果蠅鈉通道 DmNav22在雙氧木脂素A作用機(jī)理研究中的應(yīng)用

閆秀芳，郄杏桃，吳文君，胡兆農(nóng)

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院 農(nóng)藥研究所，陜西楊凌 712100； 2. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 陜西省植物源農(nóng)藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

果蠅鈉通道 DmNav22在雙氧木脂素A作用機(jī)理研究中的應(yīng)用

閆秀芳，郄杏桃，吳文君，胡兆農(nóng)

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院 農(nóng)藥研究所，陜西楊凌 712100； 2. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 陜西省植物源農(nóng)藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

建立以爪蟾卵母細(xì)胞為載體的果蠅鈉通道表達(dá)系統(tǒng)，研究雙氧木脂素A的殺蟲分子機(jī)理。將果蠅鈉通道 DmNav22與TipE亞基基因分別進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得 DmNav22與TipE亞基基因的cRNA，將 DmNav22與TipE的cRNA等質(zhì)量混合，顯微注射至新鮮的非洲爪蟾卵母細(xì)胞，在ND96溶液、18 ℃培養(yǎng)12～18 h后采用雙電極電壓鉗技術(shù)記錄其電流，測(cè)定雙氧木脂素A對(duì)鈉電流的影響。結(jié)果表明，注射cRNA的非洲爪蟾卵母細(xì)胞，可記錄到明顯的果蠅鈉通道電壓門控內(nèi)向電流，未注射的對(duì)照組細(xì)胞則未記錄到鈉電流；雙氧木脂素A使鈉通道失活電壓依賴性向超極化方向移動(dòng)。說明，果蠅鈉通道在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中成功表達(dá)，為進(jìn)一步研究雙氧木脂素A的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

果蠅鈉通道；雙電極電壓鉗；非洲爪蟾卵母細(xì)胞；雙氧木脂素A

電壓門控鈉通道在電信號(hào)傳遞中起著關(guān)鍵作用，是許多天然神經(jīng)毒素的靶標(biāo)[1]。昆蟲鈉通道結(jié)構(gòu)和哺乳動(dòng)物相似，也由4個(gè)高度同源的結(jié)構(gòu)域(DI-DIV)組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域均含有6個(gè)跨膜α-螺旋片段(S1-S6)[2-3]。昆蟲第1個(gè)鈉通道基因是從果蠅的溫度敏感突變體克隆的para基因(命名為DmNav)[4]。TipE是昆蟲鈉通道的一個(gè)調(diào)節(jié)亞基基因，將para與TipE共同表達(dá)在爪蟾卵母細(xì)胞中不僅增強(qiáng)了表達(dá)的豐度,而且發(fā)現(xiàn)在不影響鈉電流的時(shí)間和電壓依賴性下,鋒電流增大,失活加快[5-6]。

非洲爪蟾卵母細(xì)胞被廣泛用于各型離子通道和受體的異源表達(dá)，用以研究受體及離子通道的生理學(xué)和藥理學(xué)特性，或探討藥物的作用機(jī)制和作用靶標(biāo)[7]。迄今，已有4種DmNav同源基因在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中功能性表達(dá)，即家蠅的Vssc1[8]、德國(guó)小蠊的BgNav[9-10]、瓦螨的VmNav[11]和黃熱病蚊伊蚊的aNav[12]基因。但在國(guó)內(nèi)，爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)體系在昆蟲鈉通道研究方面的應(yīng)用較少。

雙氧木脂素A(haedoxan A，HA)是日本學(xué)者Taniguchi等[13]從草本植物透骨草(PhrymaleptostachyaL.)中分離鑒定的一個(gè)二氧雙環(huán)辛烷木脂素類化合物。Taniguchi等[13]和肖新敏等[14-16]的殺蟲活性測(cè)定表明，HA具有超高的殺蟲活性，與合成擬除蟲菊酯類殺蟲劑的殺蟲活性處于同一水平。關(guān)于HA的殺蟲作用機(jī)理，Hu等[17]初步研究表明，HA能引起鈉通道失活曲線顯著地向超極化方向移動(dòng)，推測(cè)其作用于電壓門控鈉通道。然而，HA作用鈉通道的機(jī)理及其作用位點(diǎn)如何，尚需進(jìn)一步的研究。因此，本試驗(yàn)建立以非洲爪蟾卵母細(xì)胞為載體的果蠅鈉通道表達(dá)系統(tǒng)，初步探討HA對(duì)昆蟲鈉通道作用的濃度效應(yīng)，旨在為進(jìn)一步研究HA的殺蟲作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

雙氧木脂素A(HA)：從透骨草中分離獲得，純度(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))≥98%。其分子式C33H34O14，相對(duì)分子質(zhì)量654，結(jié)構(gòu)如圖1[13]。將HA溶于DMSO中制備成30 mmol/L的母液，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，試?yàn)時(shí)將其溶解于相應(yīng)的ND96溶液中稀釋得到所需藥物終濃度。

菌種、質(zhì)粒、試驗(yàn)動(dòng)物及培養(yǎng)基：大腸桿菌Stbl3購(gòu)自廣州易錦生物技術(shù)有限公司；攜帶 DmNav22、TipE編碼序列的質(zhì)粒由美國(guó)密歇根州立大學(xué)Dong Ke教授惠贈(zèng)，表達(dá)載體為pGH19；性成熟的雌性非洲爪蟾購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)院生化細(xì)胞所干細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)；大腸桿菌的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體或固體培養(yǎng)基。

圖1 雙氧木脂素A結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of haedoxan A

1.2 主要試劑及儀器

質(zhì)粒小量抽提試劑盒、IA型膠原酶、限制性內(nèi)切酶NotⅠ等常規(guī)分子生物學(xué)試劑購(gòu)自Sigma公司；cRNA合成試劑盒mMESSAGE mMACHINE T7 Kit購(gòu)自美國(guó)Ambion公司；檢測(cè)電流的電生理儀器為雙電極電壓鉗(Molecular Devices Corporation，型號(hào)：AXOCLAMP900A)；微電極拉制儀(美國(guó)Sutter公司，P-97)；體視顯微鏡(重慶重光實(shí)驗(yàn)有限公司，型號(hào)：ZSA300)；顯微注射儀(美國(guó)Sutter公司，Nanoliter2000)等。

1.3 記錄及培養(yǎng)液的配制

細(xì)胞浴液(ND96)成分：96 mmol/L NaCl，2 mmol/L KCl，1.8 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2及5 mmol/L HEPES，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5。

卵母細(xì)胞洗滌液：去除CaCl2的ND96液，用于洗滌及消化細(xì)胞。

卵母細(xì)胞培養(yǎng)液：加入2.5 mmol/L丙酮酸鈉、0.5 mmol/L茶堿以及50 μg/mL慶大霉素的ND96液，用于培養(yǎng)卵母細(xì)胞。

卵母細(xì)胞記錄液：ND96液作為電流記錄時(shí)的記錄液。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、提取及線性化

將含有 DmNav22、TipE基因的表達(dá)載體pGH19轉(zhuǎn)化大腸桿菌Stbl3，涂于含有氨芐(100 μg/mL)的固體LB培養(yǎng)基平板上，倒置平板，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)17～24 h，挑選單克隆置于液體LB培養(yǎng)基中，250 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h，提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定正確后，送上海立菲生物測(cè)序有限公司鑒定，測(cè)序結(jié)果與已知數(shù)據(jù)比對(duì)正確。取 DmNav22和TipE的cDNA用NotⅠ限制性內(nèi)切酶線性化2 h，線性化質(zhì)粒電泳檢測(cè)并純化后，用作體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA的模板。酶切反應(yīng)體系參照說明書進(jìn)行設(shè)定。

1.5 cRNA的制備及純化

純化過的線性化 DmNav22、TipE質(zhì)粒，用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cRNA，操作步驟參照說明書進(jìn)行，37 ℃反應(yīng)2 h。轉(zhuǎn)錄后的 DmNav22、TipEcRNA用氯化鋰沉淀法進(jìn)行純化。用分光光度計(jì)測(cè)定純化后cRNA的質(zhì)量濃度和A260/A280，然后分裝，于-80 ℃保存。

1.6 非洲爪蟾卵母細(xì)胞的分離及cRNA的顯微注射

將6個(gè)月以上未進(jìn)行試驗(yàn)的性成熟雌性非洲爪蟾浸在2 g/L的三卡因溶液中10～30 min使之麻醉，在麻醉狀態(tài)下，于下腹部正中偏外0.5 cm左右縱向切開一約1 cm的小口，剪下3～5個(gè)卵巢瓣。在含1 mg/mL IA型膠原酶的卵母細(xì)胞洗滌液中18 ℃下消化40 min。用卵母細(xì)胞洗滌液反復(fù)清洗后置于卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中。在解剖顯微鏡下挑出黑白半球界限分明、發(fā)育階段處于Ⅴ～Ⅵ期且表面光滑、顆粒飽滿的卵母細(xì)胞備用。用微量注射器將等質(zhì)量混合的 DmNav22、TipE的cRNA，注入挑選好的卵母細(xì)胞內(nèi)。注射后的卵母細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)液中，18 ℃恒溫培養(yǎng)12～18 h后用于電流檢測(cè)。試驗(yàn)過程中所有器具需要預(yù)先進(jìn)行滅菌處理，卵母細(xì)胞培養(yǎng)液每12 h 更換1次，且需及時(shí)在解剖顯微鏡下將不健康或死去的細(xì)胞挑出丟棄。

1.7 電流記錄

電流記錄及數(shù)據(jù)分析參照Du等[18]的方法。利用雙電極電壓鉗系統(tǒng)測(cè)定果蠅鈉通道電流。使用微電極拉制儀拉制玻璃微電極，灌充含瓊脂粉(5 g/L)的3 mol/L KCl溶液，電極電阻小于0.5 MΩ。將卵母細(xì)胞置于容積約1 mL底部正中粘有一小片網(wǎng)狀薄膜的記錄槽中，使用微操動(dòng)儀分別將電流電極與電壓電極同時(shí)插入細(xì)胞中，設(shè)置鉗制電壓為-120 mV，給予細(xì)胞去極化刺激，室溫下記錄果蠅鈉通道電流，同時(shí)以沒有注射cRNA的卵母細(xì)胞為對(duì)照。

HA母液(30 mmol/L)用ND96記錄液稀釋成終濃度為0.3和3 μmol/L測(cè)試溶液。φ(DMSO)<0.5%，這樣試驗(yàn)時(shí)不影響鈉通道功能特征。藥劑應(yīng)用參照Tan等[19]所描述的方法。HA加入10 min后開始記錄。

穩(wěn)態(tài)激活電壓依賴性測(cè)定，卵母細(xì)胞鉗置在-120 mV，從-80 mV去極化至65 mV，階躍電壓是5 mV。以經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化的電導(dǎo)G/Gmax來反映通道激活情況。G=I/(U-Urev)，其中I是電流值，U是膜電壓(也就是記錄到I時(shí)的測(cè)試電壓)，Urev是鈉電流的反轉(zhuǎn)電壓。通道激活數(shù)據(jù)擬合兩元Boltzmann方程G/Gmax=[1+exp(U-U1/2)/K]-1，其中U是膜電壓，U1/2是半激活電壓，K是斜率。

穩(wěn)態(tài)失活電壓依賴性測(cè)定，卵母細(xì)胞先施予一組從-120 mV至40 mV的預(yù)前刺激，時(shí)間200 ms，階躍電壓是5 mV，接著再給予一組到-10 mV的測(cè)試刺激，時(shí)間20 ms。以經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化的電流值I/Imax來反應(yīng)通道失活情況。通道失活數(shù)據(jù)擬合兩元Boltzmann方程I/Imax=[1+exp(U-U1/2)/K]-1，其中I是電流值，Imax是最大電流值，U是失活電壓，U1/2是半失活電壓，K是斜率[17]。

1.8 數(shù)據(jù)采集和分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 12.0(version 12.0,SPSS Inc.,Chicago,IL,USA,2003)和Origin 8.0(Origin Lab Corp,Northampton,MA,USA,2013)；所有數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。配對(duì)樣本t-test法進(jìn)行顯著性差異分析，P≤0.05認(rèn)為差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 DmNav22、TipE質(zhì)粒的酶切線性化

對(duì)所提質(zhì)粒 DmNav22、TipE用NotⅠ進(jìn)行酶切線性化。酶切2 h，分別取2 μL酶切液于10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳。如圖2所示，酶切后DNA為1條帶，說明酶切完全。

2.2 DmNav22、TipE cRNA質(zhì)量濃度測(cè)定

以純化的線性化 DmNav22、TipE質(zhì)粒為模板，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成 DmNav22、TipE的cRNA。取1 μL純化后的cRNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其質(zhì)量濃度及A260/A280， DmNav22、TipEcRNA的質(zhì)量濃度分別為645 ng/μL和1 712 ng/μL，本試驗(yàn)中A260/A280測(cè)值均在2.0附近，表明cRNA無蛋白質(zhì)污染(表1)。符合后續(xù)卵母細(xì)胞注射對(duì)cRNA的要求。

M為DNA marker，1和2分別代表TipE和 DmNav22的線性化質(zhì)粒 M is DNA marker,1 and 2 respectively reprent linearized plasmids ofTipEand DmNav22

圖2 DmNav22和TipE的線性化質(zhì)粒
Fig.2 Linearized plasmids of DmNav22 andTipE

表1 DmNav22和TipE的質(zhì)粒、線性化質(zhì)粒及cRNA的質(zhì)量濃度和A260/A280Table 1 Mass concentration and A260/A280 of DmNav22 and TipE plasmids,linearized DNAs and cRNAs

2.3 果蠅鈉通道在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的功能性表達(dá)

經(jīng)雙電極電壓鉗系統(tǒng)測(cè)定果蠅鈉通道電壓門控電流發(fā)現(xiàn)，未注射空白對(duì)照組的卵母細(xì)胞，進(jìn)行脈沖激活時(shí)，沒有記錄到鈉電流，而注射cRNA的卵母細(xì)胞進(jìn)行脈沖激活時(shí)，產(chǎn)生明顯的內(nèi)向電流(圖3-A)。大約在-50 mV時(shí)檢測(cè)到果蠅鈉通道電流，-15 mV左右達(dá)到最大值(圖3-B)。穩(wěn)態(tài)激活電壓依賴性測(cè)定，卵母細(xì)胞鉗置在-120 mV，從-80 mV去極化至65 mV，階躍電壓是5 mV。穩(wěn)態(tài)激活電壓依賴性數(shù)據(jù)擬合曲線如圖3-C。半激活電壓(U1/2)是(-31.6±2.0) mV，斜率(K)是(5.0±0.6) mV(表2)。穩(wěn)態(tài)失活電壓依賴性測(cè)定，卵母細(xì)胞先施予一組從-120 mV至40 mV的預(yù)前刺激，時(shí)間200 ms，階躍電壓是5 mV，接著再給予一組到-10 mV的測(cè)試刺激，時(shí)間20 ms。穩(wěn)態(tài)失活電壓依賴性數(shù)據(jù)擬合曲線如圖3-D。半失活電壓(U1/2)是(-47.5±1.3) mV，斜率(K)是(5.2±0.3) mV(表2)。

A：鈉電流曲線。鈉電流測(cè)定，卵母細(xì)胞鉗置在-120 mV，從-80 mV去極化至65 mV，階躍電壓5 mV；B：電流電壓曲線(I-U)，電流由圖3-A記錄，峰值電流對(duì)應(yīng)去極化電壓作圖，細(xì)胞數(shù)n=5；C：果蠅鈉通道活化電壓依賴性，細(xì)胞數(shù)n=3；D：果蠅鈉通道失活電壓依賴性，細(xì)胞數(shù)n=3。

A:Sodium current traces. Sodium currents were recorded from a holding potential of -120 mV during depolarizations from -80 to 65 mV in 5 mV increments.B:Sodium current-voltage relation (I-Ucurve). Current were recorded as described for Fig.3-A,and the peak current amplitude is plotted versus the depolarization potential. The number of oocytes was 5.The voltage-dependence of activation C and inactivation D ofDrosophilasodium channels. The number of oocytes was 3.

圖3 果蠅鈉通道在爪蟾卵母細(xì)胞中的功能性表達(dá)
Fig.3 Functional expression ofDrosophilasodium channels in Xenopus oocytes

表2 果蠅鈉通道 DmNav22活化、失活電壓依賴性參數(shù)Table 2 Parameters of voltage dependence of activation and inactivation of Drosophila DmNav22 sodium channels

注：U1/2為活化或失活半最大電壓，K為活化或失活斜率，細(xì)胞數(shù)n=5。

Note:U1/2is the half-maximal voltage for activation or inactivation andKis the slope factor for activation or inactivation.Five oocytes.

2.4 HA對(duì)鈉通道失活電壓依賴性的影響

穩(wěn)態(tài)失活電壓依賴性測(cè)定，卵母細(xì)胞先施予一組從-120 mV至40 mV的預(yù)前刺激，時(shí)間200 ms，階躍電壓是5 mV，接著再給予一組到-10 mV的測(cè)試刺激，時(shí)間20 ms。結(jié)果表明，0.3 μmol/L和3 μmol/L HA均使鈉通道失活電壓向超極化方向移動(dòng)(圖4)。0.3 μmol/L和3 μmol/L 藥劑分別使鈉通道失活半最大電壓向超極化方向移動(dòng)1.1 mV(0.3 μmol/L)和2.9 mV(3 μmol/L)(表3)。

3 討 論

本試驗(yàn)成功建立以非洲爪蟾卵母細(xì)胞為載體的果蠅鈉通道體外表達(dá)系統(tǒng)，并利用此系統(tǒng)測(cè)定HA對(duì)鈉通道失活門控特性的影響。未注射空白對(duì)照組的卵母細(xì)胞，進(jìn)行脈沖激活時(shí)，沒有記錄到鈉電流，注射cRNA的卵母細(xì)胞進(jìn)行脈沖激活時(shí)，產(chǎn)生明顯的內(nèi)向電流。試驗(yàn)測(cè)得的通道活化半最大電壓(U1/2)、斜率(K)及通道失活半最大電壓(U1/2)、斜率(K)與文獻(xiàn)報(bào)到的基本一致[17]，證明以非洲爪蟾卵母細(xì)胞為載體的果蠅鈉通道體外表達(dá)系統(tǒng)成功建立。

HA對(duì)鈉通道失活門控測(cè)定結(jié)果表明，0.3 μmol/L和3 μmol/L HA均可以使鈉通道失活電壓向超極化方向移動(dòng)，其趨勢(shì)與文獻(xiàn)報(bào)道[17]一致。失活電壓移動(dòng)幅度隨藥劑濃度的增加而增大，表明HA對(duì)鈉通道失活門控的影響具有濃度依賴性。

國(guó)內(nèi)外新農(nóng)藥研究與開發(fā)的實(shí)踐證明，從植物中提取、分離殺蟲活性成分，并以這些活性成分為探針發(fā)現(xiàn)新靶標(biāo)是新農(nóng)藥創(chuàng)制的重要途徑[20]。HA是從透骨草中分離鑒定出的一種具有二氧雙環(huán)辛烷新骨架的木脂素類化合物，殺蟲活性高，試蟲攝毒后的主要中毒癥狀為拒食，肌肉松弛，最終死亡[13]。鑒于其較高的殺蟲活性、新穎的結(jié)構(gòu)、獨(dú)特的作用癥狀，對(duì)HA殺蟲作用機(jī)理的探討有助于推動(dòng)中國(guó)新型生物合理殺蟲劑的創(chuàng)制。

以非洲爪蟾卵母細(xì)胞為載體的果蠅鈉通道體外表達(dá)系統(tǒng)的建立，為從分子水平探討HA在鈉通道上的受體位點(diǎn)奠定基礎(chǔ)，不僅有利于進(jìn)一步獲得鈉通道的一些結(jié)構(gòu)特征，而且有利于闡明HA可能的分子作用機(jī)理，從而可在對(duì)HA進(jìn)行三維定量構(gòu)效關(guān)系研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出新的高效殺蟲劑。

表3 HA對(duì)果蠅鈉通道穩(wěn)態(tài)失活參數(shù)的影響Table 3 Effects of HA on steady-state inactivation parameters for Drosophila sodium channels

注：U1/2為半最大失活電壓，K為失活斜率，細(xì)胞數(shù)n=3。*表示對(duì)照組與處理組差異顯著(P≤0.05)。

Note:U1/2is the half-maximal voltage for inactivation andKis the slope factor for inactivation.Each value represents the mean ± SEM for three oocytes. Asterisks indicate significant differences between control and treatment(P≤0.05).

A：0.3 μmol/L HA加藥前后果蠅鈉通道失活電壓依賴性；B：3 μmol/L HA加藥前后果蠅鈉通道失活電壓依賴性，失活曲線擬合兩元Boltzmann方程，細(xì)胞數(shù)n=3。

A and B：the voltage dependence of inactivation ofDrosophilasodium channels before and after the application of 0.3 μmol/L (A) and 3 μmol/L (B) of HA. The inactivation curves were fitted with two-state Boltzmann equation. The number of oocytes was 3.

圖4 HA引起果蠅鈉通道失活電壓依賴性向超極化方向移動(dòng)
Fig.4 HA induced a hyperpolarization direction shift of the voltage dependence of inactivation ofDrosophilasodium channels

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(責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Application ofDrosophilaSodium Channel DmNav22 in Investigating the Action Mode of Haedoxan A

YAN Xiufang,QIE Xingtao,WU Wenjun and HU Zhaonong

(1.Institute of Pesticide Science,College of Plant Protection,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China; 2.Shaanxi Province Key Laboratory of Botanical Pesticide Research and Development,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China)

To investigate the molecular mechanism of haedoxan A (HA) against insect pests,gene expression system ofDrosophilasodium channel inXenopuslaevisoocytes was established. cRNAs ofDrosophilasodium channel subunits DmNav22 andTipEwere obtained by transcription in vitro,which were mixed with equal amount of substance and then microinjected in the freshX.laevisoocytes. The oocytes were incubated in ND96 buffer at 18 ℃ for 12-18 hours after microinjection and the sodium channel current was detected by two-electrode voltage clamp (TEVC). The results showed that the voltage-gated inward current was recorded in the oocytes injected cRNA,while no current was recorded in the blank oocytes. HA shifted the voltage dependence ofDrosophilasodium channels inactivation to the hyperpolarizing direction. These results demonstrated that theDrosophilasodium channel was expressed inX.laevisoocytes successfully and can be used to further study the insecticidal mechanism of HA.

Drosophilasodium channel; Two-electrode voltage clamp;Xenopuslaevisoocytes; Haedoxan A (HA)

YAN Xiufang,female,master student. Research area:pesticide toxicology. E-mail:xiufangyan@163.com

HU Zhaonong,male,Ph.D,professor,doctoral supervisor. Research area:pesticide toxicology. E-mail:huzhaonong@nwsuaf.edu.cn

日期：2017-03-30

2016-03-16

2016-05-08

國(guó)家自然科學(xué)基金(31672055)；陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)(2015NY033)。

閆秀芳，女，碩士研究生，從事農(nóng)藥毒理學(xué)研究。E-mail:xiufangyan@163.com

胡兆農(nóng)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事農(nóng)藥毒理學(xué)研究。E-mail:huzhaonong@nwsuaf.edu.cn

S481

A

1004-1389(2017)04-0635-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170330.1509.040.html

Received 2016-03-16 Returned 2016-05-08

Foundation item The National Natural Science Foundation of China (No.31672055); Agricultural Science and Technology Key Project of Shaanxi Province(No.2015NY033).