4種人腎細(xì)胞癌原位移植裸鼠模型建立方法的比較

趙佩佩，陳曉靜，王巧玲，趙 雪，趙亞男，劉培峰，戴慧莉

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院腎臟科，上海200127；

2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海200127

4種人腎細(xì)胞癌原位移植裸鼠模型建立方法的比較

趙佩佩1,2，陳曉靜2，王巧玲1,2，趙 雪2，趙亞男2，劉培峰2，戴慧莉1,2

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院腎臟科，上海200127；

2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海200127

背景與目的：腎細(xì)胞癌是最常見的腎臟惡性腫瘤，起病隱匿，惡性程度高。研究旨在建立成功率高、穩(wěn)定的人腎細(xì)胞癌原位動(dòng)物造模方法。方法：采用人腎細(xì)胞癌細(xì)胞(786-0、ACHN)進(jìn)行細(xì)胞懸液原位注射法、皮下成瘤后引瘤原代細(xì)胞懸液原位注射法、皮下成瘤后引瘤組織塊原位移植腎包膜下法及皮下成瘤后引瘤組織塊原位移植腎周筋膜內(nèi)法建立原位移植裸鼠模型，采用PET/CT、H-E染色、免疫組織化學(xué)染色及血清生化檢測(cè)等手段觀察成瘤率及腫瘤生長(zhǎng)情況，評(píng)估4種方法的建模效果。結(jié)果：人腎細(xì)胞癌皮下移植瘤裸鼠模型，ACHN組成瘤率(90%)高于786-0組(30%)；人腎細(xì)胞癌原位移植裸鼠模型，786-0原位注射組、ACHN原位注射組、ACHN皮下移植瘤引瘤后原代細(xì)胞原位注射組、ACHN組織塊腎包膜下包埋組和ACHN組織塊腎周筋膜內(nèi)包埋組的成瘤率分別為33%、80%、90%、100%和20%，其中以ACHN皮下成瘤后引瘤組織塊原位移植腎包膜下法成瘤率最高，影像學(xué)及病理組織學(xué)檢查結(jié)果顯示符合低分化腎細(xì)胞癌。結(jié)論：成功建立4種人腎細(xì)胞癌原位移植裸鼠模型，其中以ACHN皮下成瘤后引瘤組織塊原位移植腎包膜下法成瘤效果最佳，為腎細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制及靶向治療的進(jìn)一步研究提供理想的動(dòng)物模型。

腎細(xì)胞癌；裸鼠；原位移植；PET/CT；ACHN細(xì)胞

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)作為腎臟最常見腫瘤，占成人惡性腫瘤的3%～4%，發(fā)病率以每年1.6%的速度增長(zhǎng)。腎細(xì)胞癌起病隱匿［1］，約30%的患者在初診及手術(shù)時(shí)即已出現(xiàn)局部進(jìn)展或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，對(duì)放化療不敏感，預(yù)后較差［2］。為進(jìn)一步研究腎癌發(fā)病機(jī)制，改善臨床治療效果，腎癌動(dòng)物模型的構(gòu)建是十分必要。

前期研究表明，腎包膜下原位注射腎癌細(xì)胞是最常用的原位腎癌建模方法［3-6］，但此法易發(fā)生細(xì)胞溢出，造成嚴(yán)重腹水，影響建模效果。后研究人員開發(fā)了腫瘤組織塊包埋種植法，并成功在兔中建立了腎癌原位模型［7］，但其移植癌病理分型顯示為鱗癌，與人腎癌的常見的病理類型不一致。在此基礎(chǔ)上，我們采用BALB/c裸鼠對(duì)上述方法進(jìn)行改進(jìn)，并新增兩種建模方法(引瘤后原代細(xì)胞注射法、引瘤后組織塊腎周筋膜法)建立了人腎細(xì)胞癌原位動(dòng)物模型，后對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行影像學(xué)檢查［8-9］和組織病理學(xué)檢查［10-12］，評(píng)價(jià)4種方法的建模效果。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c裸鼠，4周齡，雄性，體質(zhì)量10～15 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。受試動(dòng)物飼養(yǎng)于上海市仁濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)無(wú)菌獨(dú)立送風(fēng)IVC籠中，每籠5只。飼以專門為小鼠配制的消毒飼料，自由飲用純凈水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度保持在約23 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人腎細(xì)胞癌ACHN和786-0細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)的DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)。細(xì)胞均培養(yǎng)于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中，每2～3 d傳代1次。

1.3 主要試劑

異氟烷購(gòu)自中國(guó)深圳市瑞沃德公司，水合氯醛購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，4%多聚甲醛購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，30%過(guò)氧化氫溶液購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，牛白蛋白(Albumin from bovine serum，BSA)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，DAB染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Dako公司，Vimentin兔單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，抗細(xì)胞角蛋白(cytokeratin 8，CK8)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，豬抗兔IgG/HRP二抗、兔抗鼠免疫球蛋白/HRP二抗購(gòu)自基因科技(上海)股份有限公司。

1.4 人腎細(xì)胞癌皮下移植裸鼠模型的建立

在無(wú)菌條件下將貼壁培養(yǎng)的人腎細(xì)胞癌細(xì)胞系786-0和ACHN細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液，細(xì)胞活力測(cè)定大于95%，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整兩種細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度為5×107個(gè)/mL，將上述細(xì)胞懸液注射至裸鼠左側(cè)和右側(cè)背部皮下，每側(cè)每只0.1 mL(即每只5×106個(gè)細(xì)胞)，制成皮下移植瘤，每種細(xì)胞系注射10只裸鼠。

1.5 人腎細(xì)胞癌原位移植裸鼠模型的建立

1.5.1 人腎癌細(xì)胞系細(xì)胞懸液原位注射法

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化，重懸。進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定和細(xì)胞計(jì)數(shù)，后用0.9%氯化鈉溶液調(diào)整活細(xì)胞密度至5×107個(gè)/mL。

裸鼠采用3.5%水合氯醛溶液腹腔注射(0.01 mL/g)進(jìn)行麻醉，后固定裸鼠并消毒。沿腹正中線剪開皮膚與腹膜，裸露右側(cè)腎臟。用1 mL無(wú)菌注射器吸取調(diào)整好細(xì)胞活力和濃度的細(xì)胞懸液，從腎下極進(jìn)針，穿過(guò)腎實(shí)質(zhì)直到腎上極包膜下，注射成功的標(biāo)志為腎實(shí)質(zhì)腫脹，腎包膜顏色變白，注射劑量為0.01 mL/只(即每只5×105個(gè)細(xì)胞)，每種細(xì)胞系注射10只裸鼠。術(shù)后縫合皮膚后置于SPF條件下繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.5.2 皮下成瘤后引瘤原代細(xì)胞懸液原位注射法

采用脫頸椎法處死1.4中荷瘤裸鼠，在無(wú)菌條件下取出瘤體，去除結(jié)締組織，用眼科剪反復(fù)剪切，剪碎后用200目細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾后得到單個(gè)細(xì)胞懸液，將獲得的單個(gè)細(xì)胞懸液置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)［13］。待細(xì)胞生長(zhǎng)至足夠數(shù)量時(shí)，按1.5.1中方法收集細(xì)胞，調(diào)整活細(xì)胞密度至5×107個(gè)/mL。

按1.5.1中方法將上述細(xì)胞懸液注射至裸鼠右腎包膜下，共注射10只裸鼠。

1.5.3 皮下成瘤后引瘤組織塊原位移植腎包膜下法

采用脫頸椎法處死1.4中荷瘤裸鼠，在無(wú)菌條件下剝離瘤體，去除結(jié)締組織、凝血塊等，含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的0.9%氯化鈉溶液沖洗，使用眼科剪及手術(shù)刀片將腫瘤組織切成1 mm×1 mm×1 mm大小碎塊，置于含雙抗的0.9%氯化鈉溶液中待用。

按1.5.1中方法暴露裸鼠右側(cè)腎臟。在腎包膜上開2～3 mm的切口，后將處理的RCC組織塊經(jīng)切口放入腎包膜下，并注意遠(yuǎn)離切口。后取腎周脂肪組織覆蓋切口，加壓縫合。術(shù)后縫合皮膚后置于SPF條件下繼續(xù)飼養(yǎng)。共處理10只裸鼠。

1.5.4 皮下成瘤后引瘤組織塊原位移植腎周筋膜內(nèi)法

同1.5.3準(zhǔn)備移植用腫瘤組織塊，按1.5.1中方法暴露裸鼠右側(cè)腎臟。切開腎周筋膜2～3 mm，夾取腫瘤組織塊放入腹膜后腎窩，縫合腎周筋膜和皮膚后置于SPF條件下繼續(xù)飼養(yǎng)。共處理10只裸鼠。

1.6 腎細(xì)胞癌原位裸鼠模型成瘤性檢測(cè)

1.6.1 體質(zhì)量監(jiān)測(cè)

自原位接種日起每周對(duì)裸鼠稱重，連續(xù)監(jiān)測(cè)6周，觀察裸鼠體質(zhì)量變化。

1.6.2 影像學(xué)檢測(cè)

從原位接種后第2周起，每隔7 d隨機(jī)選取各實(shí)驗(yàn)組中2只裸鼠行PET/CT掃描，評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)情況，連續(xù)檢測(cè)4周。

1.6.3 組織學(xué)檢查

從建模后第2周開始，每周每組隨機(jī)處死1只裸鼠，解剖剝離其腎臟、肝臟、肺、脾臟、心臟等主要器官，觀察器官的解剖學(xué)變化。并將上述器官用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色(H-E染色)：脫蠟、復(fù)水后用蘇木精染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)，中性樹膠封片后在光鏡下觀察拍照；免疫組織化學(xué)染色：脫蠟、復(fù)水、3%過(guò)氧化氫溶液浸泡、抗原修復(fù)、1%BSA封閉后，用一抗Vimentin(1∶100)、CK8(1∶50)4 ℃溫育過(guò)夜，隨后用HRP標(biāo)記的二抗溫育，DAB顯色，中性樹膠封片后，在光鏡下觀察拍照。

1.6.4 血清采集與檢測(cè)

采集各組裸鼠血樣，室溫下靜置30 min，后經(jīng)1 174×g離心10 min，離心所得上清檢測(cè)肌酐、尿素氮、尿酸、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、白蛋白、球蛋白和總膽紅素等血液學(xué)指標(biāo)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism軟件(Graphpad Software)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采取t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。比較不同組間差異來(lái)確定不同處理方式下腎細(xì)胞癌成瘤率和轉(zhuǎn)移率，評(píng)判幾種建模方法的效果。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物模型生長(zhǎng)情況

2.1.1 腎細(xì)胞癌皮下移植裸鼠模型

皮下成瘤時(shí)間4周，4周內(nèi)786-0組和ACHN組在皮下接種后無(wú)死亡。皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，786-0組成瘤率為30%(3/10)，ACHN組成瘤率為90%(9/10)。因786-0組皮下移植成瘤率較低，在建立腎細(xì)胞癌原位移植裸鼠模型時(shí)，引瘤后原代細(xì)胞懸液原位注射法、組織塊原位移植腎包膜下法和腎周筋膜內(nèi)法中所用瘤塊均為采用ACHN細(xì)胞系進(jìn)行皮下移植瘤接種所得。

2.1.2 腎細(xì)胞癌原位移植裸鼠模型

2.1.2.1 腎癌細(xì)胞系(786-0和ACHN)細(xì)胞懸液原位注射法

兩種細(xì)胞系(786-0和ACHN)的20只裸鼠均安全度過(guò)手術(shù)期。自原位接種日起連續(xù)觀察6周，786-0原位注射組在建模后第2周有1只裸鼠死亡，其余9只裸鼠成瘤率為33%(3/9)；ACHN原位注射組裸鼠成瘤率為80%(8/10)。

2.1.2.2 皮下成瘤后引瘤原代細(xì)胞懸液原位注射法

10只裸鼠均安全度過(guò)手術(shù)期。自原位接種日起連續(xù)觀察6周，無(wú)裸鼠死亡，成瘤率為90%(9/10)。

2.1.2.3 皮下成瘤后引瘤組織塊原位移植腎包膜下法

該組裸鼠中有1只在手術(shù)后立即死亡，余裸鼠安全度過(guò)手術(shù)期。自原位接種日起連續(xù)觀察6周，裸鼠無(wú)死亡，成瘤率為100%(9/9)。

2.1.2.4 皮下成瘤后引瘤組織塊原位移植腎周筋膜內(nèi)法

該組裸鼠均安全度過(guò)手術(shù)期。自原位接種日起連續(xù)觀察6周，無(wú)裸鼠死亡，成瘤率為20%(2/10)。

2.2 體質(zhì)量變化情況

造模初期，裸鼠體質(zhì)量隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)。但隨著腎臟原位腫瘤的生長(zhǎng)，ACHN組織塊腎包膜下包埋組、ACHN原位注射組和ACHN皮下移植瘤引瘤后原位注射組裸鼠的體質(zhì)量在造模14天后呈下降趨勢(shì)；786-0原位注射組在造模21天后呈下降趨勢(shì)。而ACHN組織塊腎周筋膜內(nèi)包埋組裸鼠的體質(zhì)量未見明顯下降(圖1)。

2.3 PET/CT觀察與評(píng)估

建模后第14天，各組PET/CT成像均未見明顯18F-FDG異常濃聚影。造模后第21天，ACHN原位注射組、ACHN皮下移植瘤引瘤后原位注射組和ACHN組織塊腎包膜下包埋組PET/CT成像可見在右腎出現(xiàn)高于左腎的異常濃聚影。建模后第28天，786-0原位注射組、ACHN原位注射組、ACHN皮下移植瘤引瘤后原位注射組和ACHN組織塊腎包膜下包埋組PET/CT成像可見右腎出現(xiàn)高于左腎的異常濃聚影。ACHN組織塊腎周筋膜內(nèi)包埋組PET/CT成像雙腎未見明顯差異(圖2)。

圖 1 腎細(xì)胞癌原位移植裸鼠模型對(duì)裸鼠體質(zhì)量的影響Fig. 1 The weight of nude mice of RCC orthotopic models

圖 2 建模后第28天5組裸鼠的PET/CT成像圖Fig. 2 PET/CT images of mice models at day 28 after orthotopic implantation

2.4 裸鼠腎臟解剖結(jié)果

建模后第14天，解剖裸鼠后發(fā)現(xiàn)ACHN原位注射組、ACHN皮下移植瘤引瘤后原代細(xì)胞懸液原位注射組和ACHN組織塊腎包膜下包埋組的右側(cè)腎臟出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤結(jié)節(jié)、質(zhì)韌、色白、邊緣不規(guī)則，左側(cè)腎臟未見明顯異常。786-0原位注射組和ACHN組織塊腎周筋膜內(nèi)包埋組的右側(cè)腎臟未見明顯結(jié)節(jié)，與左側(cè)腎臟無(wú)肉眼可見差異。5組裸鼠的小腸、肝臟、肺等無(wú)明顯肉眼可見轉(zhuǎn)移灶。建模后第21、28天(圖3)，除ACHN組織塊腎周筋膜內(nèi)包埋組外，其余實(shí)驗(yàn)組裸鼠的右側(cè)腎臟均可見色白、邊緣不規(guī)則的腫瘤灶，左側(cè)腎臟并未見明顯異常，裸鼠的小腸、肝臟、肺等無(wú)明顯肉眼可見轉(zhuǎn)移灶。腎癌細(xì)胞系細(xì)胞懸液原位注射組中，ACHN細(xì)胞系較786-0細(xì)胞系成瘤時(shí)間更短，成瘤效果較好。

圖 3 建模后第28天5組裸鼠模型的腎臟解剖圖Fig. 3 Photographs of the resected kidneys of mice models at day 28 after orthotopic implantation

2.5 組織學(xué)檢測(cè)

2.5.1 H-E染色檢測(cè)

建模后，從第14天起，每周每組隨機(jī)選取1只裸鼠，剝離其心、肝、脾、肺和腎等主要器官，樣本石蠟包埋切片行H-E染色。建模后第14天，光鏡下可見ACHN原位注射組、ACHN皮下移植瘤引瘤后原位注射組和ACHN組織塊腎包膜下包埋組右側(cè)腎臟組織出現(xiàn)癌癥病灶，其余兩組左右側(cè)腎臟未見明顯差異。建模后第28天，786-0原位注射組、ACHN原位注射組、ACHN皮下移植瘤引瘤后原位注射組和ACHN組織塊腎包膜下包埋組右側(cè)腎臟組織均出現(xiàn)異常癌癥病灶。癌細(xì)胞體積較大，形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)透明。細(xì)胞核染色質(zhì)多呈粗顆粒狀，形態(tài)不一，可見病理性核分裂象。ACHN組織塊腎周筋膜內(nèi)包埋組右側(cè)腎臟組織在建模后第14、21和28天均未見癌癥病灶。786-0原位注射組、ACHN組織塊腎包膜下包埋組的部分小鼠肝臟可見肝細(xì)胞壞死、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。其余各組裸鼠的肝臟、肺、脾臟、心臟組織未見明顯轉(zhuǎn)移性腫瘤灶及炎性壞死灶(圖4)。

2.5.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

從建模后第14天起，每周每組隨機(jī)選取1只裸鼠，解剖其心、肝、脾、肺和腎等器官做石蠟包埋切片，行Vimentin、CK8染色。結(jié)果顯示，建模后第14天，除ACHN組織塊腎包膜下包埋組外，余各組右腎與左腎無(wú)明顯差異，呈Vimentin(-)和CK8(-)；建模后第21天，僅ACHN原位注射組、ACHN皮下移植瘤引瘤后原位注射組和ACHN組織塊腎包膜下包埋組右側(cè)腎臟組織呈Vimentin(+)和CK8(+)，3組裸鼠左側(cè)腎臟Vimentin和CK8染色均為陰性表達(dá)；建模后第28天，除ACHN組織塊腎周筋膜內(nèi)包埋組外，其余各組裸鼠右側(cè)腎臟組織呈Vimentin(+)和CK8(+)，左側(cè)腎臟組織呈Vimentin(-)和CK8(-)(圖5)。

2.6 血清學(xué)檢測(cè)

血清生化檢測(cè)結(jié)果示建模后第21天，ACHN組織塊腎包膜下包埋組谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶異常升高，與正常裸鼠相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；786-0原位注射組谷草轉(zhuǎn)氨酶異常，與正常裸鼠相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。建模后28天，786-0原位注射組、ACHN組織塊腎包膜下包埋組的谷草轉(zhuǎn)氨酶異常升高，ACHN組織塊腎包膜下包埋組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶異常升高，與正常裸鼠相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其余3組裸鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶未見異常增高。5組裸鼠的肌酐、尿素氮、尿酸、總蛋白、白蛋白、球蛋白和總膽紅素未見明顯異常(圖6)。

圖 4 建模后第28天5組裸鼠模型的腎臟、肝臟、肺、脾臟和心臟Fig. 4 H-E staining of the resected kidneys, liver, lung, spleen and heart of mice models at day 28 after orthotopic implantation

圖 5 建模后第28天5組裸鼠模型雙側(cè)腎臟的免疫組織化學(xué)染色Fig. 5 Immunohistochemistry of the resected kidneys of mice models at day 28 after orthotopic implantation

圖 6 建模后第0、14、21和28天5組裸鼠模型的血液生化指標(biāo)Fig. 6 Blood biochemistry analysis of mice models at different time points of 0, 14, 21 and 28 days

3 討 論

腎細(xì)胞癌為泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率以每十年2%～3%的概率增長(zhǎng)，加之其起病隱匿，惡性程度高，約50%的患者在首診、手術(shù)切除后發(fā)生轉(zhuǎn)移［14］。因此，深入研究腎細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制，開發(fā)有效的臨床治療方法迫在眉睫，而建立良好的動(dòng)物模型是進(jìn)行這些研究的基礎(chǔ)和保障。

腫瘤動(dòng)物模型建立的成功與否，主要取決于建模所用細(xì)胞系的侵襲性及所采用的建模方法。常用的腎癌細(xì)胞系包括：786-0細(xì)胞系［3,15］、ACHN細(xì)胞系［5,16］和RENCA細(xì)胞系［17］等，在本研究中，我們采用了786-0細(xì)胞系和ACHN細(xì)胞系。786-0細(xì)胞系來(lái)源于一個(gè)原發(fā)性透明細(xì)胞癌患者，而ACHN細(xì)胞系源自一腎腺癌伴癌性胸水患者，其惡性程度更高，具有更強(qiáng)侵襲性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，ACHN細(xì)胞的皮下成瘤率遠(yuǎn)高于786-0細(xì)胞。

與常用的皮下移植瘤模型相比，原位移植瘤模型能更好的模擬腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)尤其是轉(zhuǎn)移情況，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值更高。目前在結(jié)直腸癌等腫瘤的研究中，已經(jīng)開始使用原位移植動(dòng)物模型進(jìn)行癌癥發(fā)病機(jī)制和治療方法的研究。在腎癌研究中，譚曉潔等［18］利用手術(shù)切除的患者腫瘤組織塊，進(jìn)行了人腎細(xì)胞癌原位移植裸鼠模型的構(gòu)建。本研究綜合前期研究結(jié)果，對(duì)已有建模方法進(jìn)行總結(jié)和改進(jìn)，建立了4種人腎細(xì)胞癌原位移植裸鼠模型。成瘤率由高到低依次為皮下成瘤后引瘤組織塊原位移植腎包膜下法、皮下成瘤后引瘤原代細(xì)胞懸液原位注射法、ACHN原位注射法、786-0原位注射法和皮下成瘤后引瘤組織塊原位移植腎周筋膜內(nèi)法。腎癌組織塊移植由于保留了腎癌組織的完整結(jié)構(gòu)，使其中生長(zhǎng)因子、血管生成因子及各種刺激因子得以保留，所以其成瘤效果最好。而原位注射法所用細(xì)胞在收集時(shí)經(jīng)歷的胰酶消化可能對(duì)細(xì)胞有一定損傷，分散后的細(xì)胞丟失了細(xì)胞間質(zhì)中的生長(zhǎng)因子等活性物質(zhì)，同時(shí)原位注射細(xì)胞懸液易發(fā)生漏出，這些均影響了該法的建模效果［19］。皮下成瘤后引瘤組織塊原位移植腎周筋膜內(nèi)法成瘤效果最差，分析其原因可能是由于腎周筋膜內(nèi)法是將腫瘤組織塊置于腎周脂肪層和腎筋膜之間，與腎包膜下包埋法相比，組織塊距離腎實(shí)質(zhì)更遠(yuǎn)，腫瘤細(xì)胞更難侵入正常組織；同時(shí)，腎周脂肪層較疏松，對(duì)腎癌組織塊的固定性較差。

影像學(xué)檢查是腫瘤診斷的重要手段，其中PET/CT由于其高特異性及高敏感性越來(lái)越多被用于臨床診斷。與正常組織相比，腫瘤組織的糖酵解明顯增加，顯像劑18F-FDG攝取增加，成像時(shí)呈現(xiàn)異常濃聚影。本研究各實(shí)驗(yàn)組中，成瘤腎臟均出現(xiàn)明顯異常濃聚影。而裸鼠腦部、脊柱旁側(cè)也出現(xiàn)了異常濃聚影，這與檢查時(shí)環(huán)境溫度較低、棕色脂肪代謝增多有關(guān)。此外，由于18F-FDG是經(jīng)過(guò)泌尿系統(tǒng)排泄，膀胱、輸尿管處也表現(xiàn)輕微異常聚影［20］。

影像學(xué)、組織學(xué)及血液學(xué)檢查結(jié)果表明，2種人腎癌細(xì)胞系，無(wú)論是皮下成瘤還是細(xì)胞懸液原位注射成瘤，ACHN細(xì)胞系從成瘤率、成瘤效果來(lái)看，均優(yōu)于786-0細(xì)胞系。同時(shí)，本研究中的4種原位建模方法中以皮下成瘤后引瘤組織塊原位移植腎包膜下法的成瘤率高、成瘤效果最好，這為進(jìn)一步研究人腎細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制及有效治療方法提供良好的動(dòng)物模型。

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A comparative study of four methods of establishing orthotopic human renal cell carcinoma models in nude mice

ZHAO Peipei1,2, CHEN Xiaojing2, WANG Qiaoling1,2, ZHAO Xue2, ZHAO Yanan2, LIU Peifeng2, DAI Huili1,2(1. Department of Nephrology, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200127, China; 2. Department of Central Laboratory, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200127, China)

DAI Huili E-mail: dhl_sh@163.com

Background and purpose: Renal cell carcinoma is the most common form of kidney cancer, characterized by lack of early symptoms and high malignancy. This study aimed to establish orthotopic nude mice models of human renal cell carcinoma with high success rate and good repeatability. Methods: The four types of methods which were adopted to establish the orthotopic models of renal cell carcinoma were orthotopic injection of 786-0 and ACHN cell suspensions, orthotopic injection of primary cell suspensions obtained from the subcutaneous tumor tissues, renal subcutis orthotopic implantation into renal capsule and surgical subcutis orthotopic implantation into renal fascia. To gain insights into the tumorigenicity and the growth of transplantation tumors, the imageological examination (PET/CT), histological examination (H-E staining, immunohistochemistry staining) and biochemical analysis of blood were carried out. Results: In terms of the subcutaneous transplantation of human renal cell carcinoma models in nude mice, tumorigenic rate of ACHN cells (90%) was higher than that of 786-0 cells (30%). The tumorigenic incidences of 786-0 cell suspensions orthotopic injection, ACHN cell suspensions orthotopic injection, ACHN subcutis cellular suspensions orthotopic injection, ACHN subcutis orthotopic implantation into renal capsule and renal fascia were 33%, 80%, 90%, 100% and 20%, respectively. ACHN subcutis orthotopic implantation into renal capsule was the mosteffective approach. Imageological and histological results accorded with poorly differentiated renal cell carcinoma. Conclusion: Four orthotopic nude mice models of human renal cell carcinoma were successfully established. Among these methods, ACHN subcutis orthotopic implantation into renal capsule is the most effective approach, which provides an ideal model for the research on biological behavior of human renal cell carcinoma and its treatment.

Renal cell carcinoma; Nude mice; Orthotopic transplantation; PET/CT; ACHN cells

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.03.003

R737.11

A

1007-3639(2017)03-0177-09

2016-09-01

2016-12-30）

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃項(xiàng)目(15140902700)。

戴慧莉 E-mail: dhl_sh@163.com