66份青海審定小麥及86份人工合成小麥抗稈銹病小種Ug99的基因組成分析

劉 韜，尚 玥，張 波，劉寶龍，陳文杰，張連全，劉登才,，張懷剛

(1.中國(guó)科學(xué)院 西北高原生物研究所,西寧 810008; 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 小麥研究所,成都 611130;3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

66份青海審定小麥及86份人工合成小麥抗稈銹病小種Ug99的基因組成分析

劉 韜1,3，尚 玥1，張 波1，劉寶龍1，陳文杰1，張連全2，劉登才1,2，張懷剛1

(1.中國(guó)科學(xué)院 西北高原生物研究所,西寧 810008; 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 小麥研究所,成都 611130;3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

為了分析抗稈銹病小種Ug99的基因在青海審定小麥和新合成的人工小麥中的分布狀況，采用6個(gè)抗Ug99基因( Sr33、Sr36、Sr39、Sr40、Sr42、Sr43)的分子標(biāo)記對(duì)青海省審定的66個(gè)小麥品種及86份人工合成小麥材料進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：在青海審定的66個(gè)小麥品種中，有4個(gè)品種含 Sr33，占檢測(cè)品種數(shù)的6.06%；1個(gè)品種含 Sr39，占檢測(cè)品種數(shù)的1.52%；5個(gè)品種含 Sr40，占檢測(cè)品種數(shù)的7.58%；4個(gè)品種含 Sr42，占檢測(cè)品種數(shù)的6.06%；3個(gè)品種含 Sr43，占檢測(cè)品種數(shù)的4.55%；同時(shí)含有2個(gè)抗性基因的品種僅有2個(gè)，占檢測(cè)品種數(shù)的3.03%。在86份合成小麥材料中，有38份材料含 Sr33，占檢測(cè)材料的44.19%； 31份材料含 Sr39，占檢測(cè)材料的36.05%；9份材料含 Sr40，占檢測(cè)材料的10.47%；3份材料含 Sr42，占檢測(cè)材料的3.49%；6份材料含 Sr43，占檢測(cè)材料的6.98%；同時(shí)含有2種抗性基因的材料有17份，占檢測(cè)材料的19.77%。在66個(gè)小麥品種和86份人工合成小麥材料均未檢測(cè)出 Sr36。人工合成小麥提供Ug99抗病基因資源，對(duì)改良普通小麥Ug99抗病性具有潛在價(jià)值。

普通小麥；人工合成小麥；Ug99 抗性基因

小麥稈銹病(Pucciniagraminisf.sp.tritici)是全球范圍的小麥病害，對(duì)小麥破壞性極大,曾在大多數(shù)種植小麥的國(guó)家和地區(qū)出現(xiàn)過毀滅性的災(zāi)難[1]。稈銹病可使小麥減產(chǎn)高達(dá)75%，一些地區(qū)甚至絕收。而中國(guó)恰好處于小麥稈銹病流行的特定區(qū)域內(nèi)[2]。20世紀(jì)30至60年代曾在中國(guó)爆發(fā)過的幾次稈銹病，造成幾乎毀滅性的減產(chǎn)?？苟掍P病基因 Sr31在育種中的廣泛應(yīng)用使得稈銹病在過去的40多年沒有大面積爆發(fā)[2]。

但是 Sr31基因?qū)?999年在烏干達(dá)出現(xiàn)的新致病小種Ug99不具抗性，稈銹病再次對(duì)小麥的生產(chǎn)產(chǎn)生巨大的威脅。按北美稈銹菌小種命名法則Ug99被命名為TTKS[3]，按照現(xiàn)在新的鑒別寄主的體系該命名為TTKSK[4]。同時(shí)隨著孢子的不斷傳播，變種也在不斷產(chǎn)生，2006年和2007年人們又發(fā)現(xiàn)了對(duì)抗性基因 Sr24和 Sr36具有高毒力的新變異株[5,12]。Ug99被發(fā)現(xiàn)的隨后幾年，其夏孢子借助盛行西風(fēng)的高空氣流，于2001年傳到東非的肯尼亞，2003年突破東非的防線傳入北非的埃塞俄比亞、蘇丹等國(guó)，2007年越過紅海傳到也門，目前已傳播至伊朗的部分地區(qū)[6]。如今，Ug99及其小種的傳播速度比條銹病菌傳播更快。專家們預(yù)計(jì)，由于Ug99及其小種突破了紅海這道屏障，其在未來幾年或幾十年中，傳播到世界各地將更加容易，甚至速度將更加迅速。當(dāng)今世界90%以上的小麥對(duì)Ug99不具抗性[7]，2006年對(duì)中國(guó)118個(gè)小麥主栽品種在肯尼亞進(jìn)行Ug99抗性鑒定，結(jié)果表明高感病品種占98.3%[8]。中國(guó)作為全世界的人口及糧食大國(guó)，所面臨的潛在威脅將遠(yuǎn)超其他地區(qū)國(guó)家。而青海地處中國(guó)的西部，如果Ug99突破中國(guó)的邊界，將是首當(dāng)其沖的幾個(gè)省份之一。

本研究利用與Ug99抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，對(duì)66份青海省審定的小麥品種和86份人工合成小麥材料進(jìn)行抗性基因的組成鑒定，了解普通小麥品種及人工合成小麥的抗性基因分布現(xiàn)狀，希望從人工合成小麥中發(fā)現(xiàn)Ug99抗性資源，為Ug99抗性基因分子聚合育種提供理論依據(jù)及材料信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

青海審定小麥品種66份(表1)及人工合成小麥86份(表2)，Ug99抗性基因的材料：RL5405(Sr33)、Lang(Sr36)、RL5711(Sr39)、RL6087(Sr40)、Ac-Cadillac(Sr42)、Sr43(Sr43)共6份材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 采集66份青海審定小麥、86份人工合成麥以及抗病親本適量的新鮮葉片，在液氮中冷凍研磨后，用CTAB法[10]提取基因組DNA，用微量紫外檢測(cè)儀NANODROP2000C(Thermo)測(cè)量DNA質(zhì)量濃度。將DNA均稀釋到200 mg/L，用10 g/L的瓊脂糖膠在110 V電壓下電泳30 min，檢測(cè)DNA的質(zhì)量。

1.2.2 特異性引物的選擇 Sr33、Sr36、Sr39、Sr40、Sr42、Sr43是目前發(fā)現(xiàn)能有效抵抗Ug99及其絕大部分毒力變種的稈銹菌抗性基因[9，11-14]。上述基因已分別在小麥染色體上定位： Sr33定位到1DL[11]， Sr36定位到2BS[15]， Sr39定位到2B[12]， Sr40定位到2BS[15]， Sr42定位到6DS[13]， Sr43定位到7D[15]。根據(jù)查閱相關(guān)NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、參考文獻(xiàn)以及GrainGenes 2.0(http://wheat.pw.usda.gov)得到相應(yīng)的引物序列，通過試驗(yàn)對(duì)比選取穩(wěn)定性較高的6對(duì)引物(表3)，引物均由奧科鼎盛生物公司合成。

表1 66份青海省審定小麥品種Table 1 66 wheat cultivars released in Qinghai province

表2 86份人工合成小麥Table 2 86 synthetic hexaploid wheat lines

表3 微衛(wèi)星引物Table 3 SSR markers

1.2.3 PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè) 用6對(duì)引物對(duì)66份青海審定小麥品種以及86份人工合成麥的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析。PCR擴(kuò)增體系(20 μL)為：10×Taqbuffer(200 mmol/L Tris-HCl;200 mmol/L KCl;15 mmol/L MgCl2)2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，2.5U/μLTaqDNA polymerase 0.4 μL，各引物(除FSD-RSA為FSD 12 pmol，RSA 3.5 pmol)正反序列均為5 pmol，DNA 200 ng。PCR程序?yàn)椋?5 ℃變性 4 min，然后35個(gè)循環(huán)的95 ℃變性 30 s，47～62 ℃復(fù)性(各引物根據(jù)試驗(yàn)前期摸索的最適退火溫度確定)30 s，72 ℃ 延伸20 s，最后72 ℃延伸 10 min。不同的PCR產(chǎn)物根據(jù) Sr33、Sr36、Sr39、Sr40、Sr42、Sr43的目的條帶大小，制作各自的瓊脂糖分離膠濃度；然后在TAE緩沖液中，110 V電壓下，電泳30 min；取出后在凝膠成像儀中拍照保存。

1.3 遺傳組成分析

對(duì)66份青海審定的小麥品種和86份人工合成小麥的6個(gè)抗病基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并對(duì)比抗病基因在2個(gè)群體中的存在頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物的篩選及最適退火溫度的確定

由于參考文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫中給出的引物有多對(duì)，最終篩選到最適合的6對(duì)引物和其最適退火溫度(表3)： Sr33的引物Xcfd15，62 ℃； Sr36的引物STM773-2，61 ℃； Sr39的引物Sr39#2r，56 ℃； Sr40的引物WMC-661，56 ℃； Sr42的引物FSD-RSA，47 ℃； Sr43的引物Cfa2040，58 ℃。

2.2 各抗性基因在普通小麥及人工合成小麥中的分布

用確定的6對(duì)引物和最適退火溫度對(duì)66份青海審定的小麥品種和86份人工合成小麥共152份材料分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，部分電泳結(jié)果見圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表4)，在青海審定的66小麥品種中，有4個(gè)品種含抗性基因 Sr33，所占比例為6.06%；1個(gè)品種含 Sr39，所占比例為1.52%；5份品種含 Sr40，占檢測(cè)品種數(shù)的7.58%；4份材料含 Sr42，所占比例為6.06%；3份含 Sr43，占檢測(cè)品種數(shù)的4.55%。

M.1 kb plus DNA ladder；1.陽性對(duì)照 RL5711 Positive control RL5711；2.陰性對(duì)照Ps4-1 Negetive control Ps4-1；3.空白對(duì)照 Blank；4～24.部分檢測(cè)樣品 Some detected samples

圖1 引物Sr39#2r對(duì)部分合成麥的檢測(cè)
Fig.1 Molecular identification of some synthetic hexaploid wheats with marker Sr39#2r

86份人工合成小麥的檢測(cè)結(jié)果(表5)發(fā)現(xiàn)，有38份含抗性基因 Sr33，比例高達(dá)44.19%；31份材料含 Sr39，占36.05%；9份含 Sr40，占檢測(cè)材料的10.47%；3份材料含 Sr42，占3.49%；6份材料含 Sr43，占檢測(cè)材料的6.98%。

在66個(gè)小麥品種和86份合成麥材料均未檢測(cè)出 Sr36抗性基因。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)的小麥品種中同時(shí)含有2個(gè)抗性基因的品種僅有2個(gè)(表4)，占檢測(cè)品種數(shù)的3.03%；而在檢測(cè)的合成麥中同時(shí)含有2種抗性基因的材料有17份(表5)，占檢測(cè)材料的19.77%；在普通小麥品種和人工合成麥中均未檢測(cè)到同時(shí)含有3個(gè)及以上抗性基因的材料(表4、5)。

以上結(jié)果說明合成麥中的抗性基因分布明顯要高于現(xiàn)有的小麥品種中的抗性基因分布(圖2)，也表明同時(shí)聚合多個(gè)抗性基因的品種很少，每個(gè)品種的抗性基因過于單一。

表4 66份青海審定小麥品種抗Ug99基因檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)(陽性 +，陰性 -)Table 4 Molecular detection results of stem rust resistance genes in 66 wheat cultivars released in Qinghai province (presence +,absence -)

表5 86份人工合成小麥抗稈銹基因檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)(陽性 +，陰性 -)Table 5 The detection results of stem rust resistance genes in 86 synthetic hexaploid wheat lines (presence +,absence -)

(續(xù)表5 Continued table 5)

樣品名稱Samplename雜交組合Crosscombinations抗稈銹基因StemrustresistancegeneSr33Sr36Sr39Sr40Sr42Sr43Syn?SAU?46PI191781×AS2399+-----Syn?SAU?48PI221403×AS2399------Syn?SAU?49PI221403×AS2404+-----Syn?SAU?50PI306533×AS2405--+---Syn?SAU?51PI350001×AS2405+-----Syn?SAU?54PI352335×AS2386+-----Syn?SAU?55PI352358×AS65------Syn?SAU?57PI352367×AS2386--+--+Syn?SAU?59PI352369×AS60--+--+Syn?SAU?60PI355465×AS2405+-----Syn?SAU?61PI355476×AS2404+-----Syn?SAU?66PI355527×AS2399+-----Syn?SAU?67PI377655×AS2399+-----Syn?SAU?68PI377655×AS2386+-----Syn?SAU?69PI415152×AS60--++--Syn?SAU?70PI434998×AS2386------Syn?SAU?73PI184543×AS2386+-----Syn?SAU?74PI211691×AS2386------Syn?SAU?77PI532136×AS65-----+Syn?SAU?78AS2240×AS84--+---Syn?SAU?79AS2295×AS76---+--Syn?SAU?80AS2296×AS2388+-----Syn?SAU?81AS2298×AS79--+---Syn?SAU?82AS2299×AS79--+-+-Syn?SAU?83AS2308×AS72--+---Syn?SAU?84AS2308×AS81------Syn?SAU?85AS2310×AS60--+---Syn?SAU?86AS2313×AS2388+----+Syn?SAU?87AS2326×AS2388--+---Syn?SAU?88AS2334×AS2388--+---Syn?SAU?89AS2351×AS67--+--+Syn?SAU?90AS2378×AS82------Syn?SAU?91AS2380×AS77--+---Syn?SAU?92AS2381×AS65------Syn?SAU?93AS2382×AS2388+-----Syn?SAU?95PI154582×AS95--+---Syn?SAU?96PI221403×AS2397+----+Syn?SAU?98PI355507×AS2386+--+--Syn?SAU?99PI377655×AS2407+--+--Syn?SAU?103AS2380×AS95------Syn?SAU?106AS2291×AS2388+-----Syn?SAU?107PI113961×AS2403+-----

圖2 各抗性基因在小麥品種和合成麥中的分布Fig.2 The distribution of each resistance gene in common wheats and SHW lines

3 討 論

自從1B/1R易位系中的抗稈銹基因 Sr31在全球范圍大量引入后，稈銹菌引起的大面積減產(chǎn)或絕收現(xiàn)象得到了有力的控制[5,8]。在過去的40多年里，小麥稈銹病也未在中國(guó)出現(xiàn)大流行。因此，除東北及內(nèi)蒙古北部的春麥區(qū)外，其他麥區(qū)育種部門均不再重視稈銹病，致使主栽品種的抗稈銹病基因單一，仍以1BL/1RS 為主，總體抗病水平下降[16]。Ug99爆發(fā)后，以其迅猛的速度傳播，越過紅海后勢(shì)頭更甚，嚴(yán)重威脅著世界各地的小麥生產(chǎn)，其傳播路線與國(guó)際玉米小麥改良中心(CIMMYT)的地理信息系統(tǒng)(GIS)所預(yù)測(cè)的路線基本吻合[17]。據(jù)CIMMYT的GIS數(shù)據(jù)顯示：2008年1月至7月曾有連續(xù)72 h的伊朗哈馬達(dá)麥區(qū)上空的氣流傳入中國(guó)藏北、青海及甘肅的天氣現(xiàn)象[18]。本試驗(yàn)研究青海審定的66份小麥品種，發(fā)現(xiàn)僅4份含抗性基因 Sr33，1份含抗性基因 Sr39，5份含抗性基因 Sr40，4份含抗性基因 Sr42，3份含抗性基因 Sr43。據(jù)調(diào)查和研究結(jié)果表明：作為青海省春小麥主栽品種的‘高原448’和‘阿勃’，均不帶有以上6個(gè)抗稈銹基因中的任何一個(gè)(表4)?；蛟S這將是一個(gè)極大的危險(xiǎn)信號(hào)，一旦稈銹孢子借助夏季盛行的西風(fēng)傳入青海，極有可能會(huì)出現(xiàn)區(qū)域性的稈銹病區(qū)，以至中國(guó)內(nèi)地省份逐漸爆發(fā)稈銹病，造成糧食減產(chǎn)甚至部分地區(qū)絕收，引發(fā)恐慌。本結(jié)論也可能存在不準(zhǔn)確性，因?yàn)槟壳翱苟掍P的基因還未完全發(fā)現(xiàn)，這些小麥品種中可能還含有本試驗(yàn)未檢測(cè)的其他抗稈銹的微效基因。

本研究還表明，各個(gè)品種中含有的抗性基因極其單一。66份青海審定的小麥品種中僅2份含2個(gè)抗性基因。Ug99的爆發(fā)表現(xiàn)出稈銹病菌對(duì) Sr31的抗性，單基因的存在也許能防一時(shí)之危，一旦病菌出現(xiàn)抗性變異，危害將令人措手不及。所以發(fā)掘、引進(jìn)和合理利用優(yōu)良的種質(zhì)資源，在一個(gè)品種中聚合多個(gè)抗性基因，使得小麥抗性多樣化，才是長(zhǎng)久防治稈銹危害的重要手段。本試驗(yàn)同時(shí)也對(duì)86份人工合成小麥進(jìn)行相應(yīng)的抗性基因分布檢測(cè)。結(jié)果顯示，人工合成麥的抗性基因分布頻率明顯高于現(xiàn)有小麥品種。

人工合成小麥?zhǔn)抢眯←溄壩锓N遠(yuǎn)緣雜交創(chuàng)制而成。人工合成小麥的創(chuàng)制將近緣物種中的優(yōu)良基因帶入小麥的六倍體水平上，使得優(yōu)良基因直接導(dǎo)入普通小麥中成為可能，極大地豐富小麥的基因庫，從而為小麥引入更多可能的抗性基因。Ug99跨越紅海進(jìn)入伊朗后，對(duì)于中國(guó)西北地區(qū)小麥生產(chǎn)的潛在危害正與日俱增，因此，作為中國(guó)內(nèi)陸小麥作物區(qū)域大門的青海，研究當(dāng)?shù)匦←溒贩N的抗性基因分布，將人工合成麥的抗性基因?qū)肫胀ㄐ←?，通過基因聚合培育出含有多個(gè)抗性基因的優(yōu)質(zhì)抗病品種，防范于未然，是防止Ug99在中國(guó)爆發(fā)區(qū)域性流行和出現(xiàn)糧食安全問題的有效措施。

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(責(zé)任編輯：成 敏 Responsible editor:CHENG Min)

Distribution of Stem Rust Race Ug99 Resistance Gene in 66 Bread Wheat Cultivars Released in Qinghai Province and 86 Synthetic Hexaploid Wheat Lines

LIU Tao1,3,SHANG Yue1,ZHANG Bo1,LIU Baolong1,CHEN Wenjie1,ZHANG Lianquan2,LIU Dengcai1,2and ZHANG Huaigang1

(1.Northwest Institute of Plateau Biology,Chinese Academy of Sciences,Xining 810008,China;2.Triticeae Research Institute,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China;3.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)

To analyze the distribution of stem rust race Ug99 resistance genes in spring wheat cultivars which were released in Qinghai province and the new synthetic hexaploid wheat lines,six molecular markers of Ug99 resistant genes ( Sr33, Sr36, Sr39, Sr40, Sr42, Sr43) were applied to test sixty-six wheat cultivars which were released in Qinghai province and eighty-six synthetic hexaploid wheat lines. Of the sixty-six Qinghai released cultivars,four cultivars carry Sr33,one cultivars carry Sr39,five cultivars carry Sr40,four cultivars carry Sr42,and three cultivars carry Sr43,accounting for 6.06%,1.52%,7.58%,6.06%,and 4.55% of the detected samples,respectively. Only two cultivars contain two resistance genes,accounting for 3.03% of the number of detected cultivars. In eighty-six synthetic hexaploid wheats,thirty-eight lines contain Sr33,accounting for 44.19%. Thirty-one lines contain Sr39,accounting for 36.05%.Nine lines contain Sr40,accounting for 10.47%.Three lines contain Sr42,accounting for 3.49%. Six lines contain Sr43,accounting for 6.98%. Meanwhile,seventeen of eighty-six synthetic hexaploid wheat lines contain two resistance genes,accounting for 19.77%. Sr36 was not detected in both sixty-six bread wheat cultivars and eighty-six synthetic hexaploid wheat lines. The results indicated that synthetic hexaploid wheat could be a potential germplasm for wheat Ug99 resistance improvement.

Bread wheat； Synthetic hexaploid wheat；Ug99 resistance genes

LIU Tao,male,master student.Research area:wheat disease resistance genetics and breeding.E-mail:liutao415@mails.ucas.ac.cn

ZHANG Huaigang,male,researcher,doctoral supervisor.Research area:wheat genetics and breeding.E-mail:hgzhang@nwipb.cas.cn

日期：2017-03-30

2016-05-11

2016-06-28

中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性A類先導(dǎo)科技專項(xiàng)子課題(XDA08030106)；青海省重點(diǎn)研發(fā)與轉(zhuǎn)化計(jì)劃項(xiàng)目(2016-HZ-808)。

劉 韜，男，碩士研究生，從事小麥抗病遺傳育種研究。E-mail:liutao415@mails.ucas.ac.cn

張懷剛，男，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事小麥遺傳育種研究。E-mail:hgzhang@nwipb.cas.cn 張 波，男，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事麥類作物遺傳育種研究。E-mail:zhangbo@nwipb.cas.cn

S512.1；S326

A

1004-1389(2017)04-0523-10

ZHANG Bo,male,associate researcher,master supervisor.Research area:wheat genetics and breeding.E-mail:zhangbo@nwipb.cas.cn

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170330.1508.012.html

Received 2016-05-11 Returned 2016-06-28

Foundation item The Strategic Priority Research Program of Chinese Academy of Sciences (No.XDA08030106)；the Key Research Program of Qinghai Province(No.2016-HZ-808).