Wei*

(South China Agricultural University,Guangzhou 510000,China)

Fruit billets preservation process on lactobacillus fermentation were studied on strains selecting by comparing the length of logarithmic growth phase and the size of acid producing capacity of different lactic acid bacteria,and strain ratio by comparing fermentation effect on determination of pH value,acidity,avalue,hardness,number of lactic acid bacterial,mold and yeast and optimization of fermentation process parameters by using Box-Benhnken experiment design and response surface analysis. Result indicated that lactobacillus plantarum and lactobacillus casei were suitable for the fermentation. When the two party to lactobacillus plantarum of lactobacillus casei=3∶1,5.0% salt,3.5% inoculum size,3.3% glucose,the color and hardness of the fruit billets performed well withavalue of 17.00,the hardness of 1.51 N after preservation at room temperature of 90 d while finish fermentation.

sanhua plum;preservation;fermentation

2016-09-22

李媛(1991-)，女，在讀研究生，研究方向：果蔬加工與保藏，E-mail:ending.club@163.com。

*通訊作者:黃葦(1967-)，女，教授，研究方向：食品加工、包裝與保藏，E-mail:weih007@scau.edu.com。

廣東省農業(yè)廳項目(2016LM2151)。

TS255.3

A

1002-0306(2017)06-0201-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.030