數(shù)字減影血管造影定位引導(dǎo)技術(shù)在動態(tài)采集恒河猴腦脊液中的應(yīng)用

焦 河，王鳳英*，王 滔

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院，四川成都 610041；2.成都高新海爾森醫(yī)院，四川成都 610041)

?

數(shù)字減影血管造影定位引導(dǎo)技術(shù)在動態(tài)采集恒河猴腦脊液中的應(yīng)用

焦 河1，王鳳英1*，王 滔2

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院，四川成都 610041；2.成都高新海爾森醫(yī)院，四川成都 610041)

探索數(shù)字減影血管造影(DSA)定位引導(dǎo)技術(shù)在恒河猴腦脊液動態(tài)采集中的應(yīng)用。將28只恒河猴隨機(jī)均分為2組，經(jīng)左前肢靜脈推注30 g/L戊巴比妥鈉溶液全麻后，常規(guī)剔除背部脊柱周圍體毛并消毒；試驗組在DSA定向引導(dǎo)技術(shù)下行腰椎間隙穿刺蛛網(wǎng)膜下腔采集腦脊液，結(jié)果14只全部穿刺成功，穿刺后均有腦脊液從穿刺針中流出；對照組直接行腰椎間隙穿刺蛛網(wǎng)膜下腔，8只穿刺成功，6只穿刺失敗，后經(jīng)DSA定位引導(dǎo)技術(shù)調(diào)整針尖方向與位置，完成穿刺，采集到腦脊液；28只恒河猴穿刺成功后均在DSA定位引導(dǎo)下將硬膜外麻醉導(dǎo)管經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔至枕大池，置泵于腰背部，通過所置的泵可實現(xiàn)恒河猴在清醒、全生理狀態(tài)下對腦脊液進(jìn)行動態(tài)多次采集，快速省時，由于采樣導(dǎo)管置于枕大池，采集到的腦脊液無色透明、樣品質(zhì)量有保證，易于滿足檢驗需要，具有一定的實用價值。

恒河猴；腰椎穿刺術(shù)；腦脊液

腦脊液(cerebral spinal fluid，CSF)由側(cè)腦室中脈絡(luò)叢產(chǎn)生，供給腦細(xì)胞一定的營養(yǎng)，運(yùn)走腦組織的代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的酸堿平衡，緩沖腦和脊髓的壓力，對腦和脊髓具有保護(hù)和支持作用[1]，腦脊液中含有通透血腦屏障的成分，采用腦脊液藥理學(xué)的試驗方法比血清藥理學(xué)更具有說服力和可信度[2]，通過檢測藥物在腦脊液中的含量來探索藥物是否能有效通過血腦屏障[3]，對研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病病因和病理機(jī)制，以及神經(jīng)系統(tǒng)藥理學(xué)具有重要作用[4]。在動物清醒、全生理狀態(tài)下動態(tài)多次采集枕大池?zé)o色透明的腦脊液是研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，定位至關(guān)重要。以往常用的小腦延髓穿刺，因危險性大，容易造成血性腦脊液，混入的血液可能影響藥物濃度測定的準(zhǔn)確性，同時易發(fā)生顱內(nèi)感染[5]。本文在數(shù)字減影血管造影(digital subtraction angiography，DSA)定位引導(dǎo)下可以直觀將硬膜外麻醉導(dǎo)管經(jīng)腰椎間隙蛛網(wǎng)膜下腔置于枕大池，實現(xiàn)恒河猴在清醒、全生理狀態(tài)下動態(tài)多次采集腦脊液，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病機(jī)制的研究和藥效評價、神經(jīng)精神類藥物在腦脊液中藥-時曲線等提供了非常好的平臺。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 恒河猴28只，雄性，體重4 kg～7 kg，年齡3歲～6歲，購自四川格林豪斯生物科技有限公司。隨機(jī)分為試驗組和對照組兩組，每組14只，穿刺前禁食禁水8 h。

1.1.2 儀器設(shè)備 飛利浦大型平板數(shù)字減影血管造影機(jī)(DSA)-FD20。

1.1.3 主要耗材和試劑 一次性使用麻醉穿刺包，魯食藥監(jiān)器械生產(chǎn)產(chǎn)品，規(guī)格型號：AS-E 18#；微導(dǎo)絲，美國COOK公司產(chǎn)品，規(guī)格型號：TPMG-16C-180-TC45-FLX12，批號：E3415442；BD18G封閉式靜脈留置針；30 g/L戊巴比妥鈉溶液，規(guī)格：25 g/瓶，白色粉末狀，瓶身批號：CAS Number:57-33-0，MDL number:MFCD00070198。

1.2 方法

1.2.1 腰椎穿刺術(shù) 將恒河猴按1 mL/kg 30 g/L戊巴比妥鈉溶液注射麻醉后側(cè)臥于DSA手術(shù)檢查臺上，盡量屈頸、后肢屈曲貼近腹部，使動物背部呈弓形，體位正確與否，常為穿刺成功與否的重要環(huán)節(jié)。消毒后的恒河猴，脊柱前屈，整個身體呈“C”字形，充分打開椎間隙[6]，以保證穿刺的順利進(jìn)行。常規(guī)剔除背部脊柱周圍體毛并50 mL/L艾利克(聚維酮碘溶液)消毒鋪巾(圖1)。試驗組在DSA透視下選擇L5與L6、L6與L7間隙作為穿刺點(圖2)，通過DSA直視穿刺針斜面與動物矢狀面平行，同時緩慢刺入椎間隙，出現(xiàn)落空感后，在DSA下將穿刺針斜面旋轉(zhuǎn)至與身體縱軸垂直，并使斜口朝向頭部，取出硬膜外套管針的針芯，觀察腦脊液流出情況，再將帶有微導(dǎo)絲的麻醉導(dǎo)管在DSA下通過蛛網(wǎng)膜下腔至枕大池；對照組憑經(jīng)驗同樣選擇L5與L6、L6與L7間隙作為穿刺點穿刺，觀察腦脊液流出情況，將帶有微導(dǎo)絲的麻醉導(dǎo)管在DSA下通過蛛網(wǎng)膜下腔至枕大池。

圖1 側(cè)臥位相對固定、消毒

圖2 穿刺點的選擇

1.2.2 微導(dǎo)絲的應(yīng)用 硬膜外麻醉導(dǎo)管定位準(zhǔn)確，必須要知道導(dǎo)管遠(yuǎn)端的位置，而麻醉導(dǎo)管本身在DSA下不具備顯像能力，必須要借助一個能進(jìn)入麻醉導(dǎo)管的特殊材料微導(dǎo)絲，微導(dǎo)絲是一種復(fù)合金屬材質(zhì)，在DSA透視下具有一定顯像能力，根據(jù)在DSA下微導(dǎo)絲的尖端位置確定麻醉導(dǎo)管遠(yuǎn)端的位置，從而定位到采集腦脊液的具體位置——枕大池(圖3)。

圖3 導(dǎo)管遠(yuǎn)端位置(枕大池)

1.2.3 皮下采樣接口(泵)的埋置 在穿刺點朝頭部5 cm～10 cm處，制作切口，分離皮膚和皮下脂肪組織層，形成皮下空間；取出微導(dǎo)絲，將硬膜外麻醉導(dǎo)管引導(dǎo)至切口；然后將采樣接口(泵)和硬膜外麻醉導(dǎo)管穩(wěn)固連接；最后將采樣接口(泵)縫合固定在皮下，縫合切口。

1.2.4 術(shù)后檢查及評價 28只恒河猴術(shù)后每天觀察并記錄動物的行為學(xué)(包括攝食能力、活動能力、步態(tài))，神經(jīng)損害體征，穿刺局部情況，并對以上指標(biāo)進(jìn)行量化，參照改良Tarlov評分標(biāo)準(zhǔn)[7]評價其神經(jīng)功能，即：0級，后肢無活動，不能負(fù)重，計0分；1級，后肢可見活動但不能負(fù)重，計1分；2級，后肢活動頻繁或有力，不能負(fù)重，計2分；3級，后肢可支持體重，能走1步～2步，計3分；4級，可行走，僅有輕度障礙，計4分；5級，行走正常，計5分(正常狀態(tài)下，動物Tarbv評分為5分)。改良的切口愈合等級評分標(biāo)準(zhǔn)[8]評價其腰椎穿刺局部情況如下：0級，穿刺局部化膿，需切開引流等處理，計0分；1級，穿刺局部有炎癥或滲血、漏液，如紅腫、血腫、積液、硬結(jié)等，計1分；2級，穿刺局部愈合優(yōu)良，無不良反應(yīng)，計2分。

2 結(jié)果

2.1 直接穿刺法

14例中8例穿刺成功，退出穿刺針芯后見無色透明的腦脊液從穿刺針中流出，6例穿刺后無腦脊液流出，成功率為57%。穿刺失敗的6例經(jīng)DSA定位引導(dǎo)技術(shù)下調(diào)整針尖深度、方向與位置，見無色透明的腦脊液從穿刺針中流出。

2.2 在DSA定位引導(dǎo)下穿刺法

14例經(jīng)DSA定位引導(dǎo)下全部穿刺成功，退出針芯后均有無色透明的腦脊液從穿刺針中流出，成功率為100%。兩種穿刺方法經(jīng)卡方檢驗，差異顯著(P<0.05)(表1)。

表1 2種方法穿刺結(jié)果比較

2.3 腦脊液采集情況

本文28例恒河猴穿刺后均經(jīng)DSA定位引導(dǎo)下置管至枕大池，埋置泵于腰背部，術(shù)后均能從泵中采集到無色透明的腦脊液。其中對照組中有2例經(jīng)腰椎間隙穿刺成功后在進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔時無腦脊液流出，經(jīng)DSA下進(jìn)微導(dǎo)絲至導(dǎo)管遠(yuǎn)端發(fā)現(xiàn)其遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)折(圖4)，微退調(diào)整導(dǎo)管尖端方向，順利進(jìn)入枕大池；有3例在置入泵準(zhǔn)備縫合時，確認(rèn)腦脊液抽吸情況發(fā)現(xiàn)抽吸受阻，負(fù)壓增大，在DSA下進(jìn)微導(dǎo)絲，微調(diào)導(dǎo)管遠(yuǎn)端方向和位置，回抽，腦脊液通暢，其原因是在置入泵過程中，導(dǎo)管和泵對接時因旋轉(zhuǎn)了留在體外的導(dǎo)管，導(dǎo)致導(dǎo)管遠(yuǎn)端方向和位置移位；對照組有2例在腰椎穿刺時有創(chuàng)傷，造成最初的腦脊液稍帶血色，后逐漸變成無色透明的腦脊液；有5例動物在術(shù)后第3天行腦脊液動態(tài)采集時，導(dǎo)管負(fù)壓增大，致無法采集到腦脊液，拔出導(dǎo)管后觀察導(dǎo)管遠(yuǎn)端有凝固血液阻塞或神經(jīng)根組織堵塞了引流管通道。

圖4 導(dǎo)管遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)折

2.4 行為學(xué)觀察、神經(jīng)功能評分及穿刺點情況

28只恒河猴均于置管術(shù)后1 h左右清醒，術(shù)中和術(shù)后均無死亡，術(shù)后生命體征平穩(wěn)。穿刺術(shù)后恒河猴的飲食、活動均于當(dāng)天恢復(fù)正常。術(shù)后觀察1周，腰椎穿刺點和皮下采樣接口(泵)埋置位置傷口愈合良好，改良Tarlov評分標(biāo)準(zhǔn)評價其神經(jīng)功能，顯示穿刺前后均無神經(jīng)損害(表2)。

表2 術(shù)后1周觀察結(jié)果統(tǒng)計情況

3 討論

3.1 實驗動物腦脊液的采集方法

一類是經(jīng)皮頸椎穿刺小腦延髓池置管法，需要切除部分椎板，且手術(shù)部分的蛛網(wǎng)膜下腔易發(fā)生粘連，影響腦脊液循環(huán)及其成分，導(dǎo)管置入時易損傷血管導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血[9]；其二在顱骨上鉆孔插管引流腦脊液，這種方法往往適合于一次性采集腦脊液，而再次采集腦脊液時卻要再次麻醉動物，在原骨窗處清除骨臘或另開骨窗，重新置管[10]，操作有一定的難度且不易預(yù)留和固定導(dǎo)管，同時在暴露顱骨操作過程中，易大量出血，存在人為損傷腦組織、腦脊液外漏等問題，觀察結(jié)果不夠穩(wěn)定可靠[11]，多次穿刺過程中容易誤刺到腦干，導(dǎo)致動物立即死亡，死亡率很高[12]；而本文中在DSA定向引導(dǎo)下經(jīng)腰椎間隙穿刺蛛網(wǎng)膜下腔至枕大池并埋泵，這種方法操作簡便，安全性好，可行性強(qiáng)，手術(shù)損傷較小，導(dǎo)管定位準(zhǔn)確，其成功率幾乎為100%；通過埋置的泵采集腦脊液，快速省時，實現(xiàn)在動物清醒時、全生理狀態(tài)下對腦脊液進(jìn)行動態(tài)多次采集，采集導(dǎo)管在體內(nèi)可留置3個月時間,最頻繁的間隔1 h～2 h采集1次，也有1 d～2 d采集1次，每次的量0.5 mL～1 mL。

3.2 穿刺技巧

由于蛛網(wǎng)膜下腔外有由疏松結(jié)締組織和靜脈叢構(gòu)成的硬膜外腔，內(nèi)有富含血管的軟脊膜，因此穿刺前需熟悉局部解剖，穿刺方向不當(dāng)、歪斜、太深或太淺都可能導(dǎo)致穿刺失敗或損傷周圍組織[13]，穿刺時，穿刺針垂直刺入恒河猴背部腰椎間隙，當(dāng)感覺有落空感及動物的后肢跳動時，表明針尖已達(dá)蛛網(wǎng)膜下腔[14]，退出針芯，可見清亮腦脊液流出。將帶有微導(dǎo)絲的硬膜外導(dǎo)管緩慢送入穿刺針內(nèi)，當(dāng)送入約10 cm左右后，感覺到導(dǎo)管尖端受阻，DSA下見導(dǎo)管遠(yuǎn)端已到針尖處，逐漸將穿刺針斜面從與動物矢狀面平行位置旋轉(zhuǎn)到與動物冠狀面平行，同時將暴露在體外的穿刺針向足側(cè)輕輕傾斜，輕進(jìn)導(dǎo)管明顯有突破感時，表明導(dǎo)管遠(yuǎn)端已進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔越過了穿刺針尖，緩慢將帶有微導(dǎo)絲的導(dǎo)管送至枕大池，輕輕退出微導(dǎo)絲，微導(dǎo)絲尖端會有無色透明的腦脊液點滴，同時導(dǎo)管內(nèi)有無色透明的腦脊液緩慢流出。由于腦脊液中真正含有通透血腦屏障的成分, 因此在對中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥效學(xué)的研究中采用腦脊液藥理學(xué)的試驗方法就比血清藥理學(xué)更具說服力, 可增加試驗結(jié)果的可信度[15]。介入微創(chuàng)的采樣操作，再次采集腦脊液時無需麻醉動物，提高了動物的福利，大大降低了腦脊液采樣的難度，減少了勞動力消耗，相應(yīng)地減少了實驗動物的消耗，降低了實驗動物成本；DSA的準(zhǔn)確定位，采集的腦脊液樣品質(zhì)量更有保證，易于滿足檢驗需要，具有一定的實用價值，采集的數(shù)據(jù)結(jié)果更有分析意義。

[1] 陳 霆,叢 喆,魏 強(qiáng).實驗用猴腦脊液采集技術(shù)方法的創(chuàng)新[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2011,21(2):49-51.

[2] 富 宏,陶迎紅,王學(xué)美,等.經(jīng)皮穿刺延髓池抽取兔和大鼠腦脊液的方法[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2006,16(11):684-687.

[3] Huang H，Zhang Y，Yang R，et al． Determination of baicalin in rat cerebrospinal fluid and blood using microdialysis coupled with ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]．J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2008，874(1-2):77-83．

[4] 楊之蘭，何東松，魯婷婷.老年人側(cè)入法與直入法腰椎穿刺比較[J].云南醫(yī)藥，2015,36(3)：348-349.

[5] 何繼紅,許 飛,孫紅斌.一種Beagle犬腰椎穿刺置管術(shù)介紹[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2008,18(3):72-74.

[6] 高啟賢,張慧玲,譯.腦脊髓液的采集和化驗在診斷價值方面的研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,1997,18(2)：40-42.

[7] Goldsmith H S,Steward E,Duckett S.Early application of pedicled omentum to the acutely traum atised spinal cord[J].Paraplegia, 1985, 23(2): 100-112.

[8] 吳在德,吳肇漢.外科學(xué)[M].7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:132.

[9] 呂田明，潘志勇.嚙齒類動物腦脊液取樣技術(shù)[J].中華臨床醫(yī)師雜志:電子版，2013，24(7):11623-11626.

[10] 李惠勉，李建章，姚淑芬.一種實用的采集兔腦脊液方法[J].解剖學(xué)雜志，2000，23(5):488.

[11] 孫建森,黎海濤,應(yīng)大君.監(jiān)測燒傷實驗犬顱內(nèi)壓椎管內(nèi)置管技術(shù)的探討[J],中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(3):174-176.

[12] Kelley D J，F(xiàn)arhoud M，Meyerand M E，et al．Creating physical 3D stereolithograph models of brain and skull[J]．PLoS One，2007，2(10):e1119．

[13] Wang Z C.Neurosurgery of Wang Zhong- cheng[M].Wuhan:Hubei Science and Technology Press,2005:169-170.

[14] 田 野,黎蘭芝,陳 強(qiáng)，等.提高腰椎穿刺成功率的體會[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2004，14(20):1393-1394.

[15] 梅建勛,張伯禮,陸 融.采用腦脊液藥理學(xué)方法對中藥影響星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)作用的觀察[J].中藥材,2000,23(8):467-470.

Application of DSA Positioning and Guiding Technique in Dynamic Acquisition of Cerebrospinal Fluid in Ganges River Monkeys

JIAO He1，WANG Feng-ying1，WANG Tao2

(1.WestChinaHospitalofSichuanUniversity,Chengdu,Sichuan,610041,China; 2.ChengduHighTechHai'ersenHospital,Chengdu,Sichuan,610041,China)

This paper is to explore the application of Digital Subtraction Angiography (DSA) positioning technology in the dynamic acquisition of cerebrospinal fluid in Ganges River monkeyss.In the research,28 Ganges River monkeys were randomly divided into two groups.The monkey in both groups were injected with 30 g/L pentobarbital sodium solution through the left forelimb intravenous after general anesthesia, and were shaved conventionally around the spine and then disinfected.In the experimental group,under the guidance of DSA technology,the puncture was performed from the lumbar intervertebral space to the subarachnoid to collect the cerebrospinal fluid.All the 14 cases were successful.However,in the control group, the puncture was directly performed,8 cases succeeded and 6 cases failed.And then after the adjustment of the position and direction of the needle under the guidance of DSA technology, all the negative cases succeeded.Therefore,all the 28 Ganges River monkeys were successfully punctured under the guidance of DSA technology.In the end,the epidural anesthesia catheter was put through the subarachnoid space to the cisterna magna,and the pump was put on the back.Through the pump, dynamic acquisition of cerebrospinal fluid can be achieved repeatedly and quickly during the awake and full physiological state of Ganges River monkey.Due to sample catheter was placed in the cisterna magna, cerebrospinal fluid is transparent,high quality,and easily meet the needs of the further test, which has the potential practical value.

Ganges River monkey; lumbar puncture; cerebrospinal fluid

2016-09-07

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(863計劃)(2012AA020702)

焦 河(1965-)，男，四川成都人，主管技師，主要從事DSA影像技術(shù)及動物影像技術(shù)工作。

S854.78

A

1007-5038(2017)04-0057-05

*通訊作者