海洋膠原低聚肽中抗氧化肽的分離及鑒定

劉文穎,徐姍姍,谷瑞增,魯 軍,潘興昌,蔡木易

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心,北京 100015)

海洋膠原低聚肽中抗氧化肽的分離及鑒定

劉文穎,徐姍姍,谷瑞增,魯 軍,潘興昌,蔡木易*

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心,北京 100015)

為了考察海洋膠原低聚肽中抗氧化肽的活性和結(jié)構(gòu),本文以三文魚(yú)皮為原料,采用兩步酶解法制備出海洋膠原低聚肽(MCOP),在對(duì)其分子量分布進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上,以DPPH自由基清除能力為指標(biāo)對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,海洋膠原低聚肽中分子量小于1000 u的組分高達(dá)90.79%,主要分布在132～576 u范圍內(nèi),其DPPH自由基清除活性的IC50值約為8.0 mg/mL。然后利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)對(duì)海洋膠原低聚肽進(jìn)行分離純化,收集11個(gè)組分峰,對(duì)其DPPH自由基清除能力進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明,11個(gè)組分的活性均比海洋膠原低聚肽高。最后利用Q-TOF質(zhì)譜儀對(duì)收集的11個(gè)組分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定,并測(cè)定了15個(gè)肽段的DPPH自由基清除活性。結(jié)果表明,15個(gè)肽段均有一定的DPPH自由基清除能力,其中Gly-Arg(GR)、Arg-Glu-Arg(RER)、Ala-Pro(AP)的清除率比海洋膠原低聚肽高,是具有較高抗氧化活性的肽段。本研究為海洋膠原低聚肽的開(kāi)發(fā)利用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

海洋膠原低聚肽,抗氧化肽,分子量分布,分離純化,結(jié)構(gòu)鑒定

自由基可造成機(jī)體的多種損傷和病變,引起衰老、糖尿病、動(dòng)脈硬化以及人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)感染等疾病[1]?？寡趸瘎┛梢郧宄w內(nèi)多余的自由基,從而增強(qiáng)機(jī)體免疫力,延緩衰老。目前所使用的抗氧化劑大多屬于人工合成物,雖然有較強(qiáng)的抗氧化能力,但其潛在的危害使人們?cè)絹?lái)越關(guān)注安全、無(wú)毒的新型天然抗氧化劑[2]。天然抗氧化肽因具有較強(qiáng)抗氧化活性和很高的安全性,已成為天然抗氧化劑的主要來(lái)源,在食品等領(lǐng)域展現(xiàn)出極好的應(yīng)用前景。

三文魚(yú),也叫鮭魚(yú)、大馬哈魚(yú),具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。三文魚(yú)皮是水產(chǎn)加工的副產(chǎn)物,除少數(shù)用于生產(chǎn)魚(yú)粉、作為飼料和肥料外,大多數(shù)被丟棄,造成很大的資源浪費(fèi)[3-4]。三文魚(yú)皮中蛋白含量很高,其中膠原蛋白含量最高可超過(guò)其蛋白質(zhì)總量的80%,較魚(yú)體其它部位的膠原蛋白要高許多,并且具有安全性高,無(wú)瘋牛病及口蹄疫隱患等優(yōu)點(diǎn)[5]。采用生物酶法將三文魚(yú)皮中的膠原蛋白水解,獲得海洋膠原低聚肽,實(shí)現(xiàn)對(duì)三文魚(yú)皮的深度開(kāi)發(fā)利用,能夠避免魚(yú)皮等廢棄物對(duì)環(huán)境的污染,產(chǎn)生應(yīng)有的經(jīng)濟(jì)效益。目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于海洋魚(yú)副產(chǎn)物蛋白來(lái)源抗氧化肽的研究報(bào)道較多。然而,關(guān)于三文魚(yú)皮來(lái)源的抗氧化肽的報(bào)道較少,并且缺乏深入和系統(tǒng)的研究。本研究以三文魚(yú)皮為原料,通過(guò)生物酶解法制備海洋膠原低聚肽,同時(shí)對(duì)海洋膠原低聚肽中的抗氧化肽段進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定,研究海洋膠原低聚肽中抗氧化肽的活性及其結(jié)構(gòu),為三文魚(yú)皮等水產(chǎn)加工副產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三文魚(yú)皮 北京中食海氏生物技術(shù)有限公司;堿性蛋白酶及木瓜蛋白酶 2.4 AU/g,諾維信生物技術(shù)有限公司;乙腈 美國(guó)Fisher公司,色譜純;三氟乙酸 英國(guó)Alfa Aesar公司,分析純;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、桿菌酶、細(xì)胞色素C 美國(guó)Sigma公司,色譜純。

YG30噴霧干燥機(jī) 無(wú)錫市陽(yáng)光干燥設(shè)備廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 普瑞斯機(jī)械有限公司;LC-20AD型高效液相色譜儀、FRC-10A收集器 日本SHIMADZU公司;XBridge BEH130 C18色譜柱 4.6 mm×250 mm,美國(guó)Waters公司;TSK gel G2000 SWXL凝膠過(guò)濾柱 7.8 mm×300 mm,日本TOSOH公司;Q-TOF2正交加速電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀 英國(guó)Micromass公司;model 90多肽合成儀 美國(guó)AAPPTec公司;Voyager DE-Pro MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀 美國(guó)ABI公司;Spectra MR酶標(biāo)儀 美國(guó)DYNEX公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海洋膠原低聚肽的制備 采用本中心前期優(yōu)化好的制備工藝[6]。將三文魚(yú)皮用清水洗凈后,稱(chēng)取600 g用絞肉機(jī)絞碎,加入1 L蒸餾水,用勻漿機(jī)勻漿。90 ℃水浴10 min后,降溫至55 ℃,利用濃度為10%(w/v)的NaOH溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH至8.5,以每克蛋白質(zhì)2500 AU的酶量加入堿性蛋白酶,酶解2 h,不斷加入濃度為10%(w/v)的NaOH溶液,維持pH為8.5,溫度降至50 ℃,以每克蛋白質(zhì)3000 AU的酶量加入木瓜蛋白酶,酶解2 h。酶解結(jié)束后,100 ℃水浴滅酶15 min。冷卻到室溫后,10000×g離心30 min,取上清液。將上清液用截留分子量為1000 u的超濾膜超濾,得到分子量小于1000 u的濾過(guò)液,利用噴霧干燥器進(jìn)行噴霧干燥(進(jìn)口溫度220 ℃,出口溫度200 ℃,轉(zhuǎn)速40 r/min),最終得到100 g海洋膠原低聚肽干粉。

1.2.2 分子量分布測(cè)定 采用高效凝膠過(guò)濾色譜法對(duì)海洋膠原低聚肽的分子量分布進(jìn)行測(cè)定。流動(dòng)相:乙腈∶水∶三氟乙酸,45∶55∶0.1(v/v/v);流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm;柱溫:30 ℃,紫外檢測(cè)器檢測(cè)。稱(chēng)取20.0 mg樣品,溶解于上述流動(dòng)相中,配制成2.0 mg/mL樣品溶液,經(jīng)孔徑0.2 μm聚四氟乙烯過(guò)濾膜過(guò)濾后,用高效液相色譜儀進(jìn)行凝膠過(guò)濾,使用GPC軟件處理數(shù)據(jù)。以乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(分子量189 u)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子量451 u)、桿菌酶(分子量1450 u)、細(xì)胞色素C(分子量12500 u)為肽標(biāo)準(zhǔn)品,配制0.1%(M/V)溶液,過(guò)膜后進(jìn)樣,制作相對(duì)分子量校正曲線[7]。

1.2.3 RP-HPLC分離海洋膠原低聚肽 海洋膠原低聚肽采用分析型C18色譜柱進(jìn)行RP-HPLC分離。色譜條件為:流動(dòng)相A為水(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸),流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)為80%的乙腈和20%的水(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸);梯度洗脫程序:0～10 min,流動(dòng)相B:0%～5%;10～20 min,流動(dòng)相B:5%;20～35 min,流動(dòng)相B:5%～9%;35～45 min,流動(dòng)相B:9%～13%;45～60 min,流動(dòng)相B:13%;60～70 min,流動(dòng)相B:13%～70%;樣品質(zhì)量濃度:10 mg/mL;檢測(cè)波長(zhǎng):UV220 nm;流速:0.6 mL/min;進(jìn)樣體積:100 μL。分管收集主要的組分峰,利用氮吹儀除去收集液中的三氟乙酸、乙腈等有機(jī)溶劑,冷凍干燥備用[8]。

1.2.4 Q-TOF MS測(cè)定分子質(zhì)量及肽序列 采用Q-TOF2正交加速電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,質(zhì)譜條件為:離子化方式:納升電噴霧正離子;霧化氣體:N2;碰撞氣體:Ar;源溫:80 ℃;錐孔電壓:50 V;TOF加速電壓:9.1 kV;MCP檢測(cè)器電壓:2150 V;毛細(xì)管電壓:800 V;MS和MS/MS的質(zhì)量準(zhǔn)確度:0.1 u。首先進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描,得到ESI-MS圖。從ESI-MS圖中選出待測(cè)離子,然后進(jìn)行ESI-MS/MS分析。質(zhì)譜圖經(jīng)Micromass的MaxEnt 3轉(zhuǎn)換后,由Peptide Sequencing推導(dǎo)出肽段序列[8]。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,所有圖中誤差值采用SD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 海洋膠原低聚肽的分子量分布

由四種分子量標(biāo)準(zhǔn)品制作的相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線圖見(jiàn)圖1,方程為:lg MW=6.7895-0.1984t。海洋膠原低聚肽的凝膠色譜圖和分子量分布結(jié)果分別見(jiàn)圖2、表1。由表1可知,海洋膠原低聚肽主要由分子量為1000 u以下(90.79%)的小肽組成,平均分子量為512 u。按氨基酸的平均分子量137 u來(lái)計(jì)算,分子量1000 u以下的組分多是八肽以下的低聚肽和部分游離氨基酸[10]。這表明兩步酶解法能夠充分酶解三文魚(yú)皮膠原蛋白,再加上后續(xù)的超濾等手段,能夠得到低分子量的海洋膠原低聚肽。海洋膠原低聚肽中的肽段分子量主要集中在132～576 u范圍內(nèi)(69.34%),132 u和576 u分別是最小二肽(Gly-Gly)和最大三肽(Trp-Trp-Trp)的分子量,因此這個(gè)分子量范圍內(nèi)的肽段主要是二肽和三肽,這表明海洋膠原低聚肽的主體成分是二肽和三肽。研究表明,二肽和三肽比蛋白質(zhì)和單一氨基酸更易吸收,能夠被人體直接吸收,其吸收利用程度幾乎可達(dá)到100%[7]。并且低聚肽在微量的狀態(tài)下,就能發(fā)揮強(qiáng)大的生理活性[11]。

圖1 相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線圖Fig.1 Molecular weight calibration curve

圖2 海洋膠原低聚肽的凝膠色譜圖Fig.2 Gel chromatogram of MCOP

分子量范圍(u)開(kāi)始時(shí)間(min)結(jié)束時(shí)間(min)峰面積百分比(%,220nm)10000～300014.01816.6280.113000～100016.62819.0109.101000～57619.01020.20617.75576～13220.20623.40069.34<13223.40029.0903.70

肽的抗氧化活性與其分子質(zhì)量及其分布有著密切的關(guān)系,合適的肽鏈長(zhǎng)度能增強(qiáng)抗氧化肽與自由基的相互作用,從而阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[12-13]。Peng等[12]將乳清蛋白酶解液依次通過(guò)不同截留分子量的超濾膜,得到分子量范圍不同的四種組分:>40000,2800～40000,100～2800,<100 u,發(fā)現(xiàn)100～2800 u的組分活性最高。Guo等[13]論證了蜂王漿蛋白水解物中分子質(zhì)量小于1000 u部分的抗氧化活性要強(qiáng)于其他兩部分(1000～3000 u和大于3000 u)。雖然肽的分子量大小與抗氧化活性關(guān)系尚未研究透徹,但是大多研究表明低分子量的肽類(lèi)較為理想。

2.2 海洋膠原低聚肽的體外抗氧化作用

DPPH法是評(píng)價(jià)抗氧化物的自由基清除能力的常用方法,能比較全面地評(píng)價(jià)抗氧化活性[12]。DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基,其乙醇溶液顯紫色,在517 nm處有最大吸收[14]。當(dāng)有供氫能力的抗氧化劑存在時(shí)(如酚類(lèi)),DPPH自由基溶液的顏色變淺,吸光度值變小,根據(jù)吸光度的變化可測(cè)得抗氧化劑的活性。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照,對(duì)海洋膠原低聚肽的DPPH自由基清除能力進(jìn)行了測(cè)定?？箟难岷秃Ｑ竽z原低聚肽的DPPH自由基清除能力分別如圖3、圖4所示。

由圖3可知,在濃度范圍1～25 mg/mL內(nèi),海洋膠原低聚肽對(duì)DPPH自由基清除率隨濃度的增大而不斷增強(qiáng)。在高濃度時(shí),清除率上升趨勢(shì)減緩,這可能是由于低聚肽已經(jīng)趨于飽和[11]。濃度25 mg/mL時(shí),海洋膠原低聚肽的清除率為96.79%±6.52%,半抑制濃度(IC50值)約為8.0 mg/mL。說(shuō)明海洋膠原低聚肽具有供氫能力,從而起到清除DPPH自由基的作用。賈建萍等[15]采用DPPH自由基清除方法對(duì)5種來(lái)源(豬皮、牛皮、驢皮、鱈魚(yú)皮、牛骨)膠原肽的抗氧化活性進(jìn)行比較研究,5種膠原肽的IC50值大小順序?yàn)?驢皮膠原肽(0.63 mg/mL)<鱈魚(yú)皮膠原肽(4.85 mg/mL)<牛皮膠原肽(9.75 mg/mL)<豬皮膠原肽(11.91 mg/mL)<牛骨膠原肽(20.13 mg/mL)。本研究中的海洋膠原低聚肽比驢皮和鱈魚(yú)皮膠原肽清除能力差,但是較牛皮、豬皮、牛骨來(lái)源膠原肽清除能力好一些。抗壞血酸作為一種高效抗氧化劑,具有極強(qiáng)的DPPH自由基清除能力,IC50值約為0.12 mg/mL。

圖3 抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effects of ascorbic acid on DPPH radical

圖4 海洋膠原低聚肽對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effects of MCOP on DPPH radical

2.3 海洋膠原低聚肽的分離純化

海洋膠原低聚肽是由多種肽段組成的低聚肽混合物,為了獲得單一肽段,需要對(duì)海洋膠原低聚肽進(jìn)行分離純化。常用的分離方法有高效液相色譜、凝膠過(guò)濾色譜、離子交換層析、超濾、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。蛋白質(zhì)及肽段分離中常常采用RP-HPLC法,具有操作簡(jiǎn)單、色譜過(guò)程穩(wěn)定、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),并且可作為一種高效的短肽分離手段[16]。海洋膠原低聚肽的分離色譜圖見(jiàn)圖5,收集11個(gè)主要的組分峰,分別命名為1#～11#,各組分峰經(jīng)過(guò)冷凍干燥后,得到干粉狀樣品。

圖5 海洋膠原低聚肽的RP-HPLC分離色譜圖Fig.5 RP-HPLC separation chromatogram of MCOP

2.4 海洋膠原低聚肽分離組分的體外抗氧化作用

濃度為2.5 mg/mL時(shí),海洋膠原低聚肽11個(gè)組分的DPPH自由基清除活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6。通過(guò)對(duì)DPPH自由基清除活性分析可知,海洋膠原低聚肽分離的11個(gè)組分均具有一定DPPH自由基清除活性,組分10#的活性最高(81.47%±7.35%),其次是組分8#(66.45%±5.96%)和組分11#(60.06%±4.69%),組分3#的活性最低(30.03%±6.10%)?？梢?jiàn),經(jīng)過(guò)分離后,11個(gè)組分的活性均比海洋膠原低聚肽高(19.69%±4.23%),其中活性最高的三個(gè)組分的清除率分別是海洋膠原低聚肽的4.1、3.4、3.1倍。

圖6 海洋膠原低聚肽中RP-HPLC組分對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effects of RP-HPLC fraction of MCOP on DPPH radical

以上實(shí)驗(yàn)表明,海洋膠原低聚肽的分離組分均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力,并且所收集的分離組分的抗氧化能力均比總肽要強(qiáng)。這可能由于C18柱能夠?qū)⑾嗤蛳嘟杷缘亩嚯母患谝黄?這些肽段具有很多相同的氨基酸側(cè)鏈,而肽段的抗氧化活性與氨基酸側(cè)鏈上的某些基團(tuán)有關(guān),例如組氨酸的吲哚基團(tuán)具有較強(qiáng)的抗氧化活性[17],最終使得總體抗氧化能力增大。

2.5 海洋膠原低聚肽中抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定

蛋白質(zhì)和多肽序列分析的傳統(tǒng)方法是用氨基酸分析儀或埃德曼降解法,但這些方法存在樣品需要量多、樣品純度要求高、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。近年來(lái),質(zhì)譜在蛋白質(zhì)和多肽領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展很快。其中,Q-TOF質(zhì)譜儀是采用電噴霧離子源(ESI)和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(TOF),通過(guò)對(duì)各個(gè)組分二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子的質(zhì)譜圖解譜得到肽段的氨基酸序列結(jié)構(gòu),樣品用量少,能夠?qū)ξ⒘炕旌隙嚯倪M(jìn)行序列分析及對(duì)新蛋白進(jìn)行序列分析。利用Q-TOF質(zhì)譜儀對(duì)11個(gè)RP-HPLC組分進(jìn)行分析,鑒定出的肽段結(jié)構(gòu)如表2所示。所有肽段的分子量均在1000 u以下,與分子量分布的結(jié)果一致。

濃度為5 mg/mL時(shí),15個(gè)肽段的DPPH自由基清除活性如表2所示。從表2中可知,15個(gè)肽段均具有一定的DPPH自由基清除能力。其中,GR的清除能力最強(qiáng)(33.71%±2.52%),RER(31.65%±2.09%)、AP(31.07%±3.62%)次之,并且這三個(gè)肽段的清除能力均比同等濃度下的海洋膠原低聚肽強(qiáng)(29.96%±2.68%),因此,對(duì)海洋膠原低聚肽的抗氧化活性起到了重要作用。通過(guò)在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站NCBI上進(jìn)行檢索,結(jié)果顯示這三個(gè)肽段是本研究新發(fā)現(xiàn)的三文魚(yú)皮來(lái)源抗氧化肽。其余12個(gè)肽段的DPPH自由基清除能力稍弱一些。

研究表明,抗氧化活性主要來(lái)源于具有抗氧化性的氨基酸,如Cys、His、Trp、Arg、Leu、Phe、Pro、Val、Tyr[18]。GR、RER中均含有Arg,AP中含有Pro,這可能是三種肽段具有抗氧化活性的一個(gè)原因。此外,AP是以Ala為N末端的雙肽,有研究報(bào)道,以Ala為N末端的雙肽比構(gòu)成它們的氨基酸的抗氧化能力強(qiáng)[19]。這可能是因?yàn)锳la在肽段中的合適位點(diǎn)能夠提高抗氧化活性。另外,當(dāng)疏水性氨基酸如Leu、Val、Pro等位于肽的C末端和N末端時(shí),可使該肽與脂肪酸的相互作用增強(qiáng),從而提高其對(duì)脂質(zhì)自由基的捕捉能力[20]。這些可能是AP具有較高活性的原因。除GR、RER、AP外,其余12個(gè)肽段也具有一定的DPPH自由基清除能力,盡管比海洋膠原低聚肽和液相分離組分10#、8#、11#的活性弱,但是肽段間的協(xié)同作用也會(huì)對(duì)整體原料肽及分離組分的活性起到一定的作用[9]。

表2 海洋膠原低聚肽的肽段結(jié)構(gòu)及肽段的DPPH自由基清除作用

3 結(jié)論

通過(guò)兩步酶解法制備出海洋膠原低聚肽,以DPPH自由基清除能力為指標(biāo)對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。其DPPH自由基清除能力呈顯著的量效關(guān)系,IC50值約為8.0 mg/mL。經(jīng)RP-HPLC分離純化后,利用Q-TOF質(zhì)譜儀對(duì)收集的11個(gè)組分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定,鑒定出的15個(gè)肽段均具有一定的DPPH自由基清除能力。其中GR、RER、AP的DPPH自由基清除能力比海洋膠原低聚肽高,是具有較高抗氧化活性的肽段,并且都是本研究新發(fā)現(xiàn)的三文魚(yú)皮來(lái)源抗氧化肽。本研究明確了海洋膠原低聚肽的抗氧化活性,并對(duì)其含有的抗氧化肽進(jìn)行了分離和結(jié)構(gòu)鑒定,為海洋膠原低聚肽的開(kāi)發(fā)和利用提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Separation and identification of antioxidant peptides derived from marine collagen oligopeptides

LIU Wen-ying,XU Shan-shan,GU Rui-zeng,LU Jun,PAN Xing-chang,CAI Mu-yi*

(Beijing Engineering Research Center of Protein and Functional Peptides,China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100015,China)

In order to investigate the activity and structure of antioxidant peptides derived from marine collagen oligopeptides(MCOP),MCOP was prepared by the method of two-step enzymolysis. On the basis of analysis of molecular weight distribution,the antioxidant activity of MCOP was determined using the method of DPPH radical scavenging activity as the indicator. The results showed that the major molecular weight of MCOP was less than 1000 u(90.79%),and small peptides with a molecular weight range of 132～576 u were dominated. The half-inhibition concentration(IC50)of DPPH radical scavenging activity was approximately 8.0 mg/mL. Then,MCOP was separated and purified by reversed phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC)and the DPPH radical scavenging activity of 11 fractions collected was assayed. The results indicated that all the fractions had the effect higher than MCOP. Finally,the identification of peptides in the 11 fractions was performed on the Q-TOF mass spectrometer and the DPPH radical scavenging activity of the 15 identified peptides was investigated. The results indicated that all the peptides exhibited DPPH radical scavenging activity and Gly-Arg(GR),Arg-Glu-Arg(RER)and Ala-Pro(AP)showed stronger activities than MCOP. GR,RER and AP were potent antioxidant peptides. This study provides certain theoretical basis for the development and utilization of MCOP.

marine collagen oligopeptides;antioxidant peptides;molecular weight distribution;separation and purification;structural identification

2016-08-16

劉文穎(1984-)，女，碩士，工程師，研究方向：食源性低聚肽研究，E-mail：wenyingliu888@126.com。

*通訊作者:蔡木易(1962-)，男，教授級(jí)高工，研究方向：功能肽研究與產(chǎn)業(yè)化，E-mail：caimuyi@vip.sina.com。

十三五國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0400604)；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(2013AA102205-02)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)06-0101-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.010