黃牡丹種子浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)及幼苗抗氧化酶活性的影響

鄧嵐，張翔宇，曾秀麗，張珊珊，王文華，趙凡，劉光立*

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所，西藏拉薩850032;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，成都溫江611130)

黃牡丹種子浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)及幼苗抗氧化酶活性的影響

鄧嵐1，張翔宇2，曾秀麗1，張珊珊1，王文華1，趙凡1，劉光立2*

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所，西藏拉薩850032;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，成都溫江611130)

研究黃牡丹種子浸提液對(duì)白菜(Brassica pekinensis)種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)及幾種主要抗氧化酶活性的影響，初步探討黃牡丹種子休眠的原因。以野生黃牡丹(Paeonia delavay Franch.var.lutea)種子為實(shí)驗(yàn)材料，提取種皮、胚乳水浸提物。黃牡丹種皮、胚乳中均含有抑制白菜種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的物質(zhì)，且對(duì)白菜種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的抑制作用隨著該物質(zhì)濃度的增加而更為顯著;相比種皮浸提液，相同濃度條件下的胚乳浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的抑制作用更加明顯。幾種主要抗氧化酶中，胚乳浸提液能夠直接抑制白菜幼苗POD和CAT酶活性，間接影響SOD酶活性。黃牡丹種子浸提物可能通過(guò)影響白菜種子抗氧化酶活性從而影響其幼苗的正常生長(zhǎng)，黃牡丹種子內(nèi)存在抑制物質(zhì)，從而影響黃牡丹種子的休眠。

黃牡丹;白菜;抗氧化酶;休眠;抑制作用

黃牡丹(Paeonia delavay Franch.var.lutea)為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)的亞灌木，是我國(guó)西南地區(qū)特有的野生牡丹，也是國(guó)家三級(jí)保護(hù)植物，屬于瀕危種［1］。該種的分布區(qū)域狹窄，主要分布于云南中部、西南部海拔為2500～3500 m的山地林緣，以及西藏東南部和四川西南部［2］。特有的黃色系花為豐富牡丹的花色提供了難得的基因資源，同時(shí)也是芍藥屬中珍貴的育種材料。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，證明黃牡丹種子休眠的原因是否是因?yàn)榇嬖趦?nèi)源物，為進(jìn)一步研究黃牡丹休眠與萌發(fā)特性的研究提供依據(jù)，進(jìn)而為黃牡丹的引種馴化提供基本理論依據(jù)。黃牡丹以多種形式的營(yíng)養(yǎng)繁殖為主，種子繁殖為輔，即為兼性營(yíng)養(yǎng)繁殖［3］。黃牡丹種群的個(gè)體數(shù)量小，局限性較大，一般只有幾十株至上百株?，F(xiàn)今，因?yàn)榘腚[蔽性環(huán)境遭受?chē)?yán)重破壞，黃牡丹的生態(tài)位變窄甚至消失，使其瀕危［4］。此外，成熟黃牡丹種子的蟲(chóng)食率高達(dá)80%以上，受蟲(chóng)害非常嚴(yán)重［5］。關(guān)于黃牡丹的研究，目前主要集中在系統(tǒng)分類(lèi)、染色體、孢粉學(xué)等有限的鄰域，對(duì)黃牡丹種子生理學(xué)的研究罕見(jiàn)。關(guān)于黃牡丹種子休眠與萌發(fā)的研究，均是研究黃牡丹生境情況，缺乏對(duì)其休眠或萌發(fā)的原因做進(jìn)一步的研究。種皮障礙、種胚發(fā)育狀況和內(nèi)源萌發(fā)抑制物為植物種子休眠的3種主要原因［6］。在紫斑牡丹(P.rockii)的研究實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其種子所含有的特殊化學(xué)物質(zhì)影響種子的后熟和發(fā)芽，抑制胚根和子葉的生長(zhǎng)［7］。根據(jù)白菜發(fā)芽率是否受到抑制，白菜幼苗抗逆性的強(qiáng)弱，證明大花黃牡丹是否存在內(nèi)源抑制物，判斷內(nèi)源抑制物主要存在的位置，以期為進(jìn)一步研究黃牡丹休眠與萌發(fā)特性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試黃牡丹種子采摘自西藏東南部林芝地區(qū)，于2015年9月初，果實(shí)黃熟時(shí)期晴天采集，采后陰干脫粒，種子去除雜質(zhì)后在低溫避光儲(chǔ)存?zhèn)溆?。市售的白?Brassica pekinensis)種子作為生物活性測(cè)定的材料。

1.2 種子浸提液的制備

選取外形飽滿有光澤的黃牡丹種子，人工剝離種皮和胚乳，在40℃條件下烘干至恒重。粉碎后各稱取10.0 g的種皮和胚乳分別放入100 mL三角瓶中，加入約80 mL去離子水，將3層保鮮薄膜封口的混合液置于20℃無(wú)光培養(yǎng)箱內(nèi)浸提24 h，收集的浸提液在4000 r·min－1離心10 min，過(guò)濾得到上清液，將上清液定容至100 mL，即為0.1 g·mL－1的粗提液，置于4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 種子內(nèi)源抑制物質(zhì)活性測(cè)定

圖1 黃牡丹種子浸提液對(duì)白菜種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of crude extracts of Paeonia decomposita seeds on germination rate of Brassica pekinensis

將上述粗提液用去離子水配制成濃度依次為0、0.025、0.050、0.075和0.100 g·mL－1的培養(yǎng)液。將不同濃度的培養(yǎng)液各吸取7 mL，分別加入9 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿均鋪有2層濾紙。每皿放置50粒白菜種子，每個(gè)濃度設(shè)5組平行實(shí)驗(yàn)，置25℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)，以胚根突破種皮為發(fā)芽標(biāo)志，觀察白菜種子萌發(fā)及幼根生長(zhǎng)情況［8］。分別于24 h統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，48 h測(cè)定胚根長(zhǎng)度，72 h測(cè)定下胚軸長(zhǎng)度。

1.4 白菜幼苗保護(hù)酶活性的測(cè)定

用去離子水將胚乳粗提液配制成濃度依次為0、0.01、0.02、0.04和0.08 g·mL－1的培養(yǎng)液。按1.3中的方法將白菜種子在不同濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，分別在24、48和72 h參照參考文獻(xiàn)［9］方法分別測(cè)定白菜幼苗的超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性。

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用Excel軟件和SPSS 13數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃牡丹種子浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

添加種皮浸提液后，各處理的白菜種子發(fā)芽率均略微降低，但差異不顯著;添加胚乳浸提液后，白菜種子的發(fā)芽率均顯著降低，并且隨著胚乳浸提液濃度的增加，白菜種子發(fā)芽率受抑制效果更加明顯。相同濃度條件下，胚乳浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)的抑制作用高于種皮浸提液(圖1)。

隨著黃牡丹種皮和胚乳浸提物濃度的增加，白菜幼苗胚根長(zhǎng)度均呈下降趨勢(shì);相同濃度條件下的胚乳浸提液對(duì)白菜幼苗胚根伸長(zhǎng)的抑制作用顯著高于種皮浸提液(圖2)。

添加黃牡丹種皮浸提液后，白菜幼苗的下胚軸長(zhǎng)度隨浸提物濃度的升高總體呈下降趨勢(shì);添加胚乳浸提液后，白菜幼苗的下胚軸長(zhǎng)度隨浸提物濃度的升高而降低;在相同濃度條件下，種皮提取物對(duì)白菜幼苗生長(zhǎng)的影響顯著低于胚乳浸提物。當(dāng)胚乳浸提物濃度為0.075和0.100 g·mL－1時(shí)，部分白菜幼苗根部褐化，不能正常生長(zhǎng)(圖3)。

圖2 黃牡丹種子浸提液對(duì)白菜幼苗胚根生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effectsof crudeextractsof Paeonia decomposita seedson radicle of Brassica pekinensis

圖3 黃牡丹種子浸提液對(duì)白菜幼苗下胚軸生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of crude extracts of Paeonia decomposita seeds on hypocotyls of Brassica pekinensis

2.2 黃牡丹胚乳浸提液對(duì)白菜幼苗幾種抗氧化酶活性的影響

如圖4所示，添加黃牡丹胚乳浸提液的白菜幼苗SOD活性與對(duì)照相比，除濃度0.01 g·mL－1處理外，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。同時(shí)隨著浸提物濃度的升高，SOD活性也呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，在浸提物濃度0.04 g·mL－1時(shí)達(dá)到最高，而在0.08 g·mL－1時(shí)又有所下降。

白菜幼苗POD、CAT活性表現(xiàn)出與SOD活性不同的變化趨勢(shì)(圖5～6)。在不同的測(cè)定時(shí)間內(nèi)，隨著浸提物濃度的升高，CAT活性與POD活性均顯著降低，并在0.08 g·mL－1時(shí)酶活性降至最低。盡管不同測(cè)定時(shí)間CAT、POD活性也有變化，但1、2和3 d測(cè)定的2種酶變化趨勢(shì)基本是一致的。

3 討論

圖4 黃牡丹種子浸提液對(duì)白菜幼苗中SOD活性的影響Fig.4 Effects of crude extracts of Paeonia decomposita seeds on activities of superoxide dismutaseof Brassica pekinensis

圖5 黃牡丹種子浸提液對(duì)白菜幼苗中POD活性的影響Fig.5 Effects of crude extracts of Paeonia decomposita seeds on activities of peroxidase of Brassica pekinensis

逆境因子造成植物體內(nèi)活性氧代謝失調(diào)，進(jìn)而傷害植物。高等作物化感作用的實(shí)驗(yàn)表明［10］，多酚類(lèi)化合物通過(guò)抑制受體植物SOD和CAT酶活性，使受體植物體內(nèi)活性氧增多，進(jìn)而使其膜脂過(guò)氧化，破壞膜的結(jié)構(gòu)。在連續(xù)種植4年的栽培牡丹鳳丹(P.ostii T.)的根際中，發(fā)現(xiàn)以阿魏酸、肉桂酸、香草醛、香豆素和丹皮酚為主的酚酸類(lèi)物質(zhì)［11－12］。因此，與宋會(huì)興等關(guān)于四川牡丹種子的研究結(jié)果［13］類(lèi)似，可以推測(cè)，影響受體白菜幼苗中抗氧化酶中SOD、POD、CAT活性的是黃牡丹種子胚乳浸提液中含有多酚類(lèi)化合物。

本實(shí)驗(yàn)中，隨胚乳浸提物濃度的增加，白菜幼苗的POD活性和CAT活性降低，且不同時(shí)間測(cè)定的2種酶變化趨勢(shì)基本一致。表明胚乳浸提物能夠直接抑制白菜幼苗CAT和POD酶活性，使植物的抗逆性，尤其是防止植物細(xì)胞衰老的能力降低，這與Roshchina等［10］的研究結(jié)果是一致的。隨胚乳浸提物濃度的增加，SOD活性總體表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，表明胚乳浸提物間接抑制白菜幼苗SOD酶活性，這與宋會(huì)興等［13］的研究結(jié)果是一致的，測(cè)SOD酶活性的時(shí)間不同，使得SOD酶活性的轉(zhuǎn)折點(diǎn)不同，但整體趨勢(shì)一致?？赡苡捎谂呷榻嵛镆种屏税撞擞酌缰蠧AT和POD酶活性，導(dǎo)致受體植物體內(nèi)活性氧增多，植物的應(yīng)激機(jī)制使得SOD酶活性增加［14］。但隨著受體植物的受害逐漸加重，SOD酶活性又降低［15－17］。

圖6 黃牡丹種子浸提液對(duì)白菜幼苗中CAT活性的影響Fig.6 Effects of crude extracts of Paeonia decomposita seeds on activities of catelaseof Brassica pekinensis

4 結(jié)論

長(zhǎng)期的系統(tǒng)演化過(guò)程，牡丹組植物種子大多具有的休眠萌發(fā)特性包括上胚軸及下胚軸休眠，且上胚軸休眠更為突出［18－19］。本研究結(jié)果表明，黃牡丹種子內(nèi)存在的抑制種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的物質(zhì)可以影響幼苗CAT、POD、SOD酶活性的物質(zhì)，即內(nèi)源抑制物。且這種物質(zhì)主要存在于種子胚乳中。這可能也是黃牡丹種子休眠的重要原因。但未對(duì)于物質(zhì)的性質(zhì)及黃牡丹種子萌發(fā)的抑制詳細(xì)機(jī)理進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯 李山云)

Effects of Crude Extracts of Paeonia delavay Seeds on Germ ination and Activities of Antioxidant Enzyme of Brassica pekinensis

DENG Lan1，ZHANG Xiang-yu2，ZENG Xiu-li1，ZHANG Shan-shan1，WANGWen-hua1，ZHAO Fan1，LIU Guang-li2*
(1.Institute of Vegetables，Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Tibet Lhasa 850032，China;2.School of Landscape Architecture，Sichuan Agricultural University，Sichuan Chengdu 611130，China)

To understand the cause of seed dormancy of Paeonia delavay Franch.var.lutea，the effectsofwater crude extractsof the seed coat and endosperm of P.delavay on the seed germination，seedling growth and antioxidant enzymes of Brassica pekinensis were examined in this paper.With wild P.delavay seed as the experimentalmaterial，the experiment extracted water crude extracts of the seed coat and endosperm.The results showed that the seed，especially the endosperm tissue of P.delavay contained substances that strongly suppressed seed germination.The crude extract of endosperm of P.delavay，which significantly reduced the activities of peroxidase and catalase，and indirectly affected the activity of superoxide dismutase，showed amore significant inhibition than that of seed coatat the same dose.Itwas concluded that the presence of inhibitory substances is one of important causes of seed dormancy in P.delavay.

Paeonia delavay;Franch.var.lutea;Brassica pekinensis;Antioxidant enzyme;Dormancy;Inhibiting effect

S685.11

A

1001－4829(2017)2－0305－04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.2.011

2016－04－05

西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金“西藏牡丹種子萌發(fā)最適條件的研究”(13-15)

鄧嵐(1973－)，女，江西南昌人，主要從事牡丹、桃、藍(lán)莓育種工作，E-mail:denglan1110@163.com，Tel: 13549096082，*為通訊作者:劉光立，E-mail:liuguangli@sicau.edu.cn。