中藥生物堿的提取及抗炎作用研究

王夢(mèng)遠(yuǎn)，郭 曉，劉曉婷，商云霞，谷新利

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子832003)

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中藥生物堿的提取及抗炎作用研究

王夢(mèng)遠(yuǎn)，郭 曉，劉曉婷，商云霞*，谷新利*

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子832003)

為探討自擬中藥復(fù)方“宮炎凈”總生物堿、簡化復(fù)方總生物堿以及益母草生物堿對(duì)小鼠的抗炎作用，將實(shí)驗(yàn)小鼠分為生理鹽水、地塞米松、復(fù)方“宮炎凈”總生物堿、簡化復(fù)方總生物堿以及益母草生物堿組，依據(jù)建立小鼠耳廓腫脹、腹腔毛細(xì)血管通透性、足趾腫脹以及肉芽腫炎癥模型來評(píng)估各組藥物的抗炎效果。結(jié)果表明，復(fù)方“宮炎凈”總生物堿組與簡化復(fù)方總生物堿能夠顯著抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹率、降低小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性、抑制蛋清所致小鼠足趾腫脹率、降低棉球所致小鼠肉芽組織增生，均與益母草生物堿組差異顯著(P<0.05)，并與地塞米松組差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果顯示，復(fù)方“宮炎凈”總生物堿組與簡化復(fù)方總生物堿抗炎效果相差不大，簡化復(fù)方可作為臨床用藥組方使用。

中藥復(fù)方宮炎凈；生物堿；抗炎效果

奶牛子宮內(nèi)膜炎常引起產(chǎn)犢間期延長、產(chǎn)奶量降低、犢牛淘汰率增加、甚至不孕癥的發(fā)生，該疾病造成的不良后果嚴(yán)重影響了奶牛業(yè)的發(fā)展[1]。為避免過度依賴抗菌藥物療法對(duì)牛奶的藥物殘留和產(chǎn)生耐藥菌株等嚴(yán)重不良反應(yīng)，運(yùn)用純中藥復(fù)方治療奶牛子宮內(nèi)膜炎是健康又有效的方法之一，近年來的相關(guān)研究表明，中草藥中的生物堿大多數(shù)有抗炎、抗腫瘤、抗癌、抗病毒等作用[2-3]。

本實(shí)驗(yàn)室通過前期臨床試驗(yàn)證明，自擬中藥復(fù)方“宮炎凈”(主要由益母草、川芎、五靈脂、當(dāng)歸等組成)抗炎效果顯著[4]。為對(duì)該復(fù)方有效成分進(jìn)行更深一步研究，本試驗(yàn)以生物堿為例，通過分別提取復(fù)方“宮炎凈”、簡化復(fù)方(益母草、川芎、甘草)及益母草(君藥)中的總生物堿，測(cè)定其對(duì)小鼠耳廓腫脹、毛細(xì)血管通透性、足趾腫脹以及肉芽腫的影響[5-8]，為中藥復(fù)方“宮炎凈”有效成分組方的優(yōu)化研究及抗炎作用提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 中藥復(fù)方“宮炎凈”、君藥益母草、各單味藥(當(dāng)歸、川芎、桃仁等)，均購自石河子市醫(yī)藥公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 200只體重20 g±2 g雌性昆明小鼠,購自石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 藥品和試劑 地塞米松,Blotopped公司產(chǎn)品(50-02-2)；伊文思蘭，Biotopped公司產(chǎn)品(314-13-6)；無水乙醇(分析醇)、二甲苯(20080606)，成都市科龍化工制劑廠產(chǎn)品。

1.1.4 儀器設(shè)備 紫外-可見分光光度計(jì)(BLUE STAR)，北京萊伯泰科公司產(chǎn)品；離心機(jī)(Z36HK)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52)，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；8 mm不銹鋼沖子；精密電子天平(BS423S)，北京賽多利斯天平有限公司產(chǎn)品；Biotek SynergeyTM2 多功能酶標(biāo)儀(550)，Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 單味藥生物堿的定性試驗(yàn) 分別稱取復(fù)方“宮炎凈”各單味藥50 g，浸于700 mL/L乙醇，放置24 h真空抽濾去除藥渣，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收后用10 mL/L的鹽酸稀釋，得到溶液于1 000 r/min離心2 min，收集上清液，按一定比例混入生物堿特異性檢測(cè)試劑碘化汞鉀試劑、碘化鉍鉀試劑、硅鎢酸試劑、磷鉬酸試劑，觀察混合溶液中是否有與測(cè)試劑相對(duì)應(yīng)特異性沉淀產(chǎn)生。

1.2.2 生物堿的提取 取復(fù)方“宮炎凈”粉末50 g，簡化復(fù)方粉末組合50 g，益母草粉末50 g。浸于500 mL濃度700 mL/L乙醇回流6 h，反復(fù)3次后，合并提取液，真空瓶抽濾，除去多余雜質(zhì)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮至50 mL。

制備732陽離子交換樹脂柱。稀鹽酸調(diào)制上述各組濃縮液pH至4～5，真空抽濾，去除雜質(zhì)。各組濾液分別通過陽離子交換脂柱，流出液以1 mL/管為單位，直至管中分別滴加100 mL/L硅鎢酸后出現(xiàn)陽性反應(yīng)(生物堿試劑反應(yīng))，收集去離子水洗脫液并至溶液pH呈中性后，繼續(xù)用50 mL/L鹽酸溶液洗脫液至生物堿試劑反應(yīng)為陰性后停止，將所得溶液減壓蒸干后， 即為生物堿細(xì)提物。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按試驗(yàn)方案不同，隨機(jī)分為4個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組各50只，分別為耳廓腫脹試驗(yàn)組、腹腔毛細(xì)血管通透性試驗(yàn)組、足趾腫脹試驗(yàn)組以及肉芽腫炎癥模型試驗(yàn)組。每個(gè)試驗(yàn)組按照處理藥物不同分為5個(gè)給藥組，每組10只，分別為復(fù)方“宮炎凈”總生物堿組、簡化復(fù)方總生物堿組、益母草生物堿組；生理鹽水組；地塞米松組。正常飼喂，除肉芽腫炎癥模型試驗(yàn)組外，其他試驗(yàn)各組小鼠按照地塞米松組5 mg/kg的質(zhì)量/體重比，其他藥物100 mg/kg的質(zhì)量/體重比灌胃，每日1次，連續(xù)7 d。

1.2.3.1 生物堿對(duì)小鼠耳廓腫脹度影響 取耳廓腫脹試驗(yàn)組小鼠，第7天終止給藥0.5 h后,每只左耳正反兩側(cè)皮膚棉簽涂抹二甲苯(0.025 mL)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)0.5 h，頸椎脫臼處死終止反應(yīng)。從相同部位用不銹鋼沖子沖下小鼠雙耳耳片，稱重，計(jì)算小鼠的耳廓腫脹率。

1.2.3.2 生物堿對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性影響 取毛細(xì)血管通透性試驗(yàn)組小鼠，第7天終止給藥1 h后，尾靜脈推注濃度為10 g/L伊文思藍(lán)0.2 mL后，按照每只小鼠每1 g體重腹腔注射0.01 mL劑量的冰醋酸誘發(fā)炎癥反應(yīng)20 min，頸椎脫臼處死終止反應(yīng)，生理鹽水沖洗腹腔(5 mL/只)并收集沖洗液，于1 000 r/min離心3 min，紫外分光光度計(jì)于590 nm波長測(cè)定上清液OD值。

1.2.3.3 生物堿對(duì)小鼠足趾腫脹率影響 取足趾腫脹試驗(yàn)組小鼠，第7天終止給藥30 min后，每只右后足皮下注射0.03 mL 10 mL/L雞蛋清溶液誘發(fā)炎癥反應(yīng)4 h，頸椎脫臼處死終止反應(yīng)，從踝關(guān)節(jié)處剪下雙后足計(jì)算小鼠足趾腫脹率。

1.2.3.4 生物堿對(duì)小鼠棉球肉芽腫形成影響 小鼠乙醚麻醉，在無菌條件下切開兩耳斜向下部，將5 mg高壓滅菌棉球棉球植入皮下后縫合。術(shù)后第2天各組分別灌胃給藥，連續(xù)2周，末次給藥50 min后，頸椎脫臼處死終止反應(yīng)，剪開術(shù)部皮膚，剝離棉球以及周圍肉芽組織，70℃烘箱干燥24 h，精確稱量棉球肉芽組織干重。

2 結(jié)果

2.1 生物堿對(duì)小鼠耳廓腫脹率的影響

結(jié)果見表1。由表1可知，復(fù)方“宮炎凈”總生物堿組和簡化復(fù)方總生物堿組均能顯著抑小鼠耳廓腫脹，兩組與益母草生物堿組差異顯著(P<0.05)，并且簡化復(fù)方總生物堿組抑制腫脹效果最好。

表1 小鼠耳廓腫脹率的影響

注：角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different small letters mean significant difference(P<0.05),and with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

2.2 生物堿對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性影響

結(jié)果見表2。由表2可知，復(fù)方“宮炎凈”總生物堿組與簡化復(fù)方總生物堿組能夠較好的降低小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性，與地塞米松組差異不顯著(P>0.05)；并且簡化復(fù)方總生物堿組、復(fù)方“宮炎凈”總生物堿組與益母草生物堿組差異極顯著(P<0.01)。

2.3 生物堿對(duì)小鼠足趾腫脹率影響

結(jié)果見表3。由表3可知，復(fù)方“宮炎凈”總生物堿組、簡化復(fù)方總生物堿組和益母草生物堿組均能顯著抑制小鼠足趾腫脹，且簡化復(fù)方總生物堿組抑制效果顯著優(yōu)于復(fù)方“宮炎凈”總生物堿組和益母草生物堿組，且與地塞米松組差異不顯著(P>0.05)。

2.4 生物堿對(duì)小鼠棉球肉芽腫形成影響

結(jié)果見表4。由表4可知，復(fù)方“宮炎凈”總生物堿組與簡化復(fù)方總生物堿組均能降低棉球所致小鼠肉芽組織增生，與地塞米松組相比，簡化復(fù)方總生物堿組差異不顯著(P>0.05)。

表2 小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性影響

注：角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different small letters mean significant difference(P<0.05),and with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

表3 小鼠足趾腫脹率影響

注：角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different small letters mean significant difference(P<0.05),and with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

3 討論

自擬復(fù)方“宮炎凈”是以益母草為君藥，川芎、當(dāng)歸、桃仁等組成。賈書紅等[9]提取中藥復(fù)方“宮炎凈”中總生物堿，用于家兔子宮內(nèi)膜炎的治療，不僅收到了良好的治療效果，并且具有用藥后毒性低、無殘留、休藥期短等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)前，一些相關(guān)研究也驗(yàn)證了絕大多數(shù)生物堿均具有較為突出的生物活性[10]。邰曉曦等[11]提取沙棘籽粕生物堿作用于小鼠炎癥模型發(fā)現(xiàn)，對(duì)小鼠耳廓腫脹、腹腔毛細(xì)血管通透性增加、大鼠足部腫脹均有顯著抑制。周倩等[12]也在提取半夏生物堿用于已建立的小鼠炎癥模型中，證實(shí)了半夏生物堿具有顯著的抗炎效果。本試驗(yàn)通過提取復(fù)方“宮炎凈”總生物堿組、簡化復(fù)方總生物堿組、益母草生物堿作用于小鼠炎癥模型發(fā)現(xiàn)，3個(gè)組均對(duì)小鼠耳廓腫脹、腹腔毛細(xì)血管通透性、足趾腫脹和棉球肉芽腫的形成有抑制作用。

表4 小鼠棉球肉芽腫形成影響

注：角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different small letters mean significant difference(P<0.05),and with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

本試驗(yàn)證實(shí)3個(gè)組生物堿雖均能抑制這4個(gè)經(jīng)典炎癥模型，但復(fù)方“宮炎凈”總生物堿、簡化復(fù)方總生物堿抗炎效果優(yōu)于益母草生物堿。黃紅英等[13]在提取延胡索與不同藥物配伍中總生物堿含量的測(cè)定中得到延胡索與白芷配伍總生物堿含量最高，與當(dāng)歸配伍次之，當(dāng)單味藥延胡索時(shí)生物堿含量最低。中醫(yī)復(fù)方強(qiáng)調(diào)“君臣佐使”配伍關(guān)系，“君臣佐使”體現(xiàn)在不同藥物的組合使用上，益母草雖為君藥但仍需各味藥協(xié)同增效。

通過生物堿試劑檢測(cè)發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方“宮炎凈”中并不是每單味藥都含有生物堿，篩選出含有生物堿的單味藥組成簡化復(fù)方。簡化復(fù)方總生物堿抗炎效果略優(yōu)于復(fù)方“宮炎凈”總生物堿，可能由于“宮炎凈”復(fù)方中所含成分比較多，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，相互發(fā)生協(xié)同作用，在生物堿的提取過程中發(fā)生改變，這些可能性都有待于進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)證明了中藥復(fù)方“宮炎凈”總生物堿、簡化復(fù)方總生物堿、益母草生物堿均具有抗炎效果，其中復(fù)方“宮炎凈”總生物堿、簡化復(fù)方總生物堿效果要明顯優(yōu)于益母草生物堿，因此，簡化復(fù)方可作臨床用藥組方使用。

[1] 李正國,宋華榮,羅瑞卿,等.奶牛子宮內(nèi)膜炎主要病原菌的分離鑒定及中藥藥敏試驗(yàn)[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,22(2):463-466.

[2] 李德朋,張桂林,張文博,等.中藥治療奶牛子宮炎的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī),2011,38(7):168-170.

[3] 周賢春,何春霞,蘇力坦,等.生物堿的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,2006,17(3):476-479.

[4] 李正國.抗奶牛子宮內(nèi)膜炎復(fù)方中藥的藥理作用研究[D].新疆石河子：石河子大學(xué),2009.

[5] Tamura T, Amano T,Ohmori K,et al.The effects of olopatadine hydrochloride on the number of scratching induced by repeated application of oxazolone in mice[J].Eur J Pharmacol,2005,524(1):149-154.

[6] 王 茜.黃柏飲片及顆粒飲片水煎液小檗堿含量和抗炎作用比較研究[D].四川成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[7] 黃雪君.蟾酥軟膏對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎抗炎鎮(zhèn)痛作用及機(jī)理研究[D].廣東廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué),2007.

[8] 李 萬，蔡亞玲.益母草總生物堿的藥理實(shí)驗(yàn)究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2002,31(2):168-170.

[9] 賈書紅，李效振，張東升，等.中藥復(fù)方宮炎凈提取物中生物堿對(duì)家兔部分血液學(xué)指標(biāo)的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014(10):38-43.

[10] 周賢春，何春霞，蘇力坦，等.生物堿的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊，2006,17(3):476-479.

[11] 周 倩,吳 皓.半夏總生物堿抗炎作用研究[J].中藥藥理與臨床,2006(S1):87-89.

[12] 邰曉曦，孫 婧，曹露曄.沙棘籽粕中生物堿的提取及抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2013,24(5):1140-1142.

[13] 黃紅英，張建華，董鈺明.延胡索與不同藥物配伍中總生物堿含量的測(cè)定[J].四川中醫(yī),2007(12):46-48.

Study on the Alkaloid Extract from Traditional Chinese Medicine and Anti-inflammatory Effect

WANG Meng-yuan， GUO Xiao， LIU Xiao-ting，SHANG Yun-xia， GU Xin-li

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi，Xinjiang，832003,China)

To compare the differences of anti-inflammatory effect among total compound alkaloids,simplified compound alkaloids and alkaloids ofLeonurusjaponicusof traditional Chinese medicine "GongYanJing" in mice,the mice were divided into five groups including normal saline,dexamethasone,total compound alkaloids,simplified compound alkaloids and alkaloids ofLeonurusjaponicus.The anti-inflammatory experiments adopted mouse ear swelling model,toe swelling model,celiac capillary permeability experiment and granuloma inflammation model to evaluate the anti-inflammatory effect of each treatment.The results showed tant compared with alkaloids ofLeonurusjaponicas,simplified compound alkaloids and total compound alkaloids could significantly inhibit rates of xylene-induced ear swelling and albumen-induced toe edema, suppress the hyperplasia of granulation tissue induced by cotton ball, and reduce the capillary permeability in abdominal cavity.However,there were no difference found between simplified compound alkaloids(P<0.05) and total compound alkaloids groups and dexamethasone group(P>0.05).The anti-inflammatory effect of both simplified compound alkaloids and total compound alkaloids of traditional Chinese medicine "GongYanJing" is better clinical medcine.

traditional Chinese medicine GongYanJing;alkaloid;anti-inflammatory effect

2016-12-05

新疆兵團(tuán)科技支疆項(xiàng)目(2013AB010)

王夢(mèng)遠(yuǎn)(1992-)，女，河南商丘人，碩士研究生，主要從事中草藥的開發(fā)與利用研究。

S853.74

A

1007-5038(2017)04-0080-04

*通訊作者