膽翹注射液急性和亞慢性毒性試驗

吳建華 ，黃宏業(yè) ，楊善忠 ， 何家康 ，胡庭俊*，廖玲玲

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.廣西北斗星動物保健品有限公司，廣西南寧 530003；3.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西南寧 530001；4.廣西柯新源原種豬有限責(zé)任公司，廣西南寧 530001)

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膽翹注射液急性和亞慢性毒性試驗

吳建華1，黃宏業(yè)2，楊善忠2， 何家康1，胡庭俊1*，廖玲玲3,4*

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.廣西北斗星動物保健品有限公司，廣西南寧 530003；3.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西南寧 530001；4.廣西柯新源原種豬有限責(zé)任公司，廣西南寧 530001)

旨在評價膽翹注射液的毒性，為臨床安全用藥提供理論依據(jù)。以昆明小鼠為研究對象，進行急性和亞慢性毒性試驗。在急性毒性試驗中， 給予小鼠不同濃度的膽翹注射液來測定膽翹注射液的半數(shù)致死量和最大耐受量；在亞慢性毒性試驗中，小鼠以(10、5、2.5 g/kg)不同劑量連續(xù)腹腔注射給藥28 d，在給藥第28天觀察小鼠的臨床體征、體重及飼料利用率、血常規(guī)、血液生化指標和病理組織學(xué)變化。結(jié)果顯示，急性毒性試驗各劑量組小鼠均無死亡，無法測出LD50，最大耐受量為20 g/kg。亞慢性毒性試驗中用藥組小鼠的臨床體征、體重及飼料利用率、血常規(guī)、血液生化指標與空白組小鼠相比，無顯著差異(P>0.05)，組織病理學(xué)觀察，實質(zhì)器官無異常病變。表明膽翹注射液實際無毒，安全性好。

膽翹注射液；毒性試驗；小鼠

黃芩具有清熱燥濕，瀉火解毒等功效。主要用于治療呼吸系統(tǒng)感染、肝膽性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病等，臨床應(yīng)用已有千年之久，是中醫(yī)常用藥之一[1]；黃芩苷為草本植物黃芩的主要有效成分，屬于黃酮類化合物；現(xiàn)代藥學(xué)研究表明，黃芩苷在清除自由基、抗氧化、減輕組織的缺血再灌注損傷、調(diào)節(jié)免疫、促進細胞凋亡，以及抗腫瘤等多方面均有作用；在抗菌消炎、抗病毒、保護肝腎、抗腫瘤、改善微循環(huán)等多方面均有顯著作用[2-3]。 豬膽酸味苦性寒，具有清熱燥濕的作用。臨床用于化膿性感染、腸梗阻、便秘，以及急性腸胃炎、菌痢、急性傳染性肝炎和單純的消化不良等疾病[4]。膽翹注射液是廣西北斗星動物保健品有限公司研發(fā)的中獸藥產(chǎn)品，含有黃芩苷、豬膽酸等有效成分。本研究旨在考察膽翹注射液的毒性作用，為膽翹注射液的臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 昆明種小鼠，雌雄各半，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號為：SCXK桂2014-0002。于購買后新環(huán)境下適應(yīng)飼養(yǎng)7 d，每天人工照明12 h。灌胃前禁食8 h～12 h，不限制飲水。

1.1.2 受試藥品 膽翹注射液，廣西北斗星動物保健品有限公司中試產(chǎn)品；規(guī)格：0.5 g/mL,即每1 mL膽翹注射液相當于原生藥0.5 g，10 mL/支。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性預(yù)試驗 選用8周齡、體重為20 g～25 g昆明系小鼠20只，隨機分為5組，每組4只，分籠飼養(yǎng)。膽翹注射液設(shè)A(20 g/kg)、B(10 g/kg)、C(5 g/kg)、D(2.5 g/kg)、E(1.25 g/kg)5個劑量組。于試驗開始24 h內(nèi)一次性對小鼠進行灌胃給藥。此后觀察7 d，記錄小鼠的飲食、飲水量變化及是否有中毒或死亡癥狀出現(xiàn)。若無死亡小鼠，則于用藥第8天，將所有供試鼠斷頸處死，剖檢，觀察小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、胃﹑腸道等臟器有無異常。若無異常，進行急性毒性最大耐受量試驗 。

1.2.2 最大耐受量試驗 ①選用8周齡、體重為20 g～25 g昆明系小鼠20 只，于試驗開始24 h內(nèi)給每只小鼠腹腔注射膽翹注射液0.2 mL，劑量為20 g/kg。②給藥后24 h內(nèi)注意觀察小鼠是否出現(xiàn)中毒反應(yīng)，隨后每天觀察2次，觀察小鼠的飲食、精神狀態(tài)、自主活動、排糞等，并及時做好記錄。連續(xù)觀察7 d，觀察期保證飼喂條件不變。于用藥第8天，將所有供試鼠斷頸處死，剖檢，檢查小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、胃﹑腸道等臟器有無異常。

1.2.3 亞慢性毒性試驗 80只昆明種小鼠隨機分為4組,即第1組為空白對照組，第2、3、4組分別為膽翹注射液2.5 g/kg劑量組、5 g/kg劑量組和10 g/kg劑量組，每組20只，雌雄各10只，分籠飼養(yǎng)，空白對照組腹腔注射生理鹽水，給藥組給予膽翹注射液，其中第2組2.5 g/kg，第3組5 g/kg，第4組10 g/kg，每只小鼠注射溶液體積為0.2 mL/10 g，連續(xù)28 d。

1.2.4 觀察指標

1.2.4.1 臨床體征 試驗期間觀察小鼠是否出現(xiàn)與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)，如精神狀態(tài)、呼吸、行為及排糞等情況變化。給藥后觀察28 d。記錄小鼠不良反應(yīng)出現(xiàn)的時間、程度、持續(xù)時間。觀測的不良反應(yīng)包括過敏反應(yīng)、局部刺激，消化系統(tǒng)表現(xiàn)如流涎等。不良反應(yīng)觀察時間：對試驗中出現(xiàn)不良反應(yīng)者，應(yīng)觀察至癥狀恢復(fù)正常。

1.2.4.2 體重及飼料利用率 試驗前、試驗結(jié)束時對小鼠稱體重。每7 d于喂料前稱重1次，而后計算小鼠的增重、增重率及飼料利用率。

增重率(%)=增重(g)/試驗前體重(g)×100%

飼料利用率(%)=增重(g)/飼料消耗量(g)×100%

1.2.4.3 樣品采集及處理 在給藥28 d時，每組小鼠眼眶采血，所采血液分兩管放置，其中1管置于帶抗凝劑的離心管中，用于血常規(guī)分析；另1管不加抗凝劑，血液樣品于室溫下靜置2 h，然后2 500 r/min離心5 min，取上層血清，置-80℃保存，用于血液生化指標分析。采血后頸椎脫臼處死，采集肝臟、脾臟和腎臟稱重，計算肝臟、脾臟和腎臟的臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器重(mg)/體重(g)。

1.2.4.4 血常規(guī)分析 加抗凝劑的全血進行白細胞總數(shù)計數(shù)、白細胞分類計數(shù)。

1.2.4.5 血液生化指標分析 血清按試劑盒操作測定谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平。

1.2.4.6 病理組織學(xué)觀察 給藥28 d采血后處死小鼠，取肝、脾、腎固定于100 g/L中性福爾馬林1周，流水沖洗過夜，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 本試驗所得數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0軟件中的比較均值-單因素方差分析法分析，并采用多重比較法進行試驗組間的顯著性檢驗。結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性試驗預(yù)試驗結(jié)果

經(jīng)過7 d的觀察，膽翹注射液急性毒性試驗預(yù)試驗的5個組共20只小鼠，除在給藥后30 min內(nèi)精神略顯沉郁、活動量減少，之后均表現(xiàn)正常，飲水、采食及排便無較大變化，全部存活。在試驗第8天將全部小鼠脫頸處死，剖檢其內(nèi)臟。其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、胃﹑腸道等臟器未見異常變化。結(jié)果表明，無法測得膽翹注射液的半數(shù)致死量(LD50)，故僅進行最大耐受量試驗。

預(yù)試驗詳細分組及小鼠死亡情況如表1。

表1 預(yù)試驗小鼠死亡情況統(tǒng)計表

2.2 最大耐受量試驗結(jié)果

2.2.1 臨床表現(xiàn) 腹腔注射后，30 min內(nèi)小鼠精神狀態(tài)正常，采食飲水正常；24 h內(nèi)小鼠未出現(xiàn)中毒癥狀。觀察7 d，無中毒癥狀出現(xiàn)，所有小鼠食欲、精神狀態(tài)均正常，采食、飲水、排便等活動正常，無小鼠死亡。

2.2.2 剖檢 于用藥第8天對處死的小鼠進行大體解剖，觀察心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、胃、腸道等臟器，肉眼均未見任何明顯的病理變化。

2.3 亞慢性毒性試驗結(jié)果

2.3.1 臨床表現(xiàn) 各組小鼠在腹腔注射給藥后，由于注射時刺激出現(xiàn)輕度不適，精神略顯沉郁、活動量減少，之后均恢復(fù)正常，反應(yīng)靈敏、皮毛光澤，飲水采食及排便無較大變化，試驗過程中未出現(xiàn)死亡小鼠。

2.3.2 膽翹注射液對小鼠體重及飼料利用率的影響 表2和表3結(jié)果顯示，腹腔注射一定劑量的膽翹注射液對小鼠增重率和飼料利用率無影響。

2.3.3 膽翹注射液對小鼠臟器指數(shù)的影響 表4結(jié)果顯示，用藥28 d給藥組肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、脾臟指數(shù)與空白對照組相比差異均不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，膽翹注射液腹腔注射對小鼠的肝、腎臟及脾臟無顯著影響。

2.3.4 血液常規(guī)檢測結(jié)果 如表5所示，用藥28 d小鼠血常規(guī)檢測結(jié)果表明，給藥組小鼠的白細胞總數(shù)與空白對照組比較，差異不顯著(P>0.05)。各白細胞百分比的比較中，10 g/kg、2.5 g/kg劑量組小鼠的淋巴細胞數(shù)降低，但小鼠淋巴細胞正常范圍為48%～92%，試驗結(jié)果在正常范圍內(nèi)波動[5]；10 g/kg劑量組小鼠的中性粒細胞數(shù)升高，但未超出正常范圍(7%～51%)[5]；2.5 g/kg劑量組單核細胞比例上升，但是都在正常范圍波動(0～0.3%)[5]；說明膽翹注射液對血液常規(guī)指標無顯著影響。

表2 小鼠的增重情況

注：*表示與空白對照組進行比較，差異顯著(P<0.05)。

Note:*indicates significant difference compared with blank control group(P<0.5).

表3 小鼠的飼料利用率

注：*表示與空白對照組進行比較，差異顯著(P<0.05)。

Note:*indicates significant difference compared with blank control group(P<0.5).

表4 用藥28 d后小鼠的臟器指數(shù)測定結(jié)果

表5 用藥28 d小鼠血液中白細胞分類計數(shù)結(jié)果

注：*表示與空白對照組進行比較，差異顯著(P<0.05)。

Note:*indicates significant difference compared with blank control group(P<0.5).

2.3.5 血液生化指標檢測結(jié)果 表6結(jié)果顯示，用藥28 d時小鼠血液生化結(jié)果顯示，給藥組小鼠的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性、尿素氮和肌酐水平與空白對照組比較差異不顯著(P>0.05)，谷草轉(zhuǎn)氨酶與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)。

2.3.6 病理組織學(xué)觀察 用藥第28天時，將各試驗組小鼠頸椎脫臼處死，剖檢，10 g/kg劑量組有部分小鼠的肝臟邊緣發(fā)黑，腎臟稍微腫大，被膜緊張，容易剝離，腎表面及切面均呈紅色，切面皮質(zhì)略顯增厚，腎小球呈灰白色半透明小顆粒狀隆起。高劑量組其他組織無肉眼可見變化。空白對照組、2.5 g/kg劑量組、5 g/kg劑量組的小鼠內(nèi)臟器官均未見明顯病理變化。

用藥后28 d小鼠眼眶采血后，每組隨機抽樣20只小鼠剖檢，發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟器官無眼觀病理變化。各組取肝、脾、腎做病理組織切片，未發(fā)現(xiàn)顆粒變性、水泡變性和壞死點等變化。結(jié)果表明，各組小鼠肝、脾、腎組織未出現(xiàn)明顯的病理變化(圖1)。

表6 用藥28 d時小鼠血液生化指標檢測結(jié)果

注：*表示與空白對照組進行比較，差異顯著(P<0.05)。

Note:*indicates significant difference compared with blank control group(P<0.5).

A.肝臟；B.脾臟；C.腎臟

3 討論

臨床上黃芩藥理作用廣泛。其主要有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗腫瘤、阻止鈣離子通道、抑制醛糖還原酶、抗病毒、抗過敏等作用；并對免疫系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等具有保護作用[6]。近年來有關(guān)黃芩不良反應(yīng)的報道時有出現(xiàn)[7-9]，現(xiàn)代藥理研究證明，黃芩不良反應(yīng)與黃芩苷有密切關(guān)系[10]，本試驗通過對小鼠進行腹腔注射膽翹注射液，觀察小鼠的臨床癥狀以及生理生化指標，結(jié)果顯示，小鼠無明顯的不良反應(yīng)，按照毒理學(xué)評價標準[11]，當藥物的LD50>5 g/kg時，該藥物屬于實際無毒性物質(zhì)。本試驗中膽翹注射液高劑量達到20 g/kg，未見毒性反應(yīng)，表明膽翹注射液對小鼠實際無毒。根據(jù)急性毒性試驗預(yù)試驗的結(jié)果，無法測出膽翹注射液的LD50，因此可做最大耐受量試驗以反映藥物的安全性。

最大耐受量試驗中，膽翹注射液劑量為20 g/kg，小鼠健康存活，未見毒性反應(yīng)，測得膽翹注射液的最大耐受量為20 g/kg。

膽翹注射液分別以10、5、2.5 g/kg劑量，連續(xù)用藥28 d，在觀察期內(nèi)未見小鼠有不良反應(yīng)，精神狀態(tài)良好、飲食正常。各試驗組小鼠血液常規(guī)指標和血液生化指標均在正常范圍內(nèi)變動，表明膽翹注射液分別按10、5、2.5 g/kg劑量應(yīng)用時對小鼠生理生化功能無不良影響。膽翹注射液按10、5、2.5 g/kg劑量應(yīng)用后，試驗小鼠肝、脾、腎未見肉眼及組織學(xué)病理變化，未見明顯的毒副作用。

綜合分析各項檢測指標，表明膽翹注射液實際無毒，在臨床上應(yīng)用是安全的。

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Study on Acute and Subchronic Toxicity of Danqiao Injection

WU Jian-hua1,HUANG Hong-ye2,YANG Shan-zhong2,HE Jia-kang1,HU Ting-jun1，LIAO Ling-ling3，4

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530005,China; 2.GuangxiBeidouxingAnimalHealthProductsLimitedCompany,Nanning,Guangxi,530003,China； 3.GuangxiInstituteofAnimalHusbandry,Nanning,Guangxi,530001,China; 4.GuangxiKeXinyuanLimitedLiabilityCompanyofOriginalBreeding,Nanning,Guangxi,530001,China)

In order to evaluate the toxicity of Danqiao injection for the guidance of clinical treatment,the acute and subchronic toxicity test were assessed in KM mice respectively.To determine the acute toxicity，the median lethal dose and the maximum tolerated dose of Danqiao injection were determined.In the subchronic toxicity test,the mice were given with(10,5,2.5 g/kg)for 28 d with peritoneal injection.The clinical signs,body weight and feed utilization rate,blood routine,blood biochemical indexes and histopathological lesions in mice were observed on 28 d after challenge.The results showed that there was no any poisoning and death cases in each group and the maximum tolerated dose was 20 g/kg body weight.There was no significant difference in clinical signs,body weights and feed utilization rates,blood routines,blood biochemical indexes among three treatment groups and control group.The histopathological result reveled no lesion in mice.In conclusion,Danqiao injection was safty for its clinical application.

Danqiao injection;toxicity test;mouse

2016-08-17

南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(20143328)

吳建華(1986-)，男，河南輝縣人，碩士研究生，主要從事中藥免疫藥理學(xué)研究。

S853.74

A

1007-5038(2017)04-0088-05

*通訊作者