蛋白核小球藻不同生長階段油脂和脂肪酸組成的分析

楊慧敏,秦焰禎,楊青峰,朱宏波,胡雪瓊,鐘 敏,李雁群,3,*

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088;2.廣東海洋大學海洋藥物研究所,廣東湛江 524088;3.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,廣東湛江 524088;4.廣東海洋大學農(nóng)學院,廣東湛江 524088)

蛋白核小球藻不同生長階段油脂和脂肪酸組成的分析

楊慧敏1,2,秦焰禎1,楊青峰1,2,朱宏波4,胡雪瓊1,2,鐘 敏1,2,李雁群1,2,3,*

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088;2.廣東海洋大學海洋藥物研究所,廣東湛江 524088;3.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,廣東湛江 524088;4.廣東海洋大學農(nóng)學院,廣東湛江 524088)

目的:本文通過觀察蛋白核小球藻油脂含量及其脂肪酸組成隨培養(yǎng)期變化的規(guī)律,增加對小球藻油脂代謝機理的了解。方法:收集不同生長時期的蛋白核小球藻藻細胞,采用Folch法和氣相色譜法對其在不同生長階段的總脂含量和脂肪酸組成進行測定。結(jié)果:隨培養(yǎng)期的延長,油脂含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢,其中缺氮脅迫階段油脂總含量最高達到細胞干重的21.18%,是對數(shù)生長期的1.54倍,穩(wěn)定期的1.32倍;氣相色譜分析結(jié)果表明,各個階段中不飽和脂肪酸的含量均高于飽和脂肪酸,其中缺氮脅迫階段多不飽和脂肪酸含量最高,占總脂含量的35.90%,其中以油酸C18∶1和亞油酸C18∶2含量較高。結(jié)論:缺氮脅迫處理有利于蛋白核小球藻總脂含量的增加和多不飽和脂肪酸的積累,提高了蛋白核小球藻的油脂質(zhì)量。

蛋白核小球藻,總脂含量,脂肪酸成分,生長期

微藻是一類廣泛存在于不同水域(如淡水、海水、沼澤、溫泉、鹽堿水)等環(huán)境的光能自養(yǎng)型單細胞微小生物[1],部分微藻在特定的生長環(huán)境中可以積累油脂,其中以橢圓柵藻(Scenedesmusovalternus)、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardii)和小球藻(Chlorellasp.)等的油脂含量較高[2]。小球藻為綠藻門小球藻屬的普生性單細胞藻,常見的有蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)、普通小球藻(Chlorellavulgaris)、橢圓小球藻(Chlorellaellipsoidea)等[3]。小球藻的蛋白質(zhì)含量接近于啤酒酵母,是優(yōu)良的植物蛋白源,氨基酸種類齊全,含量接近甚至超過FAO標準[4]。據(jù)報道[5-6],蛋白核小球藻在特定的異養(yǎng)條件下,不飽和脂肪酸含量可高達75%(占總脂肪酸),主要集中在C16～C18,其中亞油酸含量達到47.17%,亞麻酸含量達10.03%,這在其他食品材料中較為少見。油脂中的不飽和脂肪酸,在保健功能方面有預(yù)防高血壓和高血脂發(fā)生、增強免疫力、抗氧化等功效[7]。小球藻還可用于新型功能性食品、食品添加劑或食品強化劑的開發(fā),在小球藻片和膠囊、面條、面包、餅干、提取物等方面均有應(yīng)用。在利用物理及化學方法促進不同種類微藻高產(chǎn)油脂方面,已有許多研究成果[5-6,8-9],賀國強等[2]對蛋白核小球藻不同營養(yǎng)方式研究發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)培養(yǎng)條件下蛋白核小球藻生長速率及油脂含量較高,其中總脂含量達到細胞干重的38.66%,分別為自養(yǎng)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)條件下的2.06和1.40倍;金虹[6]等研究發(fā)現(xiàn),以葡萄糖為碳源、尿素為氮源且濃度分別為30.0、1.5 mg/L時,小球藻的生物量和油脂產(chǎn)量分別達到8783.9 mg/L和126.3 mg(L·d);黃冠華等[10]對不同環(huán)境因素對小球藻脂肪酸組分及含量分析發(fā)現(xiàn),pH5.0時,不飽和脂肪酸含量占總脂含量的79.93%,其中油酸含量占27.51%,而鹽度影響實驗中NaCl濃度為0.1 mol/L時,不飽和脂肪酸含量達81.18%,其中大部分為硬脂酸,占脂肪酸總含量的35.67%。花凱[11]、韓菲菲[12]、胡慧慧[13]、江懷真[14]、吳瓊芳[15]等實驗也表明,氮源限制、不同種類培養(yǎng)基及磷元素的濃度、植物生長激素等對小球藻的油脂含量及脂肪酸組成都有很大的影響。

但關(guān)于蛋白核小球藻在不同生長階段的油脂含量及組成變化和光系統(tǒng)協(xié)同調(diào)配的研究卻未見報道,本文就這個問題進行了初步的研究,意在為以后關(guān)于蛋白核小球藻及其油脂的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗用的蛋白核小球藻(FACHB-5) 購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫;培養(yǎng)基 采用BG-11培養(yǎng)基[16],其組成為:NaNO31.5 g/L,K2HPO40.04 g/L,MgSO4·7H2O 0.075 g/L,CaCl2·2H2O 0.036 g/L,檸檬酸0.60 mg/L,檸檬酸鐵銨 0.60 mg/L,Na2EDTA 0.10 mg/L,Na2CO30.02 g/L,混合微量元素1 mL,以上試劑均為分析純,購自湛江林達試劑公司;無1.5 g/L NaNO3添加的培養(yǎng)基 即為缺氮培養(yǎng)基;異辛烷(色譜純) 購自山東西亞化學工業(yè)有限公司;三氯甲烷、無水硫酸鈉、甲醇等 均為分析純,購自廣東光華科技股份有限公司;脂肪酸標準品GLC-NESTLE-37 購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;PHS-25數(shù)顯pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;電子分析天平(d=0.0001) 北京賽多利斯天平有限公司;WFJ-7200可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;EYELA OSB-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛明儀器有限公司;DC-24氮吹儀 上海安譜實驗科技股份有限公司;Trace GC Ultra氣相色譜儀 Thermo Electron Corporation。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白核小球藻的培養(yǎng) 將蛋白核小球藻以10%的接種量接種于100 mL BG-11培養(yǎng)基中,置于(28±0.5) ℃環(huán)境中,24 h節(jié)能燈連續(xù)光照,光照強度為3000 lx,通入含5% CO2的潔凈空氣,通氣量為400～600 mL/min,磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)。

將處于對數(shù)生長期后期的藻細胞在無菌條件下5000 r/min離心2 min,收集藻細胞重懸于缺氮培養(yǎng)基中,進行缺氮脅迫培養(yǎng)。

1.2.2 蛋白核小球藻生長曲線的測定 采用濁度比色法測定蛋白核小球藻的生長曲線,取適量藻液稀釋10倍后于分光光度計中測定在600 nm下的吸光度值A(chǔ)600,連續(xù)10 d每天取樣測定,作出A600隨培養(yǎng)時間的變化曲線,其中最終吸光度值取實測值與稀釋倍數(shù)的乘積。

1.2.3 蛋白核小球藻油脂提取 取適量藻懸液于4 ℃、5000 r/min離心5 min,棄上清收集藻細胞,得到藻泥,用于油脂提取和脂肪酸含量測定。

取1 g的藻泥精確稱重,然后置于80 ℃烘箱中烘干至恒重,再稱重,計算藻泥水分含量[17]。油脂提取采用Folch法[18],稱取3.0 g新鮮藻泥于4～8 ℃預(yù)冷的研缽中,加入少量石英砂和60 mL已經(jīng)預(yù)冷的氯仿/甲醇溶液(2∶1,v/v)于通風櫥內(nèi)研磨15 min,然后將勻漿轉(zhuǎn)移到離心管中,洗滌研缽3次并將洗液轉(zhuǎn)移至離心管中,3500 r/min離心10 min,棄沉淀,回收上清。向上清液中加入18 mL(溶劑體積0.2倍)0.9% NaCl溶液,用振蕩器劇烈振蕩5 s,2000 r/min低速離心使溶液分層,棄去上層回收含有油脂的下層(氯仿層)。油脂提取液在氮吹儀下吹干,稱重得粗脂肪重(g),按照公式1計算油脂含量。

式(1)

式中，m1為粗脂肪重(g),m2為藻泥重量(g),W為藻泥水分含量(%)。

1.2.4 藻油脂肪酸組成的測定 首先對提取的油脂進行甲酯化,油脂甲酯化方法如下:稱取藻油約60 mg置于5 mL具塞試管中,加入4 mL異辛烷使藻油溶解充分。加入200 μL 2 mol/L KOH甲醇溶液,蓋上玻璃塞,猛烈振搖30 s后靜置澄清。向溶液中加入1 g無水硫酸氫鈉(NaHSO4),猛烈振搖,中和氫氧化鉀。繼續(xù)加入試管體積約1/3～1/2的無水硫酸鈉,待鹽沉淀后,將含有脂肪酸甲酯的上層液吸出,4 ℃保存留作脂肪酸分析樣品[19]。

采用氣相色譜法測定脂肪酸的組成及含量。采用Trace GC Ultra氣相色譜儀,PEG-20M毛細管色譜柱(50 m×0.20 mm×0.25 μm),氫火焰離子化檢測器(FID);氣化室、檢測器溫度均為250 ℃;柱溫的升溫程序為:初始溫度150 ℃,保持5 min,以6 ℃/min的升溫速率上升至220 ℃,保持2 min;以6.5 ℃/min升溫至230 ℃并保持維持35 min。助燃氣流量(空氣)為50 mL/min;燃氣流量(H2)為35 mL/min;尾吹氣流量(N2)為30 mL/min;分流比為20∶1。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差的方式表示,采用JMP 7進行方差分析,p<0.05表示差異較顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白核小球藻生長曲線

通過測定不同時間藻懸液的光密度A600值觀察蛋白核小球藻在BG-11培養(yǎng)基中的生長情況,得出光密度值與培養(yǎng)時間的對應(yīng)關(guān)系如圖1所示。

圖1 蛋白核小球藻生長曲線Fig.1 The growth curve of Chlorella pyrenoidosa

由生長曲線可以看出,蛋白核小球藻的生長呈S型曲線,1～2 d細胞生長處于遲緩期,此時細胞代謝系統(tǒng)需要適應(yīng)其新的生長環(huán)境,細胞生長較慢,細胞增長較少;3～5 d由于培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)充足,細胞生長速率較大,達到對數(shù)生長期,細胞總數(shù)達到最大值;自第6 d開始由于營養(yǎng)消耗,生長空間限制,藻細胞生長漸入穩(wěn)定期,生長速率較為緩慢,但仍有生長;自第10 d開始,細胞數(shù)量快速下降,藻細胞進入衰亡期。此結(jié)果與李煒[21]、劉香華[20]實驗中普通小球藻生長周期及各生長期結(jié)果較為接近,生長周期均為8～11 d,3～5 d為對數(shù)生長期,隨后進入穩(wěn)定期,持續(xù)約3 d。本實驗選取第3、7 d的藻細胞進行對數(shù)生長期、穩(wěn)定期的油脂含量的測定。

2.2 不同生長階段對蛋白核小球藻油脂含量的影響

蛋白核小球藻在不同生長階段油脂含量測定結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,蛋白核小球藻油脂含量在13%～22%之間。油脂含量由大到小依次為:氮缺乏脅迫期>穩(wěn)定期>對數(shù)生長期,其中缺氮脅迫階段油脂含量明顯高于對數(shù)生長期和穩(wěn)定期,最高達到21.18%,為對數(shù)生長期的1.54倍,穩(wěn)定期的1.32倍。在營養(yǎng)充足條件下,對數(shù)生長期以細胞生長和細胞分裂為主,此時光合作用產(chǎn)生的代謝流更多的導向細胞分裂所需物質(zhì)的合成,所以油脂含量不高,油脂的合成僅是為了滿足細胞結(jié)構(gòu)構(gòu)成的需要;當進入穩(wěn)定期后,藻細胞含量由于受營養(yǎng)限制,以細胞分裂為主的生長方式開始轉(zhuǎn)化為以儲存油脂維持能量供給的生長方式,所以開始積累油脂,油脂含量升高;在氮源脅迫條件下培養(yǎng)3 d,氮源缺乏而碳源充足的情況下,蛋白質(zhì)和核酸等含氮物質(zhì)合成受到抑制,光合作用不受限制,同化作用繼續(xù)合成油脂,油脂含量進一步提高。這個現(xiàn)象符合氮缺乏脅迫條件培養(yǎng),可以提高藻體的油脂含量的觀點。

圖2 蛋白核小球藻不同生長階段油脂含量Fig.2 Lipid contents of Chlorella pyrenoidosa in different cultivation stages

2.3 蛋白核小球藻在不同生長期油脂脂肪酸組成分析

按照1.2.3和12.4的方法對提取的蛋白核小球藻油脂進行氣相色譜分析,結(jié)果如圖3所示。

根據(jù)上圖對蛋白核小球藻油脂成分進行分析,結(jié)果如表1所示。

表1 蛋白核小球藻在不同生長時期的脂肪酸組成及含量(%)

注:SFA-飽和脂肪酸,UFA-不飽和脂肪酸,MUFA-單不飽和脂肪酸,PUFA-多不飽和脂肪酸。

圖3 蛋白核小球藻不同生長階段脂肪酸氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of Chlorella pyrenoidosafatty acid in different cultivation stages注:A:脂肪酸標準品GLC-NESTLE-37氣相色譜圖;B～D分別為對數(shù)生長期、穩(wěn)定期及缺氮脅迫階段油脂脂肪酸氣相色譜圖。

結(jié)果表明,蛋白核小球藻中各生長時期油脂脂肪酸種類基本相同,主要集中在C16～C18脂肪酸,其中以軟脂酸C16∶0、C17∶1、油酸C18∶1和亞油酸C18∶2等含量較多,總含量均達到各生長階段總脂含量的75%以上,其他短鏈脂肪酸相對含量較低,且各生長階段中不飽和脂肪酸的含量均大于飽和脂肪酸,在對數(shù)生長期、穩(wěn)定期、氮缺乏脅迫期,不飽和脂肪酸含量依次降低,但總含量均不低于65%。不同階段脂肪酸組成存在一定差異,缺氮脅迫期的多不飽和脂肪酸含量最高,達到總脂含量的35.90%,其次為對數(shù)生長期和穩(wěn)定期,這主要是由于亞油酸的含量變化所致,缺氮脅迫期亞油酸和α-亞麻酸相對含量達到最高,分別為25.53%和10.24%;軟脂酸(C16∶0)在培養(yǎng)階段呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢,在穩(wěn)定期和缺氮脅迫期保持相對較高的含量,而棕櫚油酸(C16∶1)含量總體呈現(xiàn)下降趨勢,但變化相對較小;油酸含量在穩(wěn)定期和缺氮脅迫期達到油脂總量的15%以上,亞油酸含量在三個階段保持相對穩(wěn)定且較高的水平。小球藻的營養(yǎng)價值與其體內(nèi)不飽和脂肪酸的含量密切相關(guān),有研究表明普通小球藻脂肪酸含量為飽和脂肪酸﹥多不飽和脂肪酸﹥單不飽和脂肪酸,且指數(shù)生長期的二十碳五烯酸含量最高達到總脂含量的17.92%[21],這與本實驗結(jié)果存在一定的差距,這可能是藻株的不同導致的。

3 結(jié)論

本實驗探討了蛋白核小球藻在不同生長階段總油脂含量及脂肪酸組成的變化。結(jié)果表明,油脂總含量由多到少依次為缺氮脅迫期>穩(wěn)定期>對數(shù)生長期,缺氮脅迫期最高達到21.18%,其含量分別是穩(wěn)定期和對數(shù)生長期的1.32和1.54倍;油脂脂肪酸組成方面,主要集中C16～C18脂肪酸,占脂肪酸總量的75%以上,不飽和脂肪酸的相對含量隨培養(yǎng)的進行逐漸降低,但仍占總量的65%以上。在缺氮脅迫期油脂種類較為豐富,但其不飽和脂肪酸的相對含量有所降低，說明缺氮脅迫對小球藻脂肪酸組成有一定的影響。本文為以后小球藻油脂的高效誘導及基因工程的改造奠定了理論基礎(chǔ)。

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Analysis of lipid content and fatty acid composition ofChlorellapyrenoidosainin different cultivation stages

YANG Hui-min1,2,QIN Yan-zhen1,YANG Qing-feng1,2,ZHU Hong-bo4,HU Xue-qiong1,2,ZHONG Min1,2,LI Yan-qun1,2,3,*

(1.College of Food Science and Technology,Zhanjiang 524088,China;2.Research Institute for Marine Drugs and Nutrition,Zhanjiang 524088,China;3.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety,Zhanjiang 524088,China;4.College of Agriculture,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)

Objective:In order to increase more deeply understanding the lipid synthesis ofC.pyrenoidosa,the changes of the lipid content and the fatty acid composition with the cultivation stage were observed. Methods:The algal biomass was collected at each cultivation stage by centrifugation of cultivation broth,the lipid was extracted and the fatty acid compositions were analysed. Results:The results showed that the total content of lipid was 21.18% in the nitrogen deficiency stage,which was 1.54 and 1.32 fold of that at logarithmic growth phase and stationary phase,respectively. The GC results indicated that long chain fatty acids of C16～C18 were the dominant fatty acids ofC.pyrenoidosa,and most of them were oleic acid(C18∶1)and linoleic acid(C18∶2),accounting for more than 35.90% of the total fatty acids. Conclusion:Increasing total lipid content and polyunsaturated fatty acid accumulated in nitrogen deficiency stress stage,improving the lipid quality ofC.pyrenoidosa.

Chlorellapyrenoidosa;lipid content;fatty acid composition;cultivation stages

2016-09-26

楊慧敏(1991-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：微藻活性物質(zhì)研究與開發(fā)，E-mail：yanghuimin0405@163.com。

*通訊作者:李雁群(1963-)，男，博士，教授，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：liyq2004@126.com。

廣東省自然科學基金項目(2015A030313616)；湛江市科技計劃項目(2015A03026)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)06-0185-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.027