番鴨細小病毒安徽分離株結(jié)構(gòu)蛋白基因的克隆及序列分析

戴 銀，張丹俊，趙瑞宏，沈?qū)W懷，胡曉苗，侯宏艷，潘孝成，周學(xué)利

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥 230031)

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番鴨細小病毒安徽分離株結(jié)構(gòu)蛋白基因的克隆及序列分析

戴 銀*，張丹俊*，趙瑞宏，沈?qū)W懷，胡曉苗，侯宏艷，潘孝成，周學(xué)利

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥 230031)

為研究番鴨細小病毒(MDPV)安徽分離株的遺傳變異特征，通過PCR擴增獲得了MDPV結(jié)構(gòu)蛋白(VP)基因全長序列AH-MDPV-VP，并將該序列與GenBank中登錄的12條MDPV和鵝細小病毒(GPV)VP基因序列進行比對。結(jié)果顯示，AH-MDPV-VP基因全長2 199 bp，包括完整的VP1、VP2和VP3蛋白編碼區(qū)。MDPV與GPV的VP基因部分序列一致，但具有明顯的差異。進化分析顯示，MDPV安徽分離株與基因重組型MDPV上海分離株SAAS-SHNH為同一分支，親緣關(guān)系較近。同源性分析顯示二者核苷酸序列同源性最高，為99.9%，且AH-MDPV-VP與GPV毒株SHFX1201的序列同源性也有89.5%。此外安徽分離株與其他MDPV的VP1、VP2和VP3基因同源性有逐步下降的趨勢，而與GPV則相反呈上升趨勢。進一步顯示MDPV安徽分離株與基因重組型MDPV上海分離株SAAS-SHNH相似，可能為MDPV和GPV基因重組型水禽細小病毒。

番鴨細小病毒；結(jié)構(gòu)蛋白基因；克??；序列分析

番鴨細小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV) 屬于細小病毒科細小病毒亞科依賴病毒屬成員[1]。MDPV可引起番鴨的細小病毒病，該病是一種嚴重危害番鴨養(yǎng)殖業(yè)的急性傳染性病，可通過多種方式傳播，無明顯的季節(jié)性，但冬春兩季多發(fā)，1周齡～3周齡雛番鴨較為易感，一旦感染，發(fā)病率和病死率均很高。耐過病愈鴨大多生長發(fā)育緩慢，其經(jīng)濟價值受到很大影響[2-5]。MDPV基因組均為線性、單鏈DNA，大小約為5 kb，包括兩個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，左側(cè)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)，右側(cè)編碼結(jié)構(gòu)蛋白(VP)。依據(jù)不同的起始密碼子和蛋白裂解位置，VP可生成VP1、VP2、VP3三種結(jié)構(gòu)蛋白。編碼VP1、VP2和VP3的核苷酸分別為2 199、1 764、1 605 bp，三者共用同一終止密碼，但起始密碼子的位置不同。VP2基因序列中包含VP3的全部基因序列，而VPl基因序列中又包含VP2、VP3的全部基因序列，形成套式結(jié)構(gòu)[6-7]。番鴨細小病毒病在世界各地均可發(fā)生，近年來，我國福建、浙江、安徽等地均有不同程度發(fā)生，給番鴨養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[8-11]。本研究對安徽番鴨細小病毒分離株的結(jié)構(gòu)蛋白全長基因進行了克隆和序列分析，旨在研究該病毒的基因遺傳變異特征，為進一步研究該病毒的基因功能和致病機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株基因組DNA 番鴨細小病毒安徽分離株基因組DNA，安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所實驗室分離、鑒定并保存。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒、工具酶和試劑 大腸埃希菌DH5α菌株，本實驗室提供;載體pMD18-T、DNA Marker DL 2000、T4連接酶等，寶生物工程(大連)有限公產(chǎn)品司；dNTP、Taq酶、瓊脂糖(電泳純)等，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；DNA清潔/PCR產(chǎn)物清潔試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒，杭州維特潔生化技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 參照GenBank中登錄的MDPV基因組序列(登錄號：KC171936)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計兩對特異性擴增引物。P-1：5′-TGCTATTGATGATATGGAGA-3′；P-2：5′-CAGGTTCGGAGCCTTCGGTG-3′；P-3：5′- CCGAACCTGTGGCAGCATCTAAAATGGCAGAG-3′；P-4：5′- TGATTGGCTGGTTCGAACGAACGAA-3′。預(yù)期目的擴增片段大小分別為890 bp和1 733 bp，拼接后基因片段包括完整的VP基因的編碼區(qū)，命名為AH-MDPV-VP。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2.2 AH-MDPV-VP基因的分段擴增 以保存的基因組DNA為模板，分別采用P1 、P2和P3 、P4為上、下游引物擴增。PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 3.0 μL, 上、下游引物各1.0 μL，DNA 2.5 μL，TaqDNA 聚合酶0.5 μL，加雙蒸水補足60 μL。分別按以下程序進行擴增：94℃ 5 min;94℃ 1 min，51℃ 30 s，72℃ 2 min，32個循環(huán);72℃ 10 min。94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 3 min，32個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA凝膠回收試劑盒，然后連入pMDl8-T載體，16℃水浴過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，涂布于含氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板上，37℃溫箱培養(yǎng)過夜，初步篩選陽性克隆，并用小量堿法提取質(zhì)粒，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.3 基因序列分析 測序后的基因序列在NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對搜索, 利用SeqMan進行序列拼接，獲得VP基因全長核苷酸序列，并推導(dǎo)其氨基酸序列。選擇番鴨和鵝細小病毒株共12條參比序列作為分析樣本，參考毒株信息見表1。使用Clustal X 1.83軟件比對序列，采用DNA Star、MegAlign等軟件分析各序列特征。

表1 參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 番鴨AH-MDPV-VP基因的擴增

以 MDPV的基因組DNA為模板，P1、 P2和P3、 P4為引物PCR分別擴增獲得了一條約 890 bp 和 1 733 bp 大小的特異性DNA片段(圖1)，將擴增的基因產(chǎn)物純化、測序。測序結(jié)果與GenBank中登錄的相應(yīng)基因序列進行比對，均為目的基因序列。

A.P1、 P2引物的PCR產(chǎn)物;B.P3、 P4引物的PCR產(chǎn)物；M.DNA 標準DL 2 000;1、2.基因組DNA的PCR產(chǎn)物

2.2 基因序列特征分析

序列分析可見，AH-MDPV-VP基因全長2 199 bp，包含完整MDPV VP1、VP2和VP3蛋白質(zhì)閱讀框，分別為2 199、1 764、1 605 bp，編碼733、588、534個氨基酸。MDPV和GPV的VP基因核苷酸均未見缺失，VP2的起始密碼子ACG均位于VPl基因序列的436 bp處，VP3的起始密碼子ATG位于VPl基因序列的595 bp處，三者共用同一終止密碼子。同時可見MDPV與GPV的VP基因序列存在較多一致的核苷酸位點，但部分序列差異較為明顯，尤其是MDPV位于VP3區(qū)域的核苷酸替代較為顯著。

2.3 序列進化分析

采用MEGA分析軟件，將獲得的13條番鴨和鵝的細小病毒VP基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果可見，所比對序列分為番鴨和鵝細小病毒兩個類群。AH-MDPV-VP與國內(nèi)MDPV上海分離株SAAS-SHNH的基因序列KC171936，以及廣西分離株MDPV-GX5的基因序列KM093740聚集為同一組，尤其是與分離株SAAS-SHNH的遺傳距離較近；與國內(nèi)較早分離株的基因序列JF926698、AY510603、JF926697，以及歐洲分離株基因序列X75093和Z68272遺傳距離較遠。

遺傳距離在圖的下方；聚類分析的可靠性用bootstrap置信區(qū)限檢測，同時每1 000 bootstrap測試結(jié)果大于50%的在節(jié)點上顯示

2.4 同源性分析

將安徽分離株全長基因序列AH-MDPV-VP與其他在GenBank獲得的番鴨和鵝的VP基因序列進行同源性比較(表2)。結(jié)果表明，AH-MDPV-VP與MDPV分離株SAAS-SHNH的基因序列同源性最高，為99.9%，與MDPV福建P1毒株同源性較低，為88.9%，而與GPV上海SHFX1201毒株序列的同源性達89.5%。進一步分析可見，安徽分離株與其他MDPV的VP1、VP2、VP3同源性分別介于99.9%～88.9%、99.9%～86.6%、99.9%～85.4%之間，從VP1到VP3同源性有逐步下降的趨勢；與鵝細小病毒VP1、VP2、VP3同源性分別介于89.5%～88.6%、91.0%～89.0%、93.2%～91.3%之間，從VP1到VP3的同源性則有逐步上升的趨勢。

3 討論

本研究通過分段擴增獲得了MDPV安徽分離株的全長結(jié)構(gòu)蛋白基因序列AH-MDPV-VP，該基因全長2 199 bp，包括完整MDPV VP1、VP2和VP3蛋白質(zhì)編碼區(qū)，分析可見3個蛋白質(zhì)具有不同的起始密碼子，但共用同一終止密碼子。這與目前已有相關(guān)報道基本一致[6,12]。此外，序列比對可見，雖然MDPV與GPV的VP基因部分序列一致，但仍具有明顯的差異，尤其是MDPV位于VP3區(qū)域的核苷酸替代較為明顯，變異程度較高。系統(tǒng)發(fā)育樹進一步顯示，AH-MDPV-VP與近年在國內(nèi)分離的MDPV上海毒株SAAS-SHNH和廣西MDPV-GX5分離株的基因序列KC171936和KM093740為同一小分支，尤其是與分離株SAAS-SHNH親緣關(guān)系較近，二者來源于共同祖先；與國內(nèi)較早分離的4個毒株，以及歐洲分離的2毒株基因序列遺傳距離較遠。該研究結(jié)果表明MDPV的遺傳變異規(guī)律與分離株發(fā)生的地理和時間呈現(xiàn)一定程度的相關(guān)性，但是否確切仍需要研究更多不同地點和時間分離的MDPV毒株。

表2 VP基因核苷酸序列同源性

研究發(fā)現(xiàn)MDPV與GPV存在一定交叉反應(yīng)， MDPV只能感染番鴨，但GPV既可感染鵝，也可感染番鴨，在生產(chǎn)中小鵝瘟活疫苗和抗血清也能夠提高雛番鴨對MDPV的抵抗能力[13-15]。依據(jù)13個VP基因核苷酸序列的同源性比對結(jié)果，可見MDPV和GPV的全長VP基因序列同源性介于89.5%～79.6%之間，安徽分離株與上海分離株SAAS-SHNH的同源性最高，達99.9%，與MDPV福建P1毒株同源性相對較低，為88.9%，但與GPV上海SHFX1201毒株也有89.5%的同源性。MDPV和GPV基因核苷酸序列如此高的同源性，也正說明了二者具有交叉反應(yīng)特性的根本原因。此外，有研究表明，某些病毒在自然遺傳進化過程中會發(fā)生基因變異、交叉重組現(xiàn)象，從而產(chǎn)生一種新的致病病毒。這種現(xiàn)象可能更有利病毒逃避寄主的免疫應(yīng)答，提高本身適應(yīng)環(huán)境的能力。一些動物細小病毒就存在這種基因重組現(xiàn)象，其中MDPV分離株SAAS-SHNHB被認為是由MDPV和GPV基因重組而來的水禽細小病毒[1,16]。VP1、VP2、VP3三者同源性分析表明，安徽分離株與其他番鴨細小病毒株，從VP1到VP2再到VP3基因同源性有逐步下降的趨勢，而與鵝細小病毒從VP1到VP3的同源性則有逐步上升的趨勢，表明安徽分離株與MDPV和GPV不同節(jié)段的VP基因各有較高的同源性。這些特點顯示了安徽分離株與親緣關(guān)系較近分離株SAAS-SHNH相似，可能為基因重組型水禽細小病毒。本試驗初步研究了安徽MDPV分離株結(jié)構(gòu)蛋白VP基因的分子結(jié)構(gòu)特征，將為深入研究該基因型番鴨細小病毒的遺傳變異特點，以及獲得有效的預(yù)防控制方法奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and Sequence Analysis of Structural Protein Gene of Muscovy Duck Parvovirus Anhui Isolate

DAI Yin,ZHANG Dan-jun,ZHAO Rui-hong,SHEN Xue-huai,HU Xiao-miao,HOU Hong-yan,PAN Xiao-cheng,ZHOU Xue-li

(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience,AnhuiAcademyofAgriculturalScience,Hefei,Anhui,230031,China)

To investigate the variation status of muscovy duck parvovirus(MDPV) Anhui isolate,the structural protein (VP) gene was cloned by PCR,which was named as AH-MDPV-VP. And we compared AH-MDPV-VP with the sequence of twelve VP genes of MDPV and goose parvovirus (GPV) in the GenBank database.The results showed that AH-MDPV-VP gene was 2 199 bp,coding full-length open reading frames of VP1,VP2,and VP3.The partial sequences were consistent,but obvious difference was observed between MDPV and GPV genes.Evolution analysis revealed that Anhui isolate and the genetic recombinant MDPV of Shanghai isolate SAAS-SHNH gathered together in the same branch,they had a close genetic relationship.Similarity analysis showed that the nucleotide sequence homology between two isolates was the highest,99.9%,and the sequence homology of Anhui isolate and GPV isolate SHFX1201 was 89.5%.Moreover,the VP1,VP2 and VP3 homology of Anhui isolate and other MDPV had a tendency to decline gradually.On the contrast,the rising trend of the homology with GPV was found.The result further showed that MDPV Anhui isolate and genetic recombinant Shanghai SAAS-SHNH isolate were similar,they may be waterfowl parvoviruses,recombined with MDPV and GPV.

Muscovy duck parvovirus；structural protein gene；cloning；sequence analysis

2016-07-19

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院人才發(fā)展專項資金項目(17F0404);安徽省家禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資金項目

戴 銀(1980-)，女，安徽蒙城人，副研究員，博士，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究。

S852.659.4;Q789

A

1007-5038(2017)04-0024-04

*通訊作者