難溶性植物蛋白與功能油脂的自組裝復(fù)合物的制備及其消化吸收

陳偉鴻,肖俊勇,馬方勵,萬江陵,盛小莉

(1.無限極(中國)有限公司,廣東廣州 510000;2.華中科技大學(xué)無限極現(xiàn)代制劑技術(shù)聯(lián)合實驗室,湖北武漢 430000;3.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430000)

難溶性植物蛋白與功能油脂的自組裝復(fù)合物的制備及其消化吸收

陳偉鴻1,肖俊勇1,馬方勵1,萬江陵3,盛小莉2

(1.無限極(中國)有限公司,廣東廣州 510000;2.華中科技大學(xué)無限極現(xiàn)代制劑技術(shù)聯(lián)合實驗室,湖北武漢 430000;3.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430000)

本研究以大米蛋白和核桃油為研究對象,采用自組裝工藝制備出大米蛋白-核桃油復(fù)合物,并通過掃描電鏡(SEM)來表征復(fù)合物的形成;采用奶粉分散性測定實驗評價大米蛋白-核桃油復(fù)合物與原料沖調(diào)性的差異;采用蛋白質(zhì)體外消化率實驗及核桃油藥動學(xué)實驗評價大米蛋白-核桃油復(fù)合物與原料在吸收上的差異。實驗結(jié)果表明:大米蛋白-核桃油的分散時間縮短49.50%;與原料相比較,大米蛋白-核桃油復(fù)合物的蛋白質(zhì)體外消化率提升了8.49%、油酸生物利用度提高了70.86%、亞油酸生物利用度提高了63.01%。經(jīng)過自組裝工藝制備的大米蛋白-核桃油復(fù)合物沖調(diào)性能更好、成分吸收更好。

難溶性植物蛋白,大米蛋白,核桃油,自組裝,生物利用度

植物蛋白和功能油脂是保健食品常用的兩大類功能物質(zhì),但這兩類功能物質(zhì)實際應(yīng)用過程中存在著不足:植物蛋白因溶解度低,在沖調(diào)過程中分散性差;而富含不飽和脂肪酸的功能油脂自身穩(wěn)定性較差,也難以直接添加到植物蛋白中進行搭配。

大米蛋白是一種常見的植物蛋白,具有抗原性低、生物價高等優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于高蛋白低過敏嬰兒配方米粉[1]。但大米蛋白存在溶解度差、分散性不好等[2]問題導(dǎo)致在沖調(diào)過程中出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象。結(jié)塊現(xiàn)象不僅會影響消費者的服用口感,也會影響胃腸道對大米蛋白的消化吸收。

核桃油含有高達90%以上的不飽和脂肪酸及多種生物活性物質(zhì)[3],因具有降血脂、清除自由基、增強抗氧化、提高記憶力等功能特性而廣泛用于保健食品中[4]。核桃油常溫下為液態(tài),且屬于脂溶性物質(zhì),難以直接與其他水溶性物質(zhì)復(fù)配成配方食品。

自組裝是指在分子之間自發(fā)地形成有序結(jié)構(gòu)單元的一種現(xiàn)象[5]。自組裝現(xiàn)象在日常生活中也屢見不鮮,例如牛奶中的成分——蛋白質(zhì)與脂肪組裝在一起從而形成均勻穩(wěn)定的牛奶溶液。近年來越來越多的制劑工作者將自組裝技術(shù)應(yīng)用在提升難溶性物質(zhì)的水分散性上,難溶性蛋白質(zhì)具有親水性及親脂性基團,在外力作用下蛋白與油脂親脂性基團可充分結(jié)合,當?shù)鞍椎挠H水性基團外露,將大大提升難溶性蛋白的水分散性,伴隨著蛋白分散性的提升,服用后與胃腸道消化吸收的接觸面積將顯著提升,將有利于蛋白的吸收。

本研究仿照牛奶成分的構(gòu)成,以大米蛋白、核桃油為研究對象,試圖通過自組裝技術(shù)開發(fā)出分散性好、易于吸收的難溶性植物蛋白-功能油脂固體飲料及適合其工業(yè)化生產(chǎn)的工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米蛋白 純度42.3%，購自江西金農(nóng)生物科技有限公司;核桃油 購自菏澤中禾健元生物科技有限公司;麥芽糊精 購自保齡寶生物股份有限公司;大豆卵磷脂 純度97.9%,購自舒萊貿(mào)易(上海)有限公司;維生素E 購自浙江醫(yī)藥新昌制藥廠;生理鹽水 購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;SD大鼠 購自湖北省實驗動物研究中心,許可證號SCXK(鄂)2015-0018;胃蛋白酶生化試劑BR 購自國藥集團化學(xué)試劑公司;胰蛋白酶生化試劑BR 購自國藥集團化學(xué)試劑公司;濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、硼酸、氫氧化鈉、鹽酸等 均為分析純。

JM-L型膠體磨 溫州市長宏輕工機械有限公司;LPG-150型離心噴霧干燥機 常州市優(yōu)博干燥工程有限公司;SYH-100型三維運動混合機 常州市精鑄干燥設(shè)備有限公司;ATN-300型全自動凱氏定氮儀 上海洪紀儀器設(shè)備有限公司;Agilent7890A型氣相色譜儀 美國Agilent公司;Quanta-200型環(huán)境掃描電鏡 荷蘭FEI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大米蛋白-核桃油復(fù)合物的制備工藝 將25 kg麥芽糊精投入360 kg 60 ℃熱水中攪拌溶解,然后加入60 kg大米蛋白和25 kg甘露醇,攪拌均勻,即得水相。60 ℃水浴攪拌條件下,將4.54 kg卵磷脂和25.8 g維生素E加入15.04 kg核桃油中攪拌溶解混勻,即得油相。60 ℃水浴攪拌條件下,向水相中加入油相,加入剩余15 kg水沖洗配料罐壁,繼續(xù)攪拌10～15 min后,將物料導(dǎo)入膠體磨中進行2次剪切,最后進行噴霧干燥即得大米蛋白-核桃油復(fù)合物。

1.2.2 大米蛋白-核桃油復(fù)合物分散時間測定 稱取大米蛋白、大米蛋白-核桃油復(fù)合物樣品各5 g,溶于25 ℃、50 mL 去離子水中,經(jīng)恒溫磁力攪拌器以一定的轉(zhuǎn)速攪拌,記錄從攪拌開始到乳粉結(jié)塊組織全部分散所需時間;重復(fù)實驗3次,取其平均值,此值作為分散時間(dispersity time,DT)[6]。

1.2.3 大米蛋白-核桃油復(fù)合物形態(tài)觀察 通過SEM可以觀察自組裝樣品表面的結(jié)構(gòu),在粘有導(dǎo)電的膠性物質(zhì)樣品臺上撒上一薄層樣品,用吹風機除去多余樣品,樣品鍍金后置于電子顯微鏡樣品室中,選擇合適的倍數(shù)進行觀察和拍照。

1.2.4 蛋白質(zhì)體外消化分析

1.2.4.1 蛋白質(zhì)體外消化率實驗 實驗方法參照文獻報導(dǎo)[7-8]但略有改動,具體操作如下。

a.消化液的配制：參照現(xiàn)行藥典[9]規(guī)定配制人工胃液、人工腸液、磷酸鹽緩沖鹽溶液。

b.蛋白質(zhì)體外消化率實驗:準確稱量大米蛋白、自組裝樣品(以所含大米蛋白量計)約0.5 g,分別置于250 mL三角瓶中,加入30 g人工胃液,將三角瓶置于搖床中,設(shè)定溫度為37 ℃,振搖速度80 r/min,振蕩3 h。然后再用NaOH調(diào)節(jié)pH為6.8,加入15 mL磷酸鹽溶液,再加入15 mL人工腸液,在搖床中于溫度為37 ℃,振搖速度80 r/min的條件下,振蕩3 h。從三角瓶中取出溶液10 g,加入10%三氯乙酸溶液10 g進行沉淀、離心(4000 r/min,10 min),取上清液。用凱氏定氮法測定溶液中的氮含量。同時按上述實驗步驟,測定空白試樣中的含氮量。

1.2.4.2 蛋白質(zhì)體外消化率計算及數(shù)據(jù)處理 蛋白質(zhì)體外消化率的計算公式如下:

采用ANOVA(方差分析)進行實驗組組間的顯著性檢驗。當p<0.05時有顯著性差異。本實驗均進行3次平行實驗,2次重復(fù)實驗。

1.2.5 油脂生物利用度分析

1.2.5.1 油脂生物利用度實驗方法 將10只SD大鼠隨機分成兩組進行口服灌胃給藥(2 g/kg·d),一組給予大米蛋白-核桃油復(fù)合物樣品,另一組給予大米蛋白-核桃油物理混合物(大米蛋白∶核桃油=3.99∶1);于給藥前和給藥后0.5、1.0、1.5、2、3、4、6、8、10、12、20、24 h從大鼠眼眶取血,并將血樣置于抹有肝素的離心管中,在低溫離心機中進行離心(4000 r/min,10 min),取血漿并低溫保存待用。

1.2.5.2 血樣處理 脂肪酸提取[10]:取血漿100 μL,加入甲醇0.5 mL,正己烷1.0 mL,渦旋振蕩,加1 mol/L磷酸0.1 mL,渦旋振蕩均勻,離心(4000 r/min,5 min),取全部上清液,加入0.1 mol/L磷酸0.3 mL,渦旋振蕩,離心(4000 r/min,1 min),取全部上層清液,氮吹儀吹干樣品。

脂肪酸甲酯化:樣品加入0.5 mol/L的KOH-CH3OH溶液0.6 mL,于60 ℃水浴20 min,加入三氟化硼-乙醚0.3 mL于60 ℃水浴2 min,冷卻后加入十七烷酸甲酯的正己烷內(nèi)標物溶液10 μL,濃度2.756 mg/mL。再加入正己烷0.45 mL萃取,加入與正己烷等體積的飽和生理鹽水,渦旋振蕩,靜置分層,離心(4000 r/min,2 min),取全部上層清液,用氮吹儀吹干樣品,加入正己烷定容至200 μL。

1.2.5.3 油脂檢測方法 色譜柱為FFAP(30 m,0.25 mm i.d.,0.5 μm film thickness);載氣為N2;進口壓力25 psi;進樣體積:2 μL;分流比:1∶10;升溫程序:初始溫度:210 ℃,保持8 min,以20 ℃/min升溫至230 ℃,保持 5 min,總分析時間15 min;進樣口溫度:260 ℃;檢測器溫度:280 ℃。

1.2.5.4 數(shù)據(jù)處理與分析 將每個采集時間點的血漿中油酸和亞油酸的平均值除以0 h時血漿中油酸和亞油酸的平均值作為該點的藥物濃度數(shù)據(jù),采用DAS2.0藥動學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 大米蛋白-核桃油復(fù)合物收率及成分分析

收集如“1.2.1”制備得到的大米蛋白-核桃油復(fù)合物,得到109 kg,收率為84.1%,其中蛋白質(zhì)含量為36.6%,核桃油含量為15.5%。

2.2 大米蛋白-核桃油復(fù)合物形態(tài)分析

通過SEM可以觀察自組裝樣品表面的結(jié)構(gòu),在粘有導(dǎo)電的膠性物質(zhì)樣品臺上撒上一薄層樣品,用吹風機除去多余樣品,樣品鍍金后置于電子顯微鏡樣品室中,選擇合適的倍數(shù)進行觀察和拍照,結(jié)果如圖1。將大米蛋白-核桃油復(fù)合物樣品加水分散后,用倒置顯微鏡觀察其形態(tài),結(jié)果如圖2。

圖1 自組裝樣品SEM圖(400×)Fig.1 SEM image of self-assembled rice protein-walnut oil compound(400×)

圖2 自組裝樣品分散形態(tài)圖(200×)Fig.2 Scatter pattern of self-assembled rice protein-walnut oil compound(200×)

大米蛋白-核桃油復(fù)合物噴霧干燥的樣品在SEM觀察下,呈圓形顆粒狀,但有些顆粒凹陷,分析可能原因是在噴霧干燥中,顆粒水分氣化不均。將噴霧干燥的復(fù)合物樣品復(fù)溶后再倒置顯微鏡下觀察乳液形狀,復(fù)合物樣品復(fù)溶后乳滴較大,有塊狀不溶物。

2.3 大米蛋白-核桃油分散時間測定

分散時間是指樣品在水中分散溶解的時間,能夠較為客觀的反映出不同樣品間在沖調(diào)過程中分散性的差異。從表1可知,大米蛋白-核桃油復(fù)合物的分散時間(51.00±1.00)s比大米蛋白的分散時間(101.00±2.65) s縮短了49.50%,通過方差分析兩組樣品的分散時間具有顯著性差異(p<0.05),說明經(jīng)過自組裝后的大米蛋白-核桃油復(fù)合物的分散性更好。

表1 分散性測定實驗(n=3,X±SD)

注:*p<0.05,表示兩組樣品間數(shù)據(jù)有顯著性差異；表2同。

2.4 蛋白質(zhì)體外消化率

蛋白質(zhì)消化率是指被人體吸收的蛋白質(zhì)占總攝入蛋白質(zhì)的比值,反映出蛋白質(zhì)被消化酶分解、吸收的程度。蛋白質(zhì)的體外消化過程能夠在一定程度上反映蛋白質(zhì)在人體內(nèi)的消化過程,因此蛋白質(zhì)體外消化率的差異能夠間接的反映蛋白質(zhì)被人體吸收的差異。從表2可知,大米蛋白-核桃油復(fù)合物的蛋白質(zhì)體外消化率78.98%±1.32%比大米蛋白的蛋白質(zhì)體外消化率72.80%±0.48%提高8.49%,通過方差分析兩組樣品的蛋白質(zhì)體外消化率具有顯著性差異(p<0.05),說明自組裝后的樣品更易于被消化酶分解。

蛋白質(zhì)體外消化率實驗說明大米蛋白-核桃油復(fù)合物更易于被人體吸收,其原因可能是:通過自組裝后的大米蛋白-核桃油復(fù)合物在人工胃液及人工腸液中自發(fā)形成高度分散的納米乳,能夠與消化酶充分接觸,進而被快速分解[11-12];大米蛋白原料在人工胃液及人工腸液中會聚集成團或形成沉淀,導(dǎo)致無法與消化酶充分接觸,進而影響吸收。

表2 蛋白質(zhì)體外消化率(n=3,X±SD)

2.5 油脂體內(nèi)生物利用度分析

油酸及亞油酸是核桃油的主要組成成分,故選擇油酸及亞油酸作為評價不同樣品核桃油吸收效率的目標成分。圖3、圖4為油酸、亞油酸在血漿中的濃度-時間曲線圖,表3、表4為油酸、亞油酸的藥動學(xué)參數(shù)。

表3 油酸藥動學(xué)參數(shù)

圖3 油酸在血漿中濃度-時間曲線圖(n=6,X±SEM)Fig.3 Concentration-time curve of oleic acid in plasma(n=6,X±SEM)

圖4 亞油酸在血漿中濃度-時間曲圖(n=6,X±SEM)Fig.4 Concentration-time curve of linoleic acid in plasma(n=6,X±SEM)

藥動學(xué)參數(shù)大米蛋白-核桃油復(fù)合物大米蛋白-核桃油物理混合物AUC(0-t)(mg/L·h)7740.274748.45Cmax(mg/L)678.82423.75

自組裝工藝獲得的大米蛋白核桃油復(fù)合物比物理混合對油酸、亞油酸的藥-時曲線下面積AUC明顯增大。與物理混合樣品組相比,自組裝樣品組油酸的吸收利用率提升了70.86%,亞油酸的吸收利用率提升了63.01%。統(tǒng)計學(xué)分析表明:自組裝樣品組與物理混合樣品組在油酸(p<0.05)和亞油酸((p<0.05)吸收效率中有顯著性差異,說明經(jīng)過自組裝工藝制備的大米蛋白核桃油可以促進核桃油的吸收。

油脂藥動學(xué)研究說明大米蛋白和核桃油組裝復(fù)合后能提升油脂的吸收率。其可能原因是油脂需在體內(nèi)膽汁及消化酶的作用下形成乳糜微粒后經(jīng)由淋巴系統(tǒng)進入血液循環(huán)[13],而經(jīng)過自組裝后的大米蛋白-核桃油復(fù)合物在胃腸道的蠕動下自發(fā)地形成高度分散的類似乳糜微粒結(jié)構(gòu)的乳液,相較與大米蛋白-核桃油物理混合物更利于油脂在體內(nèi)的消化吸收。

3 結(jié)論

3.1 仿照牛奶組成成分的植物蛋白-油脂自組裝工藝操作簡單,適合工業(yè)化生產(chǎn)。

3.2 自組裝技術(shù)能夠使液態(tài)油脂固體化,便于液態(tài)油脂與其他成分進行復(fù)配。

3.3 通過蛋白體外消化率實驗、核桃油藥動學(xué)實驗證明:與原料相比,通過自組裝后的大米蛋白-核桃油復(fù)合物的成分吸收效率均得到顯著提升。

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Preparation,digestion and absorption of a self-assembled compound of insoluble vegetable protein and functional lipid

CHEN Wei-hong1,XIAO Jun-yong1,MA Fang-li1,WAN Jian-ling3,SHENG Xiao-li2

(1. Infinitus(China)Company Ltd.,Guangzhou 510000,China;2.Joint Laboratory for the Research of Modern Preparation Technology-Huazhong University of Science and Technology and Infinitus,Wuhan 430000,China;3.College of Life Science & Technology,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430000,China)

The study took rice protein and walnut oil as subjects to obtain a rice protein-walnut oil compound by self-assembly technology,which was confirmed by scanning electron microscopy(SEM). The difference in recombination ability between the rice protein-walnut oil compound and the raw materials was evaluated by milk powder dispersity determination test. The difference in absorbability between the rice protein-walnut oil compound and the raw materials was evaluated by protein external digestibility test and walnut oil pharmacokinetic test. The results indicated that when compared with the raw materials,rice protein-walnut oil compound had the dispersion time shortened by 49.50%,protein external digestibility increased by 8.49%,oleic acid bioavailability increased by 70.86%,and linoleic acid bioavailability increased by 63.01%. Self-assembled rice protein-walnut oil compound had better recombination ability and absorbability.

insoluble vegetable protein;rice protein;walnut oil;self-assembly;bioavailability

2016-08-29

陳偉鴻(1985-)，男，碩士，工程師，研究方向：中藥新制劑研究，E-mail：ray.chen@infinitus-int.com。

*通訊作者:萬江陵(1963-)，男，碩士研究生，副教授，研究方向：藥物設(shè)計和藥物納米制劑的研究，E-mail：wanjl@hust.edu.cn。

新會區(qū)科技計劃項目(2015001006)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)06-0106-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.011