塑化劑鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)秀麗隱桿線蟲生理活性影響研究

李 萍,米生權(quán),馮亞芳,馮斯文,趙 卓

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院,北京100191)

塑化劑鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)秀麗隱桿線蟲生理活性影響研究

李 萍,米生權(quán)*,馮亞芳,馮斯文,趙 卓

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院,北京100191)

目的:探究鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)對(duì)秀麗隱桿線蟲的壽命、生殖毒性和神經(jīng)毒性的影響。方法:將L2期秀麗隱桿線蟲暴露于DBP 32.5、131、522 mg/L 3個(gè)濃度組、DMSO溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組中,測(cè)定線蟲壽命、生殖能力、移動(dòng)能力和吞咽頻率的變化。結(jié)果:DBP暴露導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲的壽命縮短,生殖能力下降,移動(dòng)能力減慢,吞咽頻率降低,且存在劑量依賴關(guān)系。結(jié)論:DBP暴露縮短線蟲壽命,造成生殖毒性和神經(jīng)毒性影響。

秀麗隱桿線蟲,鄰苯二甲酸二丁酯,壽命,生殖毒性,神經(jīng)毒性

鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)是一種重要的鄰苯二甲酸酯類化合物(酞酸酯,PAEs),是工業(yè)上常用的增塑劑和軟化劑,多用于輪胎、橡膠、粘合劑、電線外皮等的生產(chǎn)[1-2],以增加其柔韌性、曲撓性和伸長(zhǎng)性[3]。PAEs是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,含雌性激素成分,能夠干擾人體正常的內(nèi)分泌從而影響生殖系統(tǒng),具有明顯的生殖、發(fā)育毒性[4]。由于在產(chǎn)品的生產(chǎn)加工過程中,DBP與高分子聚合物之間不以共價(jià)鍵形式結(jié)合,而是物理結(jié)合,長(zhǎng)時(shí)間暴露在外,DBP可由塑料轉(zhuǎn)移到外界,對(duì)空氣、土壤、水等資源造成嚴(yán)重的污染[5-6],進(jìn)而經(jīng)口、呼吸、皮膚接觸、醫(yī)療暴露等途徑進(jìn)入人體,通過生物富集作用,對(duì)生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等均存在毒性效應(yīng)[7-8]。已有研究證實(shí),DBP對(duì)人類產(chǎn)生生殖毒性,造成男性不育和發(fā)育紊亂如尿道下裂、隱睪病、精子形成功能紊亂、肛門和生殖器之間距離縮短等[9-11]。小鼠實(shí)驗(yàn)也表明,DBP誘發(fā)睪丸萎縮,可能原因是精母細(xì)胞死亡[12-13]。秀麗隱桿線蟲包含302個(gè)神經(jīng)元,并且神經(jīng)通路明確,因此線蟲是研究毒理學(xué)的良好模型[14-15],因此本實(shí)驗(yàn)選擇秀麗隱桿線蟲為動(dòng)物模型,研究DBP對(duì)線蟲的壽命、生殖毒性和神經(jīng)毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌OP50與N2野生型C.elegans中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所惠贈(zèng);鄰苯二甲酸二丁酯(DBP，純度:98.0%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;二甲基亞砜(DMSO) 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

XDS-1B型倒置顯微鏡 重慶重光實(shí)業(yè)有限公司;SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋公司;MJ-250F-II型霉菌生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;5804R型高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品板制備 分別吸取0.03125、0.125、0.5 mL的鄰苯二甲酸二丁酯于離心管中,分別加入二甲基亞砜(DMSO)溶解并定容至10 mL,再依次從中取出0.1 mL樣品溶液于新的離心管中,加入滅菌融化的NGM培養(yǎng)基并定容至10 mL,配制成濃度為32.5、131、522 mg/L的樣品溶液。另外,取0.1 mL DMSO加入到10 mL滅菌融化的NGM培養(yǎng)基中,制成溶劑對(duì)照組,再取10 mL滅菌融化的NGM培養(yǎng)基做純白對(duì)照組,無菌操作,將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中,室溫冷卻。

在以上制備NGM培養(yǎng)基中涂布100 μL OP50菌液,20 ℃恒溫培養(yǎng)48 h,待大腸桿菌長(zhǎng)出薄薄一層即可。

1.2.2 線蟲的前期處理 取含有成蟲期蟲較多的培養(yǎng)皿3板,同步化處理[16],將同步化培養(yǎng)后L2期蟲子切塊,分別接種到制備好的含樣品和空白的培養(yǎng)皿上,每個(gè)濃度各接3板。20 min后,觀察培養(yǎng)皿上蟲子的數(shù)量,確保在一百條左右。20 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。

1.2.4 線蟲生殖能力分析實(shí)驗(yàn) 從生理水平上,秀麗隱桿線蟲的產(chǎn)卵數(shù)反映的就是其生殖能力,根據(jù)線蟲產(chǎn)卵數(shù)便可分析出樣品鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)秀麗線蟲生殖能力的影響。結(jié)合秀麗線蟲壽命分析實(shí)驗(yàn),對(duì)照組和樣品組各挑取狀態(tài)相當(dāng)?shù)男沱愲[桿線蟲10條左右至鋪有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基中,對(duì)照組和樣品實(shí)驗(yàn)組分別作兩個(gè)平行。于20 ℃培養(yǎng),每隔24 h將存活的秀麗線蟲挑至相同濃度的新的NGM培養(yǎng)基上,產(chǎn)卵數(shù)要在線蟲產(chǎn)卵后的第2 d記錄,即前一天的平板于20 ℃培養(yǎng)箱中經(jīng)24 h培養(yǎng)后,便可記錄新繁殖出的秀麗線蟲的幼蟲數(shù)量。應(yīng)準(zhǔn)確記錄每次換下的舊板上幼蟲數(shù)量直至線蟲產(chǎn)卵完全結(jié)束喪失生殖能力。每條秀麗線蟲在產(chǎn)卵期產(chǎn)卵的總和即為秀麗線蟲的產(chǎn)卵數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS Statistic 20.0軟件單因素方差分析。

1.2.5 線蟲移動(dòng)能力測(cè)定實(shí)驗(yàn) 正常線蟲的運(yùn)動(dòng)軌跡為正弦曲線,非正弦曲線運(yùn)動(dòng)軌跡反映運(yùn)動(dòng)平衡失調(diào)。本實(shí)驗(yàn)中,隨機(jī)抽取一定數(shù)量的線蟲,測(cè)定其移動(dòng)距離來反映樣品鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)線蟲移動(dòng)能力的影響。

利用壽命分析實(shí)驗(yàn)中的樣品板和對(duì)照板進(jìn)行移動(dòng)能力實(shí)驗(yàn),每隔5 d從對(duì)照組和不同濃度樣品組中選取約10條秀麗線蟲,并且平行組也需進(jìn)行測(cè)定。在高清晰度體式顯微鏡下觀察并記錄在1 min內(nèi)線蟲移動(dòng)時(shí)身體彎曲的數(shù)目。1次彎曲為線蟲相對(duì)于身體長(zhǎng)軸方向上的一個(gè)波長(zhǎng)的移動(dòng)。平均移動(dòng)距離是指每組平板中秀麗線蟲1 min內(nèi)移動(dòng)時(shí)身體彎曲的數(shù)目,以個(gè)為單位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Origin 9.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

1.2.6 線蟲吞咽頻率測(cè)定實(shí)驗(yàn) 吞咽頻率可以成為一種評(píng)價(jià)秀麗隱桿線蟲攝食行為的指標(biāo)。正常線蟲吞咽食物的頻率為200次/min。本實(shí)驗(yàn)中,隨機(jī)抽取一定數(shù)量的秀麗線蟲測(cè)定其吞咽頻率來反映樣品鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)其神經(jīng)系統(tǒng)的影響。

利用壽命分析實(shí)驗(yàn)中的樣品板和對(duì)照板進(jìn)行吞咽頻率測(cè)定,每隔5 d從對(duì)照組和樣品組中選取約10條秀麗線蟲。在倒置攝像顯微鏡下觀察并記錄在1 min內(nèi)秀麗線蟲的吞咽頻率。1次吞咽定義為咽泵從一側(cè)到另一側(cè)后,再返回來。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Origin 9.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 用SPSS 20.0處理數(shù)據(jù),用OriginPro 9.1作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 線蟲壽命測(cè)定

如圖1所示,空白對(duì)照組秀麗線蟲的最長(zhǎng)壽命為24 d;32.5 mg/L樣品實(shí)驗(yàn)組線蟲最長(zhǎng)壽命為22 d;131 mg/L樣品實(shí)驗(yàn)組線蟲最長(zhǎng)壽命為21 d;而當(dāng)樣品濃度為522 mg/L時(shí),線蟲壽命最短,僅為20 d。由此可知,隨著鄰苯二甲酸二丁酯濃度的升高,線蟲生存時(shí)間逐漸縮短,反映了鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)線蟲造成一定毒性影響,縮短線蟲的壽命并伴有一定的濃度依賴性。

圖1 不同濃度鄰苯二甲酸二丁酯溶液對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響Fig.1 Effects of different concentrations of dibutyl phthalate on the life of Caenorhabditis elegans

2.2 線蟲生殖能力測(cè)定

累計(jì)產(chǎn)卵數(shù)反映了秀麗線蟲的繁殖能力,通過測(cè)定產(chǎn)卵數(shù)有利于研究鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)秀麗線蟲在生殖能力方面引起的毒性作用。如圖2所示,與DMSO對(duì)照組相比,131 mg/L DBP處理組線蟲產(chǎn)卵數(shù)顯著降低(p<0.05),522 mg/L DBP處理組線蟲產(chǎn)卵數(shù)極顯著降低(p<0.01),表明鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)秀麗線蟲存在生殖毒性作用,影響其生殖和產(chǎn)卵能力。

圖2 不同濃度鄰苯二甲酸二丁酯溶液對(duì)秀麗線蟲產(chǎn)卵數(shù)的影響Fig.2 Effect of dibutyl phthalate solution with different concentrations on the fecundity of Caenorhabditis elegans注:與DMSO對(duì)照組相比,* p<0.05,**p<0.01;圖3、圖4同。

2.3 線蟲移動(dòng)能力測(cè)定

移動(dòng)能力作為秀麗隱桿線蟲的運(yùn)動(dòng)行為,可以反映線蟲神經(jīng)系統(tǒng)的基本功能。該實(shí)驗(yàn)觀察天數(shù)為20 d,從實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第1 d起每隔5 d進(jìn)行一次結(jié)果記錄,經(jīng)分析四次結(jié)果總體趨勢(shì)一致,圖3所示為實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的第5 d結(jié)果。平均移動(dòng)距離是指每組平板中秀麗線蟲1 min內(nèi)移動(dòng)時(shí)身體彎曲的數(shù)目,以個(gè)為單位。如圖3所示,與DMSO對(duì)照組相比,131 mg/L 和 522 mg/L DBP處理組線蟲移動(dòng)距離極顯著降低(p<0.01),表明鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)秀麗線蟲造成毒性影響。

圖3 不同濃度鄰苯二甲酸二丁酯溶液對(duì)秀麗線蟲移動(dòng)能力的影響Fig.3 Effect of dibutyl phthalate solution with different concentrations on Caenorhabditis elegans mobile ability

2.4 線蟲吞咽頻率測(cè)定

該實(shí)驗(yàn)觀察天數(shù)為20 d,從實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第1 d起每隔5 d進(jìn)行一次結(jié)果記錄,經(jīng)分析四次結(jié)果總體趨勢(shì)一致,圖4所示為實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的第5 d結(jié)果。平均吞咽頻率是指每組平板中線蟲1 min咽泵吞咽頻率。如圖4所示,131 mg/L和522 mg/L DBP處理組線蟲吞咽頻率極顯著降低(p<0.01),表明鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)秀麗線蟲造成毒性影響。

圖4 不同濃度鄰苯二甲酸二丁酯溶液對(duì)秀麗線蟲吞咽頻率的影響Fig.4 Effect of dibutyl phthalate solution with different concentrations on Caenorhabditis elegans swallowing frequency

3 結(jié)論與討論

本研究中鄰苯二甲酸二丁酯暴露導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲的壽命縮短,生殖能力下降,移動(dòng)速度減慢,吞咽頻率降低,且存在劑量依賴關(guān)系,表明鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)秀麗隱桿線蟲的生殖,壽命,神經(jīng)等產(chǎn)生一定的毒性作用。研究資料表明,DBP對(duì)斑馬魚和果蠅的生殖與壽命也有一定的毒性影響。與秀麗隱桿線蟲相似,斑馬魚也是一種雌雄同體的魚類。DBP暴露降低斑馬魚的孵化率和受精率,提高子一代的死亡率[17-18]。其中,死亡率看做壽命指標(biāo),孵化率,受精率可等同于生殖能力。與本實(shí)驗(yàn)相比較來看,得出的結(jié)論基本一致,即DBP有一定的生殖毒性,隨著濃度升高壽命逐漸縮短,生殖能力逐漸下降。不同的是,本次實(shí)驗(yàn)主要觀察的是DBP對(duì)線蟲本身的毒性作用,沒有考慮對(duì)后代的影響。低濃度的DBP增強(qiáng)雌性果蠅的生殖能力,高濃度的DBP降低雌性果蠅的生育能力[19-20]。此結(jié)果與本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果雖有差異,但也有吻合之處。本次實(shí)驗(yàn)也證實(shí)在高濃度也就是DBP濃度為522 mg/L時(shí),對(duì)線蟲的壽命和生殖的影響最明顯。然而在DBP為131 mg/L等低濃度時(shí),對(duì)線蟲也有一定的生殖障礙和減緩壽命的作用,與以果蠅為模式動(dòng)物的結(jié)果相反,這可能是由于DBP對(duì)兩種模式動(dòng)物的作用機(jī)制不盡相同而造成,要待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的論證?？傊?無論是秀麗隱桿線蟲,斑馬魚或者果蠅,DBP都對(duì)其生殖能力和壽命有一定的影響。

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Study on the effects of dibutyl phthalate on physiological activity inCaenorhabditiselegans

LI Ping,MI Sheng-quan*,FENG Ya-fang,FENG Si-wen,ZHAO Zhuo

(College of Applied Arts and Science of Beijing Union University,Beijing 100191,China)

Objective:To study the influence of DBP on lifespan,reproductive toxicity and neurotoxicity inCaenorhabditiselegans. Methods:L2C.eleganswere expoused to the DBP concentration of 32.5,131,522 mg/L. Then nematode longevity,reproductive capacity,mobility and frequency of swallowing were measured. Results:The life span was shorten,reproductive,frequency of swallowing and mobile ability were reduced inCaenorhabditiselegansdue to DBP expose in a concentration-dependent manner. Conclusion:DBP induce reproductive toxicity and neurotoxicity inCaenorhabditiselegans,at the same time,it can shorten the lifespan ofC.elegans.

Caenorhabditiselegans;dibutyl phthalate;life span;reproductive toxicity;neurotoxicity

2016-09-26

李萍(1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向: 營(yíng)養(yǎng)與慢性病，E-mail:1114176776@qq.com。

*通訊作者:米生權(quán)(1975-), 男，博士，副教授, 研究方向: 營(yíng)養(yǎng)與慢性病,E-mail:msq65@buu.edu.cn。

北京市教委研究項(xiàng)目資助(SQKM201311417014)；北京市屬高等學(xué)校人才強(qiáng)教計(jì)劃資助項(xiàng)目(PHR201107150)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)06-0129-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.016