胰腺癌中PcG相關蛋白RYBP的表達及臨床意義

羅 偉，朱小年，譚盛葵,

·論 著·

胰腺癌中PcG相關蛋白RYBP的表達及臨床意義

羅 偉1，朱小年2，譚盛葵1,2

目的 探討PcG相關蛋白RYBP在胰腺癌中的表達及其臨床意義。方法 采用免疫組化法檢測51例胰腺癌及對應癌旁組織中RYBP的表達，分析其表達與胰腺癌臨床病理特征的關系。Kaplan-Meier法分析RYBP表達與胰腺癌患者術后生存時間的關系。結果 RYBP在胰腺癌中的陽性率(31.4%，16/51)明顯低于癌旁組織(66.7%，34/51)，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。RYBP表達與患者性別、年齡、吸煙、飲酒、腫瘤數(shù)目、有無淋巴結轉(zhuǎn)移和血清CA199水平無明顯相關性(P>0.05)，與腫瘤直徑及腫瘤病理分級有相關性(P<0.05)。Kaplan-Meier法分析顯示RYBP陽性組患者的總生存率明顯高于陰性組(P<0.05)。結論 PcG相關蛋白RYBP在胰腺癌中低表達，RYBP表達降低可能與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關。

胰腺腫瘤；RYBP；細胞凋亡

PcG蛋白是一類在轉(zhuǎn)錄過程發(fā)揮表觀遺傳調(diào)控作用的蛋白，廣泛參與細胞生長、發(fā)育、增殖、分化以及腫瘤發(fā)生等重要過程。RYBP作為PcG蛋白家族成員，參與多梳蛋白抑制復合物(PRC1)的組成，在個體發(fā)育、抑制基因轉(zhuǎn)錄、細胞凋亡以及調(diào)控表觀遺傳等方面發(fā)揮重要作用[1-2]。近年研究表明，RYBP與人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。目前有關RYBP與胰腺癌的關系尚未見報道，本文應用免疫組化法檢測RYBP在胰腺癌和癌旁組織中的表達，分析其表達與胰腺癌臨床病理特征及預后的關系，為尋找胰腺癌早期診斷及判斷預后的分子標志物及分子靶向治療的有效靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科2007～2013年存檔的配對胰腺癌及癌旁組織石蠟標本51例，臨床和病理診斷均為胰腺癌，選取的癌旁組織距癌灶距離>2 cm。所有患者均在本院行手術治療，術前均未行放、化療，且有完整的臨床資料。所有標本獲取均征得患者及家屬同意，并通過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 免疫組化 將收集的蠟塊4 μm厚切片，采用免疫組化SP兩步法檢測RYBP的表達，具體步驟如下：切片經(jīng)60 ℃烤片1 h后經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，置于EDTA緩沖液(pH 8.0)中高壓加熱抗原修復3 min，浸泡于3%過氧化氫溶液15 min去除內(nèi)源性過氧化酶，馬血清室溫封閉30 min，滴加RYBP一抗(購于美國Proteintech公司，工作濃度1 ∶100)，37 ℃溫箱孵育1 h，加二抗酶標抗小鼠/兔IgG聚合物(購自福州邁新公司)，37 ℃溫箱孵育30 min，DAB顯色，鏡下觀察3～5 min至顯色合適為止。蘇木精復染，自來水沖洗返藍，最后脫水、透明、固定。

1.3 結果判定 在高倍鏡下隨機選取5個不同的視野，觀察細胞染色強度及計數(shù)陽性細胞數(shù)所占細胞總數(shù)百分比，評分標準：(1)按染色強度記分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)按陽性細胞所占百分比記分：陰性為0分，陽性細胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。最后將兩項得分結果相乘：總分≤4分為陰性，>4分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。臨床病理特征與RYBP表達的相關性采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法、單因素及多因素Cox回歸分析，組間生存曲線采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RYBP在胰腺癌和癌旁組織中的表達 RYBP在胰腺癌組織中呈陰性；癌旁組織中呈陽性，陽性部位主要位于細胞質(zhì)和細胞膜(圖1)。RYBP在胰腺癌中表達明顯低于癌旁組織。RYBP在胰腺癌和癌旁組織中的陽性率分別為31.4%(16/51)和66.7%(34/51)，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.925，P<0.05，表1)。

圖1 RYBP在胰腺癌癌旁組織中呈陽性，SP兩步法

表1 RYBP在胰腺癌和癌旁組織中的表達

2.2 RYBP表達與胰腺癌臨床病理特征的關系 胰腺癌組織中RYBP表達與患者性別、年齡、吸煙、飲酒、腫瘤數(shù)目、有無淋巴結轉(zhuǎn)移和血清CA199水平無明顯相關性(P>0.05)，與腫瘤直徑及腫瘤病理分級有相關性(P<0.05，表2)。

2.3 RYBP表達與胰腺癌患者預后的關系 對51例獲得隨訪資料的胰腺癌患者采用Kaplan-Meier法進行生存分析，結果顯示：RYBP蛋白高表達組患者的總生存率明顯高于低表達組，用Log-rank進行組間生存率檢驗結果顯示：RYBP蛋白低表達與胰腺癌患者預后不良相關(χ2=6.907，P=0.008 6，圖2)。經(jīng)Cox比例風險回歸模型分析，單因素及多因素分析均顯示RYBP蛋白表達、病理分級與患者預后相關(P<0.05，表3)，說明RYBP表達是影響胰腺癌患者預后的獨立危險因素(HR=0.410，95%CI：0.170～0.986，P=0.046)，病理分級也是影響胰腺癌患者預后的獨立危險因素(HR=3.697，95%CI：1.384～9.879，P=0.009)。

3 討論

表2 RYBP表達與胰腺癌臨床病理特征的關系

圖2 Kaplan-Meier法分析RYBP表達對胰腺癌患者術后生存時間的影響

隨著發(fā)病率和病死率的逐年增加，癌癥已經(jīng)成為困擾全球的重大公共衛(wèi)生問題[3-4]。胰腺癌作為我國常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已成為癌癥相關死亡前10位的腫瘤。胰腺癌因其早期確診率不高，發(fā)現(xiàn)時多數(shù)已處于中晚期，預后極差，全球范圍內(nèi)胰腺癌病死率高居第4位[5]，因此尋找新的胰腺癌早期診斷、靶向治療以及判斷預后的生物學標志物迫在眉睫。

表3 胰腺癌預后Cox模型分析

PcG相關蛋白RYBP是最早于1999年利用酵母雙雜交技術從小鼠中篩選而出，由228個氨基酸殘基組成的一個具有鋅指結構域的堿性蛋白質(zhì)[6]。人類RYBP蛋白在細胞質(zhì)和細胞核中均有分布，在淋巴組織和胎盤內(nèi)表達較高。天然狀態(tài)下，RYBP處于非折疊狀態(tài)，當與蛋白質(zhì)或DNA相互作用時，其構象改變，蛋白質(zhì)折疊[7]。RYBP還是經(jīng)典的泛素結合蛋白，其自身被單泛素化，在個體發(fā)育過程中廣泛表達[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)RYBP與人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切。RYBP在腫瘤中的表達高低存在差異。有研究表明RYBP在肝癌、肺癌、子宮頸癌、前列腺癌等組織中低表達并與患者預后不良相關[9-13]。在肝癌組織中RYBP表達明顯低于癌旁組織，并可作為肝癌患者預后不良的獨立因素。在非小細胞肺癌組織中RYBP蛋白及mRNA水平明顯降低，且與患者預后不良密切相關，過表達RYBP可抑制細胞存活，誘導細胞凋亡，同時增加非小細胞肺癌細胞對化療藥物的敏感性，相反敲低RYBP的表達后這些現(xiàn)象發(fā)生逆轉(zhuǎn)[11]。子宮頸癌中RYBP表達降低與患者放、化療后存活率降低密切相關。Sanchez-Beato等[14]發(fā)現(xiàn)RYBP在部分腫瘤中表達升高，主要表現(xiàn)在垂體腺瘤、霍奇金淋巴瘤、T細胞淋巴瘤和少突膠質(zhì)瘤。本實驗通過觀察胰腺癌及癌旁組織中RYBP的表達，進一步明確其在腫瘤組織中的表達。本組實驗結果顯示：51例胰腺癌組織中RYBP陽性率僅為31.4%(16/51)，癌旁組織中RYBP陽性率高達66.7%(34/51)，組間比較差異有顯著性(P<0.05)，支持RYBP在胰腺癌中低表達的結論。

增殖、凋亡是正常及腫瘤細胞重要的生物學行為，RYBP可與細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)多種蛋白相互作用，調(diào)控細胞增殖、凋亡。當前RYBP介導的凋亡已成為研究熱點。酵母雙雜交分析發(fā)現(xiàn)RYBP可與凋亡蛋白(apoptin)相互作用，凋亡蛋白突變導致其與RYBP結合減少，從而誘導細胞凋亡時間延遲，提示RYBP可通過凋亡蛋白調(diào)控細胞凋亡[15]。RYBP可與細胞質(zhì)中的FADD、Caspase 8/10前體及細胞核中的DEDD相互作用，也可在細胞膜上通過增強CD95-FADD-Caspase 8復合體的形成，促進死亡受體和DEDD介導的細胞凋亡作用。最近Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，RYBP表達與肝細胞癌患者腫瘤病理分級及腫瘤直徑相關，同時在體外肝癌細胞株中過表達RYBP后肝癌細胞侵襲能力和凋亡增加，相反在用siRNA干擾RYBP的表達后該現(xiàn)象又發(fā)生逆轉(zhuǎn)，說明RYBP調(diào)控的細胞凋亡與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密不可分。本組實驗發(fā)現(xiàn)，RYBP蛋白表達在不同腫瘤直徑、病理分級間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明RYBP蛋白表達與胰腺癌腫瘤直徑及病理分級具有相關性，提示RYBP介導的細胞凋亡可能在胰腺癌中發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，RYBP蛋白低表達與一些腫瘤患者的預后不良和(或)低生存率呈正相關[9-13]，這與本組實驗結果一致。本組實驗通過長期隨訪，進一步探討RYBP蛋白表達與胰腺癌患者的遠期生存率之間的關系。隨訪資料經(jīng)Kaplan-Meier分析、單因素Cox回歸及多因素Cox回歸分析均顯示RYBP蛋白表達與胰腺癌的預后有關，RYBP蛋白低表達提示患者預后差，因此RYBP蛋白表達可作為判斷胰腺癌預后的指標之一。另外，單因素及多因素Cox回歸分析顯示病理分級與胰腺癌預后相關，說明病理分級是影響胰腺癌預后的重要因素。

綜上，RYBP與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展及患者預后密切相關，RYBP能否成為新的腫瘤標志物和分子靶向治療的有效靶點，值得更進一步探討證實。

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Expression of PcG related protein RYBP in pancreatic carcinoma and its clinical significance

LUO Wei1, ZHU Xiao-nian2, TAN Sheng-kui1,2

(1DepartmentofHepatobiliarySurgery,theAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541000,China;2SchoolofPublicHealth,GuilinMedicalUniversity,Guilin541000,China)

Purpose To investigate the expression and clinical significance of RINGI and YYI binding protein (RYBP) in pancreatic carcinoma (PC). Methods RYBP expression was detected in 51 cases of PC tissues and paired adjacent non-tumor tissues by immunohistochemistry. The correlation between RYBP expression and the survival time of PC patients after surgery was analyzed by Kaplan-Meier method. Results Compared to the expression in adjacent non-tumor tissues, RYBP was significantly lower expressed in PC tissues (P<0.05). In addition, RYBP expression had a significant correlation with tumor diameter and tumor staging of patients (P<0.05), but no significant correlation with other characteristics of patients, such as gender, age, smoking, alcohol intake, tumor number, metastasis or CA199 level (P>0.05). The survival analysis showed that the survival time of PC patients with positive expression of RYBP was significantly longer than patients with negative expression of RYBP (P<0.05). Conclusion RYBP is significantly lower expressed in PC tissues, which might be involved in the pathogenesis of PC.

pancreatic neoplasms; RYBP; cell apoptosis

時間：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1014.006.html

國家自然科學基金(81460515)

1桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院肝膽外科，桂林 5410002桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，桂林 541000

羅 偉，男，碩士研究生。E-mail: luoweidoctor@163.com 譚盛葵，男，教授，碩士生導師，通訊作者。E-mail: sktan2008@sina.cn

R 735.9

A

1001-7399(2017)02-0125-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.002

接受日期：2016-12-16