羅勒精油的微波輔助提取工藝及其抑菌效果研究

艾 薇,劉經(jīng)倫,李曉嬌

(保山學(xué)院 資源環(huán)境學(xué)院,云南保山 678000)

羅勒精油的微波輔助提取工藝及其抑菌效果研究

艾 薇,劉經(jīng)倫,李曉嬌

(保山學(xué)院 資源環(huán)境學(xué)院,云南保山 678000)

采用微波輔助提取羅勒精油,優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件對(duì)精油得率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。將所得精油作為抑菌劑,結(jié)合濾紙片法和二倍稀釋法,確定了羅勒精油的抑菌活性和最低抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC)。結(jié)果表明:選用粗粉碎干料羅勒,在料液比1∶16 g/mL,NaCl濃度4%,浸泡時(shí)間6 h,微波功率567 W,微波時(shí)間120 s的條件下,羅勒精油的最佳得率為0.3758%(n=3)。羅勒精油對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用,最低抑菌濃度分別為31.25、62.5、125 μg/mL,最低殺菌濃度分別為31.25、125、500 μg/mL,表明抑菌作用大小為:大腸桿菌(E.coli)>枯草芽孢桿菌(B.subtilis)>金黃色葡萄球菌(S.auTeus)。該研究為羅勒的綜合利用與開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。

羅勒,精油,微波輔助提取,抑菌效果

羅勒(OcimumbasilicumLinn)為唇形科羅勒屬一年生芳香草本植物,又名甜羅勒、九層塔、丁香等[1]。羅勒分布于熱帶和溫帶地區(qū)[2],因其藥食兼用的特性,被廣泛的用于各少數(shù)民族食物烹制和藥材使用。在云南,羅勒別名轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)香、帕友新(傣語(yǔ)),是傣族、景頗族不可缺少的一種調(diào)味料,在傣味食材中用于熟食或作涼拌。在維藥和中醫(yī)理論中,羅勒也用于疏風(fēng)解表、化濕和中、行氣活血、解毒消腫等[3-4]。近幾年關(guān)于羅勒藥理研究表明羅勒提取物具有抗炎殺菌、抗病毒、抗血栓形成、抗腫瘤轉(zhuǎn)移、抗氧化、降血糖、降血脂等作用[2-3,5],以鮮嫩花葉最佳,味辛,性溫。

經(jīng)查閱文獻(xiàn),對(duì)羅勒的研究集中在引種栽培[6]、化學(xué)成分[7]、藥理[3,5]、黃酮提取[4,8]、多糖提取[9]及腫瘤治療[10]等幾個(gè)方面,而在羅勒精油提取方面的研究報(bào)道很少。張文成等[11]研究表明,分別采用水蒸氣蒸餾法和SFC-CO2萃取,羅勒揮發(fā)油的出油率和主要成分差異都較大。任吉君等[12]探索出SFC-CO2萃取羅勒芳香油的最優(yōu)條件為陰干與萃取壓力15 MPa。曹維金等[13]研究表明,3種羅勒子油提取法：溶劑浸出法、索氏抽提法和氯仿-甲醇法中,氯仿-甲醇法提取率最高、提取時(shí)間最短。國(guó)外學(xué)者對(duì)采自伊朗的兩種人工種植的羅勒揮發(fā)油進(jìn)行分析,結(jié)果顯示含量最高的皆為甲基胡椒酚[14];也有國(guó)外學(xué)者報(bào)道羅勒中含有菊苣酸、迷迭香酸、咖啡酸[15]。Jamal等[16]研究表明,花和葉的組織中酚酸主要為迷迭香酸。近年來(lái)植物精油具有良好的抑菌抗炎活性,且較化學(xué)抑菌劑具有副作用和殘留毒性小的優(yōu)勢(shì),進(jìn)而使其在抑菌研究方面得到了廣泛的關(guān)注,而用微波輔助提取羅勒精油并研究其抑菌活性卻沒(méi)有報(bào)道。本文采用微波輔助的方法提取羅勒枝葉干料中的精油,且以精油得率為指標(biāo),采用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn),確定最佳工藝參數(shù),并在此基礎(chǔ)上對(duì)其抑菌效果進(jìn)行研究,旨在為精油的深加工及藥理作用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅勒 原料購(gòu)于保山市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),經(jīng)洗凈放陰涼處風(fēng)干,用粉碎機(jī)粉碎,再用密封袋密封保存?zhèn)溆茫欢讈嗧?、無(wú)水乙醇、蛋白胨、氯化鈉、乙醚、硫酸鎂 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大腸埃希氏菌Escherichiacoli標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922，金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC259226538，枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6633 廣東微生物菌種保藏中心。

Q/OANN 10-2008電子天平 奧豪斯儀器上海有限公司;G70F20N2L-DG(SO)微波爐 格蘭仕微波爐電器有限公司;LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;HZQ-X100A恒溫培養(yǎng)箱、HZQ-F160A高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 精油得率的計(jì)算 根據(jù)楊艷等[17]采用微波輔助水蒸氣蒸餾法提取孜然精油工藝的研究,本研究采用類(lèi)似的工藝流程,略作改動(dòng)。稱(chēng)取羅勒枝葉粉末20 g,料液比1∶20(m∶v,g/mL,下同)浸泡在4% NaCl溶液中2 h,微波功率為567 W,輔助加熱120 s,水蒸氣蒸餾法提取羅勒精油,用乙醚萃取。羅勒精油的得率參考何君等[18]的計(jì)算方法,即:

式中:A1-提取精油的質(zhì)量,g;A2-羅勒枝葉粉末的質(zhì)量,g。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取羅勒枝葉粉末20 g,以羅勒精油得率為考察指標(biāo),固定料液比為1∶20 g/mL,NaCl濃度為4%,浸泡時(shí)間為2 h,微波功率為567 W輔助加熱120 s,依次對(duì)其進(jìn)行不同水平的NaCl濃度(2%、3%、4%、5%、6%)、浸泡時(shí)間(2、4、6、8、10 h)、料液比(1∶16、1∶18、1∶20、1∶22、1∶24 g/mL)、微波功率(126、252、406、567、700 W)、微波時(shí)間(60、90、120、150、180 s)的單因素實(shí)驗(yàn),測(cè)定方法同 1.2.1。

1.2.3 最優(yōu)工藝條件的選擇 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析,篩選了浸泡時(shí)間、料液比、微波功率、微波時(shí)間等因素進(jìn)行優(yōu)化(正交實(shí)驗(yàn)的各因素及其水平見(jiàn)表1),建立L9(34)的正交實(shí)驗(yàn),確定羅勒精油提取的最優(yōu)工藝條件參數(shù)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Factor and levels of orthogonal experiment

1.2.4 精油抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 菌種活化及菌懸液的制備 用接種環(huán)挑取適量的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化,37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取一環(huán)已活化的菌苔放入100 mL無(wú)菌生理鹽水中,搖勻菌懸液,150 r/min振蕩培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.4.2 不同濃度羅勒精油的制備 用二倍稀釋法[19]配制不同濃度羅勒精油。稱(chēng)取2000 μg羅勒精油,用二甲亞砜制備1000 μg/mL的精油溶液,采用二倍稀釋法稀釋為以下幾個(gè)濃度:1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL。放置冰箱中冷凍保存,備用。

1.2.4.3 不同羅勒精油濃度對(duì)3種細(xì)菌抑制活性實(shí)驗(yàn) 濾紙片法[20]測(cè)定抑菌活性,每皿設(shè)計(jì)四片濾紙片。紙片法判定標(biāo)準(zhǔn)[21]:極敏:抑菌圈直徑>20 mm;高敏:抑菌圈直徑15～19 mm;中敏:抑菌圈直徑10～15 mm;低敏:抑菌圈直徑<10 mm。具體方法如下:用無(wú)菌的移液槍吸取0.1 mL菌懸液至已冷卻的LB固體培養(yǎng)基中,用無(wú)菌涂布器均勻涂布,晾干后,將3片浸入不同濃度的羅勒精油,直徑為6 mm的圓形無(wú)菌濾紙片,等距離放置于培養(yǎng)基中,以二甲亞砜作空白對(duì)照組。細(xì)菌的培養(yǎng)條件參照1.2.4.1,如有抑菌圈說(shuō)明對(duì)供試菌具有抑菌作用,無(wú)抑菌圈則說(shuō)明對(duì)供試菌無(wú)抑菌作用。

1.2.4.4 最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定和最低殺菌濃度(MBC)測(cè)定 將制備好的羅勒精油濃度1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL的溶液用濾紙片法測(cè)定精油的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度,具體方法參照1.2.4.3,重復(fù)三次,取平均值。細(xì)菌置于37 ℃下培養(yǎng)24 h,以完全沒(méi)有菌生長(zhǎng)的最低濃度作為該精油的最低抑菌濃度(MIC)[22]。把上述沒(méi)有長(zhǎng)菌的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)48 h后觀察,以完全無(wú)菌生長(zhǎng)的濃度為最低殺菌濃度(MBC)[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅勒精油的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 NaCl濃度對(duì)羅勒精油得率的影響 如圖1所示,隨著NaCl濃度的增加,羅勒精油得率也相對(duì)增加,但是當(dāng)NaCl濃度超過(guò)4%,精油得率就開(kāi)始減少。加入NaCl溶液能夠增大植物細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差,使精油能夠容易溶出,也可能對(duì)精油揮發(fā)性及溶解性有一定的影響[18],所以NaCl濃度控制在4%左右較合適。

圖1 NaCl濃度對(duì)羅勒精油得率的影響Fig.1 Effect of concentration of NaCl on extraction yield of essential oil注：標(biāo)注不同字母表示數(shù)據(jù)有顯著差異(p<0.05),圖2～圖5同。

2.1.2 浸泡時(shí)間對(duì)羅勒精油得率的影響 如圖2所示,在一定浸泡時(shí)間內(nèi),精油得率有所增加,浸泡時(shí)間為8 h時(shí)達(dá)到最大值0.39%,當(dāng)浸泡時(shí)間超過(guò)這個(gè)時(shí)間段,精油得率反而減少。這是由于精油具有揮發(fā)性,長(zhǎng)期暴露在空氣中易揮發(fā)。因此,浸泡時(shí)間在4～8 h左右精油得率較高。

圖2 浸泡時(shí)間對(duì)羅勒精油得率的影響Fig.2 Effects of soaking time on extraction yield of essential oil

2.1.3 料液比對(duì)羅勒精油得率的影響 如圖3所示,在其他因素不變的情況下,料液比在1∶16～1∶20之間精油得率增加緩慢;當(dāng)料液比增大到1∶20后,得率急劇減少;在料液比為1∶20時(shí),羅勒精油得率為0.30%,達(dá)到最大值。隨著料液比的增大,精油得率逐漸增大,由于滲入細(xì)胞內(nèi)的水分迅速升溫,使細(xì)胞內(nèi)壓急劇增大,導(dǎo)致細(xì)胞破裂,使水蒸汽更容易將精油帶出;但隨著料液比進(jìn)一步增加,得率下降,同時(shí)增加能耗和時(shí)間,液面厚度可能一定程度上影響了微波的吸收[17]。因此羅勒精油提取的料液比控制在1∶20。

圖3 料液比對(duì)羅勒精油得率的影響Fig.3 Effects of solid-liquid ratio on extraction yield of essential oil

圖4 微波功率對(duì)羅勒精油得率的影響Fig.4 Effects of microwave power on extraction yield of essential oil

2.1.4 微波功率對(duì)羅勒精油得率的影響 如圖4所示,微波功率為126～252 W時(shí)無(wú)明顯變化,當(dāng)微波功率增大到406 W時(shí)急劇增大,在567 W時(shí)達(dá)到最大值,超過(guò)567 W提取率又開(kāi)始降低。這是因?yàn)橥饧与妶?chǎng)作用增強(qiáng),微波引起的極性分子如水的極化作用增強(qiáng),此時(shí),分子熱運(yùn)動(dòng)動(dòng)能增大,可以在較短的時(shí)間內(nèi)得到精油;但隨著功率繼續(xù)增大,得率下降,溶液中物質(zhì)也可能容易發(fā)生氧化分解[17]。因此,微波功率在567 W時(shí)精油得率最佳。

2.1.5 微波時(shí)間對(duì)羅勒精油得率的影響 如圖5所示,隨著微波時(shí)間的增長(zhǎng)(60～120 s),精油得率開(kāi)始增加,達(dá)到120 s時(shí)羅勒精油的得率到達(dá)最高點(diǎn),繼續(xù)延長(zhǎng)微波時(shí)間,精油得率又開(kāi)始逐漸下降。這可能是由于微波對(duì)羅勒細(xì)胞具有破膜作用,處理時(shí)間長(zhǎng),羅勒細(xì)胞破膜速度增大,羅勒精油得率增加,當(dāng)微波處理時(shí)間超過(guò)120 s時(shí),羅勒細(xì)胞被破壞強(qiáng)烈,導(dǎo)致精油乳化現(xiàn)象嚴(yán)重,且由于細(xì)胞膜的破壞,導(dǎo)致雜質(zhì)進(jìn)入到精油中,因此得率下降[23]。因此,微波時(shí)間在120 s時(shí)用微波輔助水蒸汽蒸餾法提取羅勒精油的得率最佳。

圖5 微波時(shí)間對(duì)羅勒精油得率的影響Fig.5 Effects of microwave time on extraction yield of essential oil

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化羅勒精油提取工藝

由表2可得,從羅勒精油提取得率的直觀分析結(jié)果看,最佳工藝為5號(hào)實(shí)驗(yàn)A2B2C3D1,但從極差分析可知羅勒精油提取的最優(yōu)工藝方案為:A2B1C3D1。為此,在相同條件下,對(duì)A2B2C3D1和A2B1C3D1分別進(jìn)行3次重復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,羅勒精油的平均出油率分別為0.3698%和0.3758%,由此可得微波輔助蒸餾法提取羅勒精油最優(yōu)工藝組合A2B1C3D1,即浸泡時(shí)間6 h,料液比1∶16,微波功率567 W,微波時(shí)間120 s。在此提取條件下,羅勒精油得率達(dá)到最大值。

表4 不同濃度羅勒精油的抑菌活性Table 4 The antimicrobial activity of essential oil

注:“-”表示無(wú)抑菌作用。

表5 羅勒精油對(duì)細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)Table 5 The minimum inhibitory concentration(MIC)of essential oil

注:+表示有抑菌作用,有抑菌圈;-表示無(wú)抑菌作用,表6同。

表2 正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析表Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment

注:K1,K2,K3分別是同一水平羅勒精油得率平均值,R極差為同一水平因素的最小值與最大值之間的差。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

由表3可見(jiàn),以精油得率為考察指標(biāo),經(jīng)方差分析可得,FA、FB、FC、FD均小于F0.05=4.460,說(shuō)明浸泡時(shí)間、料液比、微波功率和微波時(shí)間對(duì)精油得率的影響不顯著,其中綜合評(píng)價(jià)極差大小結(jié)果顯示影響羅勒精油得率的因素順序?yàn)镃>D>B>A,即微波功率>微波時(shí)間>料液比>浸泡時(shí)間。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal array design

2.4 羅勒精油抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 羅勒精油對(duì)3種不同細(xì)菌的抑菌活性測(cè)定結(jié)果 不同濃度的羅勒精油對(duì)3種細(xì)菌均出現(xiàn)了大小不等的抑菌圈。由表4可知,對(duì)于大腸桿菌,羅勒精油濃度為1000 μg/mL時(shí)為高敏,精油濃度為500～62.5 μg/mL時(shí)為中敏,精油濃度為31.25 μg/mL為低敏;對(duì)于金黃色葡萄球菌,精油濃度為1000～250 μg/mL時(shí)為中敏,精油濃度為125 μg/mL為低敏;對(duì)于枯草芽孢桿菌,精油濃度為1000 μg/mL時(shí)為高敏,精油濃度為500～250 μg/mL時(shí)為中敏,濃度為125～62.5 μg/mL時(shí)為低敏。測(cè)定結(jié)果表明,羅勒精油對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最好,其次是枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌。

2.4.2 最低抑菌濃度的測(cè)定(MIC) 由表5可知,羅勒精油對(duì)金黃色葡萄球菌,枯草芽孢桿菌和大腸桿菌都有一定的抑菌作用,最低抑菌濃度分別為125,62.5,31.25 μg/mL。

2.4.3 最低殺菌濃度的測(cè)定(MBC) 表6列出了三種供試菌在不同精油濃度下生長(zhǎng)狀況和MBC值。從表6中可以看出,羅勒精油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌都表現(xiàn)出一定的殺菌能力,尤其對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的殺菌能力,MBC值為31.25 μg/mL。

表6 羅勒精油對(duì)細(xì)菌的最低殺菌濃度(MBC)Table 6 The minimum bactericidal concentration(MBC)of essential oil

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用微波輔助水蒸氣蒸餾法提取羅勒精油,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證,最終確定了微波輔助水蒸氣蒸餾法提取羅勒精油的最優(yōu)工藝是:浸泡時(shí)間6 h,料液比1∶16,微波功率567 W,微波時(shí)間120 s,選用干料粗粉碎羅勒,在促溶劑4% NaCl溶液浸泡的條件下,進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)并整理計(jì)算得出精油平均得率為0.3758%(n=3)。由羅勒精油抑菌活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)得出,羅勒精油對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌都有一定的抑制作用,抑菌效果從大到小的順序?yàn)?大腸桿菌(E.coli)>枯草芽孢桿菌(B.subtilis)>金黃色葡萄球菌(S.auTeus),不同濃度的羅勒精油對(duì)三種細(xì)菌的抑制作用不同,并與濃度成正比。該抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果與丁華等對(duì)羅勒精油抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相同,羅勒精油對(duì)大腸桿菌與金黃色葡萄球菌均具有強(qiáng)效抑菌作用[22]。陸占國(guó)等在對(duì)黑龍江培育的白花羅勒花精油抑菌活性的研究上也得到了類(lèi)似的結(jié)論,羅勒花精油抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)活性大小順序?yàn)?大腸桿菌>白色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌[24]。近年來(lái),精油的抗菌性被很多學(xué)者所研究,越來(lái)越得到人們的重視與關(guān)注,在云南羅勒作為少數(shù)民族不可缺少的調(diào)味品,是傣味中的重要食材,具有獨(dú)特的發(fā)展前景。

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Microwave-assisted extraction and antibacterial effect of essential oil fromOcimumbasilicumLinn

AI Wei,LIU Jing-lun,LI Xiao-jiao

(Resources and Environmental Sciences,Baoshan University,Baoshan 678000,China)

In this study,microwave-assisted extraction was applied to extract the essential oil fromOcimumbasilicumLinn with petroleum ether. By using orthogonal methodology,the effects of concentration of NaCl,soaking time,solid-liquid ratio,microwave power and extraction time were investigated. It was found that when soaking time was 6 h,solid-liquid ratio was 1∶16,microwave power was 567 W and microwave time was 120 s,the optimal oil yield was 0.3758%(n=3). Then,essential oil’s antibacterial effect was determined by using paper discassay and fold dilution plate method. The results indicated that the minimum inhibitory concentration(MIC)forEscherichiacoli,BacillussubtilisandStaphylococcusaureuswere 31.25,62.5,125 μg/mL,respectively,and the minimum bactericidal concentration(MBC)for these were 31.25,125,500 μg/mL,respectively. The antibacterial order was:Escherichiacoli>Bacillussubtilis>Staphylococcusaureus. The research provides the theoretical basis for development and comprehensive utilization ofOcimumbasilicumLinn.

OcimumbasilicumLinn;essential oil;microwave-assisted extraction;antibacterial effect

2016-08-26

艾薇(1979-)，女，碩士，副教授，從事食品科學(xué)的研究及教學(xué)工作，E-mail:fwaiwei@aliyun.com。

保山學(xué)院食品科學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目；云南省教育廳科學(xué)研究基金資助性項(xiàng)目(2016ZZX221)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)07-0240-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.039