果蔬中殘留有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的選育及鑒定

梁金鐘,梅劍秋,王翼雪

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076)

果蔬中殘留有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的選育及鑒定

梁金鐘,梅劍秋,王翼雪

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076)

為減少果蔬中的農(nóng)藥殘留量,利用96孔板從長(zhǎng)期噴灑農(nóng)藥的耕地土壤中篩選出一株能高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的菌株,并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定,提取其基因組并與GenBank上已提交的26S rDNA進(jìn)行BLAST比對(duì),結(jié)果表明,其歸屬于紅酵母菌屬(Rhodotorulasp.)。由MEGA6.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明,該菌株與Rhodotorulamucilaginosa26S rDNA序列一致性可達(dá)99%,結(jié)果與生理生化實(shí)驗(yàn)相一致。因此,確定該菌株為膠紅酵母菌(Rhodotorulamucilaginosa),編號(hào)為RM-DY21。利用紫外分光光度法測(cè)定該菌株32 h內(nèi)對(duì)毒死蜱(50 mg/L)降解率為70.04%。該菌株在以有機(jī)磷農(nóng)藥(毒死蜱、氧樂(lè)果和敵百蟲(chóng))為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)效果好,說(shuō)明其對(duì)這三種農(nóng)藥均有降解效果,可以廣泛降解有機(jī)磷農(nóng)藥。

有機(jī)磷農(nóng)藥,土壤,降解菌,26S rDNA

隨著農(nóng)業(yè)的發(fā)展,農(nóng)作物對(duì)農(nóng)藥的依賴性不斷增強(qiáng),導(dǎo)致果蔬中農(nóng)藥殘留超標(biāo)中毒事件時(shí)有發(fā)生,怎樣降低農(nóng)藥殘留量引起的危害,己受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。如今果蔬產(chǎn)品的質(zhì)量與安全問(wèn)題日益受到消費(fèi)者的重視與關(guān)注,安全無(wú)農(nóng)藥殘留的果蔬受到追捧。但有機(jī)磷農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的使用仍占主導(dǎo)地位,在短期內(nèi)難以改變[1]。僅依靠有機(jī)磷農(nóng)藥自然降解已無(wú)法滿足人們對(duì)食品安全的要求。殘留農(nóng)藥的降解是降低農(nóng)藥毒副作用的一個(gè)重要研究領(lǐng)域[2]。

有機(jī)磷農(nóng)藥降解方法有物理方法、化學(xué)方法和生物方法。物理方法包括吸附法、超聲波法和洗滌法,化學(xué)方法包括氧化法、還原法和水解法,這兩種方法成本高、可能產(chǎn)生新的污染物[3],且處理過(guò)程中反應(yīng)需要苛刻的條件[4]。微生物對(duì)有機(jī)磷的降解包含多種酶促反應(yīng),具有無(wú)毒、無(wú)二次污染,反應(yīng)速度快、條件溫和等優(yōu)點(diǎn),是近年來(lái)應(yīng)用范圍最為廣泛的一種方法,也是目前較為成熟的一種應(yīng)用方法[5]。因此,篩選高效、廣譜的有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌株具有重要意義[6]。

有機(jī)磷農(nóng)藥通常是指磷酸酯或硫代磷酸酯等這類磷化物[7]。已報(bào)道的大部分微生物僅專一性降解含P=O鍵或P=S鍵類的有機(jī)磷農(nóng)藥,降解范圍具有局限性,而且降解率較低[8-12],因此本課題旨篩選出高效廣譜降解有機(jī)磷農(nóng)藥菌種以解決果蔬中殘留有機(jī)磷農(nóng)藥的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土樣 于2015年9月采自鶴崗市某長(zhǎng)期噴灑農(nóng)藥的大豆耕地土壤;毒死蜱乳油(50 g/100 mL) 浙江新農(nóng)化工股份有限公司;氧樂(lè)果乳油(40 g/100 mL) 鄭州蘭博爾科技有限公司;敵百蟲(chóng)原藥(90 g/100 mL) 山東大成農(nóng)藥股份有限公司;Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒 生工生物工程(上海)股份有限公司。

5100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;723N可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DZP-102恒溫振蕩器 中國(guó)·哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;H1650-W臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;Motic BA200顯微鏡 上海儀園光學(xué)儀器廠;S-3400掃描電鏡 天美日立公司;JY5000電泳儀 北京市君意機(jī)電技術(shù)公司;T100-PCR擴(kuò)增儀 杭州博日科技有限公司;SIM凝膠成像系統(tǒng) 百維信生物科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基的配制

1.2.1 完全培養(yǎng)基的配制 KNO33.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO4.7H2O 0.5 g/L、蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L,自然pH[13]。

1.2.2 選擇培養(yǎng)基的配制 MgSO4·7H2O 0.500 g/L、K2HPO41.310 g/L、FeSO4·7H2O 0.018 g/L、NaNO33.000 g/L、KCl 0.500 g/L[14]。其中加入一定量的有機(jī)磷農(nóng)藥作為唯一碳源。

1.2.3 YPD培養(yǎng)基的配制 葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨20.0 g/L、酵母浸粉10.0 g/L,自然pH。

1.3 菌株的分離篩選

從長(zhǎng)期噴灑農(nóng)藥的耕地取1 g土壤溶于10 mL生理鹽水中,搖勻后取上清液分別用生理鹽水梯度稀釋,并選取濃度為10-2、10-4、10-6稀釋液分別涂布于加有50 mg/L毒死蜱的選擇培養(yǎng)基平板中,35 ℃倒置培養(yǎng)48 h。將平板上所生長(zhǎng)的菌落分別挑至加有100 mg/L毒死蜱的選擇培養(yǎng)基的96孔深孔板中,35 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后,分別取0.1 mL菌液涂布于完全培養(yǎng)基平板中,35 ℃倒置培養(yǎng)24 h,再?gòu)闹刑羧我痪溆诤?00 mg/L毒死蜱的選擇培養(yǎng)基的試管中,依次梯度增加毒死蜱濃度至10000 mg/L,從而篩選出具有高耐藥性的菌株。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用石油醚配制濃度為20、40、60、80、100、120、140、160、180和200 mg/L的毒死蜱,在293 nm波長(zhǎng)下測(cè)定,以石油醚為參比;然后根據(jù)濃度和吸光值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。以毒死蜱濃度為橫坐標(biāo)(x)、以毒死蜱在293 nm處吸光值為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程為y=0.00218x+0.0065,相關(guān)系數(shù)為R2=0.99911,回歸性較好。

1.5 高效降解菌株的確定

將篩選出的幾株高耐藥性菌株分別接種于20、40、60、80、100、120、140、160、180和200 mg/L的不同濃度毒死蜱的液體選擇培養(yǎng)基中,以不接種菌株作為空白對(duì)照組,重復(fù)3次。35 ℃,150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48 h,分別取5 mL發(fā)酵液用等體積石油醚萃取,采用紫外分光光度法在最大吸收峰λ=293處測(cè)定吸光值,然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出所對(duì)應(yīng)的濃度[15],計(jì)算降解率。選取50 mg/L毒死蜱為目標(biāo)濃度,將幾株高耐藥性菌株接種于其中,分別測(cè)定其降解率,以確定高效降解菌。

式中:X為毒死蜱在液體培養(yǎng)基中的降解率(%);Cck為對(duì)照樣品中農(nóng)藥的含量(mg/L);Cx為處理樣品中藥劑的含量(mg/L)。

1.6 菌株的鑒定

1.6.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 觀察單個(gè)菌落的顏色、形狀、透明度、光滑、濕潤(rùn)和邊緣整齊等特征[16]。做簡(jiǎn)單染色在100倍油鏡下觀察[17]。

取一定的培養(yǎng)液,8000 r/min離心3～5 min,棄上清液,加入2.5%戊二醛固定2 h,pH7.2磷酸鹽緩沖液清洗,然后加入蒸餾水稀釋,充分混合后用滴管取混合液一滴于小塊蓋玻片上,吸附2 min,用濾紙吸去多余溶液。然后用雙面膠將此蓋玻片貼在棕色瓶瓶蓋內(nèi)壁,在棕色瓶?jī)?nèi)加入適量1%鋨酸,蓋上含有樣品的瓶蓋,熏蒸固定2 h以上。然后用雙面膠將蓋玻片粘在樣品臺(tái)上,噴金,進(jìn)行掃描電鏡觀察[18]。

1.6.2 菌株的生理生化鑒定 根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》和《微生物分類學(xué)》對(duì)菌種進(jìn)行生理生化鑒定[19-21]。

1.6.3 野生菌株基因組的提取 采用Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒提取菌株的26S rDNA。

1.6.4 菌株26S rDNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增 使用引物 NL1(GCATATC AATAAGCGGAGGAAAAG)和NL4(GGTCCGTGT TTCAAGACGG)通過(guò)PCR儀擴(kuò)增菌株的26S rDNA近5′端的D1/D2區(qū)域。

反應(yīng)體系:DNA模板1.2 μL引物NL1 1.2 μL,引物NL4 1.2 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2.4 μL,10×PCR緩沖液6 μL,Taq DNA聚合酶(Hifi)0.6 μL,ddH2O 47.4 μL,總反應(yīng)體積為60 μL,混勻后快速離心15 s。

PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃ 5 min,94 ℃ 1 min,52 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min 20 s;循環(huán)36次,72 ℃ 8 min;PCR產(chǎn)物4 ℃保存。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測(cè):取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠,于150 V電壓下電泳20 min,記錄凝膠成像結(jié)果[22]。

1.6.5 菌株26S rDNA序列比對(duì)分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 將菌株的26S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在NCBI(網(wǎng)址:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的GenBank庫(kù)中與已有序列經(jīng)Blast比對(duì)后分析,并利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[23]。

1.7 菌株降解有機(jī)磷農(nóng)藥的廣譜性測(cè)定

選取目前果蔬種植中常用的農(nóng)藥樂(lè)果、毒死蜱、敵百蟲(chóng)作為目標(biāo)農(nóng)藥,將菌株分別接種在以50 mg/L毒死蜱、氧樂(lè)果、敵百蟲(chóng)為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基中,于28 ℃搖床培養(yǎng)2 d后,涂布于完全培養(yǎng)基的平板上,28 ℃倒置培養(yǎng)2 d,觀察菌落生長(zhǎng)情況。若生長(zhǎng)良好則具有一定降解能力,若不生長(zhǎng)則不具有降解能力[24]。

1.8 菌株的生長(zhǎng)曲線及降解曲線

1.8.1 菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將菌株按2%接種量接種于YPD培養(yǎng)基中,28 ℃恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng),每2 h取樣并在600 nm 處測(cè)定培養(yǎng)基中菌的濁值,以時(shí)間為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.8.2 菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解曲線測(cè)定 配制毒死蜱含量為50 mg/L的YPD培養(yǎng)基,將預(yù)先制備好的OD400在1.0的菌懸液,按2%的接菌量接種。28 ℃,150 r/min下振蕩培養(yǎng),定時(shí)取樣,測(cè)定毒死蜱的殘留濃度,于紫外分光光度計(jì)中測(cè)其在最大吸收峰293 nm處的吸光度值,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出底物中毒死蜱殘留量,求出降解率。以培養(yǎng)液中毒死蜱的濃度為縱坐標(biāo),取樣時(shí)間為橫坐標(biāo),繪制毒死蜱的降解曲線。

1.9 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每組數(shù)值重復(fù)處理3次,利用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖,利用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的篩選

2.1.1 高耐受有機(jī)磷農(nóng)藥菌株的篩選 通過(guò)選擇培養(yǎng)基從土壤中獲得300多株耐藥菌株,經(jīng)梯度增加培養(yǎng)基中毒死蜱濃度至10000 mg/L,最終獲得編號(hào)為DY21、LY12、LY11、DS52和LY41的5株高耐菌株。

2.1.2 高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥菌株的篩選 如圖1(a)所示。比較5株不同菌株的降解率,可以看出在毒死蜱濃度為20 mg/L時(shí)菌株降解率均比較高,從毒死蜱濃度在20～40 mg/L時(shí)菌株降解率開(kāi)始急速下降。當(dāng)毒死蜱40～200 mg/L之間時(shí),菌株DY21的降解率基本保持平穩(wěn),波動(dòng)較小。菌株LY12在60 mg/L時(shí)降解率顯著增高,但從80 mg/L開(kāi)始降解率逐漸降低,在濃度為180～200 mg/L時(shí)顯著降低。菌株DS52降解率不穩(wěn)定,在160 mg/L開(kāi)始顯著下降。菌株LY11和LY41降解率比較穩(wěn)定,但其降解率明顯低于菌株DY21。

如圖1(b)所示,本實(shí)驗(yàn)選取毒死蜱濃度為50 mg/L進(jìn)行研究,降解32 h后5株菌株的降解率分別為70.04%、68.52%、54.55%、60.26%和64.18%,最終確定一株高效降解菌為菌株DY21。

圖1 不同菌株對(duì)毒死蜱降解率比較Fig. 1 Comparisons of degradation rate of chlorpyrifos among different strains

2.2 菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

2.2.1 菌株的菌落形態(tài) 由圖2可知,肉眼觀察YPD平板上DY21菌落呈橘紅色、色澤鮮艷、顏色均一、正反面顏色一致,表面光滑、濕潤(rùn),邊緣整齊,易挑起,呈圓形、不透明、無(wú)褶皺。

圖2 菌落形態(tài)圖Fig.2 Colonies of strain-DY21

2.2.2 菌株的細(xì)胞形態(tài) 利用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察菌株DY21,結(jié)果如圖3、圖4所示,菌株排列整齊,細(xì)胞呈橢圓形,以出芽方式繁殖,無(wú)子囊孢子,無(wú)擲孢子,大小在20.26 μm×13.02 μm左右。

2.2.3 菌株的生理生化鑒定 從表1可知,菌株DY21可以利用葡萄糖、棉子糖、D-木糖、木糖醇、海藻糖、核糖醇;不能利用D-半乳糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、松三糖、蜜二糖、乳糖、淀粉、硝酸鹽;可與L-山梨糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-核糖發(fā)生可變反應(yīng)。尿素水解實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性,說(shuō)明該菌株具有水解尿素的酶,可以產(chǎn)生大量的氨,使培養(yǎng)基呈堿性;醋酸產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)呈陰性,說(shuō)明該菌株不產(chǎn)酸;DDB實(shí)驗(yàn)呈陰性。

表1 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 光鏡1000×下的菌株DY21的形態(tài)Fig.3 The morphological characteristics of the strains under light microscope 1000×

圖4 掃描電鏡5000×下的菌株DY21的形態(tài)Fig.4 The morphology of strain DY21 under scanning electron microscope 5000×

注:“+”為陽(yáng)性反應(yīng);“-”為陰性反應(yīng);“V”為可變反應(yīng)。

2.2.4 26S rDNA序列比對(duì)分析及分子生物學(xué)鑒定

2.2.4.1 菌株DY21基因組的提取及其26S rDNA的擴(kuò)增 將菌株DY21提取的基因組為模板,采用通用引物擴(kuò)增26S rDNA。由圖5可知,菌株DY21的26S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)一條亮帶,其分子質(zhì)量為500 bp左右。

圖5 菌株DY21的26S rDNA擴(kuò)增譜帶Fig.5 Amplified rDNA 16S bands from strain DY21

2.2.4.2 26S rDNA序列比對(duì)分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 菌株DY21的26S rDNA序列與已公布序列一致性均達(dá)99%,隨機(jī)選取其中10株酵母菌用MEGA6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建,如圖6所示。

圖6 菌株RM-DY21系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of strain RM-DY21

由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖6)可知,野生菌株DY21與已報(bào)道的膠紅酵母菌(Rhodotorulamucilaginosa)親緣性一致,比對(duì)一致性均為99%,參照生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將DY21菌株定名為RhodotorulamucilaginosaDY21,簡(jiǎn)寫(xiě)為RM-DY21。

2.3 菌株RM-DY21降解有機(jī)磷農(nóng)藥的廣譜性測(cè)定

有機(jī)磷農(nóng)藥通過(guò)其磷脂鍵的破壞而脫毒,由于各有機(jī)磷農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)相似,只是取代基不同,所以通常一種菌種可以降解多種有機(jī)磷農(nóng)藥。所以本實(shí)驗(yàn)選取了3種有代表性的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行菌種降解實(shí)驗(yàn),通過(guò)觀察涂布后固體培養(yǎng)基中菌株的生長(zhǎng)狀況,菌株生長(zhǎng)越好說(shuō)明其對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解效果越好(圖7～圖9),其中毒死蜱中菌落較為密集,氧樂(lè)果次之,敵百蟲(chóng)中較少,說(shuō)明菌株對(duì)這三種農(nóng)藥均能降解,其中對(duì)毒死蜱降解效果最好,對(duì)氧樂(lè)果降解效果次之,對(duì)敵百蟲(chóng)降解效果一般。故說(shuō)明該菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解具有一定的廣譜性。菌株RM-DY21與劉斌斌等篩選出的魯氏酵母菌(Saccharomycesrouxii)相比，具有降解效果廣泛的優(yōu)點(diǎn)[25]。

圖7 毒死蜱中菌株RM-DY21生長(zhǎng)形態(tài)Fig.7 RM-DY21 strain growth morphology in chlorpyrifos

圖8 樂(lè)果中菌株RM-DY21生長(zhǎng)形態(tài)Fig.8 RM-DY21 strain growth morphology in dimethoate

圖9 敵百蟲(chóng)中菌株RM-DY21生長(zhǎng)形態(tài)Fig. 9 RM-DY21 strain growth morphology in dipterex

2.4 菌株RM-DY21的生長(zhǎng)曲線及其對(duì)毒死蜱的降解曲線

由圖10可知,在YPD培養(yǎng)基中菌株RM-DY21適應(yīng)期長(zhǎng),生長(zhǎng)緩慢,38 h后生長(zhǎng)趨勢(shì)相對(duì)穩(wěn)定。隨著菌株的生長(zhǎng)對(duì)毒死蜱的降解率也逐漸提高,在32 h后對(duì)毒死蜱的降解趨于穩(wěn)定。

圖10 菌株RM-DY21的生長(zhǎng)曲線及其對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解曲線Fig.10 Growth curve of strain RM-DY21 and its degradation curve of organic phosphorus pesticide

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從長(zhǎng)期噴灑農(nóng)藥的土壤中篩選出300多株菌株,經(jīng)96孔板初篩選出5株耐高濃度有機(jī)磷農(nóng)藥的菌株。采用紫外分光光度法測(cè)定5株菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解率,復(fù)篩選出一株降解率最高的菌株,編號(hào)為RM-DY21,該菌株作用32 h后對(duì)50 mg/L毒死蜱的降解率為70.04%。對(duì)RM-DY21進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定并與GenBank上已提交的26S rDNA進(jìn)行BLAST比對(duì),表明其歸屬于紅酵母菌(Rhodotorulasp.)屬。由MEGA6.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明,菌株與Rhodotorulamucilaginosa26S rDNA序列一致性達(dá)99%,與生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,確定該菌株為膠紅酵母菌(Rhodotorulamucilaginosa)。將菌株涂布于以有機(jī)磷農(nóng)藥為唯一碳源的固體培養(yǎng)基中,菌株生長(zhǎng)越好說(shuō)明其對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解效果越好,其中毒死蜱中菌落較為密集,氧樂(lè)果次之,敵百蟲(chóng)中較少,說(shuō)明菌株對(duì)毒死蜱降解效果最好,對(duì)氧樂(lè)果降解效果次之,對(duì)敵百蟲(chóng)降解效果一般,證明該菌株對(duì)降解有機(jī)磷農(nóng)藥具有一定的廣譜性。本實(shí)驗(yàn)篩選出的膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa),其降解率與已報(bào)道的假單胞菌(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)等[26]相比有一定的提高且降解效率高。膠紅酵母菌無(wú)毒無(wú)害,富含多種氨基酸和脂肪酸,營(yíng)養(yǎng)成分高,可作為降解有機(jī)磷農(nóng)藥菌劑的優(yōu)質(zhì)原料。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可通過(guò)誘變育種、發(fā)酵工藝條件優(yōu)化以及提取精制菌株降解酶等手段提高其對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解率,也可利用分子生物學(xué)技術(shù)提取有機(jī)磷降解酶基因,為構(gòu)建基因工程菌奠定基礎(chǔ),實(shí)現(xiàn)降解酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

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Screening and identification of the degradation bacteria of residues chlorpyrifos pesticide on fruits and vegetables

LIANG Jin-zhong,MEI Jian-qiu,WANG Yi-xue

(Key Laboratory of Food Science and Engineering,School of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China)

To reduce the residues of pesticide in fruits and vegetables,a strain efficiently degrading organophosphorus pesticides was obtained through 96-well plates-based screening from soil of cultivated land under long-term spraying of pesticide. Analysis of morphology,physiological and biochemical properties,and BLAST of 26S rDNA sequences in GenBank indicated that the strain belonged toRhodotorulagenus. The identity of 26S rDNA between this strain withRhodotorulamucilaginosawas 99% through the analysis of phylogenetic tree generated by MEGA6.0 software,consistent with the analysis of physiological and biochemical experiments. Therefore,the strain was determined asRhodotorulamucilaginosaand numbered RM-DY21. The degradation rate of RM-DY21 to chlorpyrifos was 70.04% in dosage of 50 mg/L in 32 h using the UV spectrophotometric method. RM-DY21 grew better in the medium of organophosphorus pesticide which was the single carbon source,showing its better degradation for organophosphorus pesticide. Because of its obvious degradation of chlorpyrifos,omethoate and dipterex,RM-DY21could be a wide degradation of organophosphorus pesticides.

organophosphorus pesticides;soil;degradation bacteria;26S rDNA

2016-10-11

梁金鐘(1957-)，男，本科，教授，研究方向：微生物學(xué)與發(fā)酵工程，E-mail:Ljz2050@126.com。

TS201.3

A

1002-0306(2017)06-0189-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.028