高放射土壤中拮抗放線菌菌株的篩選及鑒定

李陽，李健強，宋素琴，王靜，楚敏

(1.新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆輕工職業(yè)技術學院，烏魯木齊 830021； 3.新疆農業(yè)科學院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091； 4.中國農業(yè)大學植物病理學系，種苗健康北京市工程研究中心，北京 100193)

高放射土壤中拮抗放線菌菌株的篩選及鑒定

李陽1,2，李健強3,4，宋素琴3，王靜1，楚敏3

(1.新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆輕工職業(yè)技術學院，烏魯木齊 830021； 3.新疆農業(yè)科學院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091； 4.中國農業(yè)大學植物病理學系，種苗健康北京市工程研究中心，北京 100193)

【目的】從新疆高放射土壤中分離和篩選出對蘋果樹腐爛病等有拮抗作用的放線菌，并對其進行鑒定。 【方法】采用對峙培養(yǎng)法通過初篩、復篩測定拮抗菌對8種病原菌的拮抗效果，根據篩選出菌株CH10的形態(tài)特征、生理生化特性及 16S rDNA 序列對其進行鑒定?！窘Y果】從70種放線菌中篩選出對蘋果樹腐爛病等8種新疆作物重要病原菌都具有良好拮抗效果的 CH10?！窘Y論】菌株CH10屬于鏈霉菌屬，對蘋果樹腐爛病菌等有良好的拮抗效果，為該病害的生物防治提供研究基礎。

拮抗放線菌；病原菌；蘋果腐爛??；16S rDNA；鏈霉菌

0 引 言

【研究意義】蘋果樹腐爛病(Applevalsacanker)俗名“臭皮病、爛皮病、串濕病”等，是ValsamaliMiyabeetYamada(蘋果腐皮殼屬真菌)侵染引起的一種病害，該病在我國蘋果產區(qū)普遍發(fā)生，可導致果樹主干及整樹死亡，嚴重時甚至毀園[1-2]。國家有關部門2008年調查結果表明，蘋果樹腐爛病的平均發(fā)病率為52.7%，發(fā)病嚴重的地區(qū)發(fā)病率甚至高達85%以上[3]。2011年甘肅省蘋果樹腐爛病總面積7.5×104hm2，平均發(fā)病率達到40%，對蘋果產業(yè)的市場發(fā)展造成了嚴重的影響[4]。2011年4～5月在新疆阿克蘇市紅旗坡農場腐爛病平均發(fā)病率為26.79%，比往年均高。蘋果是多年生木本植物，迄今為止尚未發(fā)現特別有效的抗腐品種[5-6]。歷年來蘋果樹腐爛病防治主要通過化學藥劑控制或延緩病情發(fā)展，但大量化學藥劑的使用也造成了嚴重后果，例如果園生態(tài)環(huán)境污染惡化，病原菌產生抗藥性，除此之外還給食品帶來嚴重的安全隱患等等。因此，尋找對環(huán)境污染小、高效的生物防治方法，防治蘋果腐爛病有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】20世紀80年代以來，生物防治作為一種安全有效的防治方法越發(fā)關注。郜佐鵬等[7]研究發(fā)現多種植物內生的放線菌可以抑制蘋果樹腐爛病。高克祥等[8]、Xin & Shang[9]、鄧振山等[10]先后報道哈茨木霉Trichodermaharzianum、深綠木霉Trichodermaatroviride和螺旋毛殼Chaetomiumspirale對蘋果樹腐爛病主要病原菌具有重寄生或抑制效果；展麗然等[11]在土壤樣品中篩選到對腐爛病菌具有拮抗作用的放線菌 Z-6，初步鑒定為金色類群Aureus，屬于鏈霉菌屬Streptomyces。張清明等[12]從健康蘋果樹枝條分離到了一株拮抗放線菌卡伍爾鏈霉菌(Streptomycescavourensis)A-2，其發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病的抑制率達90%以上?！颈狙芯壳腥朦c】采自新疆高放射土壤的放線菌，其是微生物中重要的一類菌，放線菌中的許多屬如鏈霉菌(Streptomyces)作為一種植物根圈促生菌(plantgrowth-promotingrhizobacteria，PGPR)在文獻已有大量報道[13]。近千種的抗生素及其衍生物來源于放線菌，已投入到生產與生活應用中的有90種左右[14]。目前已經發(fā)掘的抗生素80%是由放線菌產生的[15]，該生物資源有著廣泛的應用前景?！緮M解決的關鍵問題】拮抗菌形態(tài)特征及鑒定生理生化特性，及其發(fā)酵液的抑菌作用和成分分析。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌種

放線菌來自新疆放射土壤。供試病原菌蘋果樹腐爛菌-ValsamaliAkesu，蘋果莖點霉-PhomaPomi，擬分枝孢鏈孢霉-FusariumSporotrichioides，大麗輪枝菌-VerticilliumdahliaShihezi，色二孢屬真菌-Diplodiaseriata，立枯絲核-Solani，鏈格孢-Alternariaalternata，蘋果樹腐爛病菌-ValsamaliQingdao由石河子大學農學院、新疆農科院農產品加工所等提供，分離自果樹或果實。表1

表1 病原菌種類

Table 1 Category pathogens

編號病原菌Pathogens致病作物PathogenicCrop致病名稱PathogenicName來源Sources1蘋果樹腐爛病菌 ValsaMaliAkesu蘋果樹蘋果樹腐爛病蘋果樹2大麗輪枝桿菌 VerticilliumDahliaeShihezi棉花棉花黃萎病石河子大學農學院3色二孢屬真菌 DiplodiaSeriata葡萄葡萄莖潰爛新疆農科院農產品加工所4擬分枝孢鐮孢霉 FuswiumSporotpichioides梨梨腐爛病梨5立枯絲核 Solani蘋果樹蘋果苗立枯病石河子大學農學院6蘋果樹腐爛病菌 ValsaMaliQingdao蘋果樹蘋果樹腐爛病新疆農科院農產品加工所7蘋果擬莖點霉 PhomaPomi蘋果蘋果褐點病斑蘋果8鏈格孢 AltemariaAltemata蘋果蘋果霉心病新疆農科院農產品加工所

1.1.2 培養(yǎng)基配制

PDA培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)病原菌。配制方法：稱200 g馬鈴薯切成小塊，加1 000 mL水煮沸30 min，用雙層紗布過濾，加水至1 000 mL，然后加入20 g葡萄糖完全溶解，加瓊脂20 g，pH自然。

高氏培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)放線菌。配制方法：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4.7H2O 0.5 g，FeSO40.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL pH=7.2～7.4。

1.1.3 主要儀器

LDZX-50KBS全自動高壓蒸汽滅菌器；SPX-288生化培養(yǎng)箱。

THZ-98A回轉式恒溫調速搖床；Fa2204電子天平。

1.2 方 法

1.2.1 放線菌菌株的分離與拮抗菌株的篩選

1.2.1.1 放線菌菌株的分離與純化

土樣來自新疆高放射區(qū)土壤，經風干后篩濾保存。電子天平上稱取樣品10.000 g放入裝有90 mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，于搖床上振蕩30 min后樣品與無菌水充分混合均勻制得樣品懸液。然后在無菌條件下用移液槍吸取1 000 μL注入無菌水中，稀釋至10 mL溶液，然后按比例制成樣品稀釋液10∶2、10∶3、10∶4、10∶5、10∶6。分別吸取100 μL上述稀釋液，在高氏培養(yǎng)基上采用稀釋涂布法分離放線菌菌株，30℃培養(yǎng)24 h，然后根據其形態(tài)、透明度、顏色等挑取形狀差異明顯的菌落。挑取單菌落采用平板劃線進行純化、培養(yǎng)并編號，5℃保存[16]。

1.2.1.2 蘋果樹腐爛病菌拮抗菌株的初篩

通過傳統(tǒng)的對峙培養(yǎng)法進行初篩[17]，將活化好的8株常見作物病菌制成直徑約5 mm的菌餅，依次用滅過菌的鑷子接種在倒有PDA培養(yǎng)基的中央，同時將活化好的放線菌菌株，以菌餅形式接于距病原菌相同距離的4個角上，每皿重復三次，以不接種放線菌菌株只接種病原菌的平皿作為對照，置30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待菌落長滿培養(yǎng)皿后，記錄對照平板菌落直徑，觀察記錄處理試驗有無抑菌圈并測量病原菌菌落直徑。

1.2.1.3 蘋果樹腐爛病菌拮抗菌株的復篩

挑取病原菌絲放入5 mL無菌水中，移取200 μL病原菌懸浮液于PDA 培養(yǎng)基中，用刮鏟鋪勻，對稱接種直徑一定的放線菌菌餅，以加入等體積無菌病原菌培養(yǎng)液的處理作為對照，每皿重復三次，30℃恒溫培養(yǎng)3 d，測量處理菌落直徑并計算其抑菌率。選取對蘋果樹腐爛病菌具有較好活性的拮抗菌CH10進行廣譜性測定。按上述方法對8種供試病原菌進行拮抗率測定，每皿重復三次，30℃恒溫培養(yǎng)測量拮抗圈直徑并計算抑菌率。

d0-為對照病原菌直徑(mm)；

d-為處理病原菌直徑(mm)；

5-菌餅直徑(mm)；

1.2.2 菌株CH10的鑒定

形態(tài)及生理生化特征鑒定：根據《放線菌的分離與鑒定》[18]進行。通過16S rDNA的序列進行菌株鑒定，實驗過程如下：

1.2.2.1 主要儀器

表2 儀器耗材

Table 2 Instrument supplies

名稱Name型號Model廠家Manufacturer規(guī)格Specifications備注NotePCR儀DL9700東林昌盛96孔PCR擴增恒溫孵育器Constanttemperature鼎國昌盛世膠回收溶膠16S引物16Sprimers鼎國昌盛PAGEPCR擴增2XMix鼎國昌盛2U/ulDNA聚合酶回收試劑盒RecoveryKitNEP025-1鼎國昌盛50T片斷回收純化

1.2.2.2 實驗流程

細菌基因組提取

(1)2 mL沉菌，加入800 μL CTAB抽提液，65℃水浴40 min。

(2)加入800 μL氯仿異戊醇，混勻，12 000 r/min，離心10 min。

(3)取上清，加600 μL氯仿異戊醇，12 000 r/min，離心10 min。

(4)取上清，加入1 mL CTAB沉淀液，12 000 r/min，離心10 min。

(5)倒掉上清，10 min揮發(fā)晾干，加200 μL H2O，吸打混勻。

(6)加入400 μL無水乙醇，20 μL 3MNaAC，-20℃沉淀30 min。

(7)4℃，12 000 r/min，10 min離心加入500 μL 80%乙醇洗2次，12 000 r/min，10 min離心到上清，溶70 μL水。

1.3.2.2 目的片段擴增

引物合成：

F16S-27:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；

R16S-1492:CGGTTACCTTGTTACGACTTC；

反應體系

表3 反應體系

Table Reaction system

組成Constitution體積Volume(μL)2XMix2527F(10μM)11492R(10μM)1DNA模板2ddH2O21

反應條件：

回收PCR產物

(1)2.0%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片斷。

(2)加入回收試劑溶液A 300 μL/0.1 g，60℃水浴至膠完全溶化。

(3)加入50 μL回收試劑溶液B，混勻。

(4)將溶液置于離心柱中，靜置5 min，12 000 r/min，1 min，棄去液體。

(5)加入500 μL 80%乙醇，12 000 r/min，離心1 min，棄液體，重復一次。

(6)12 000 r/min，離心5 min，甩干余液，棄液體，晾干5～8 min。

(7)將離心柱置于新的離心管中，加入30 μL滅菌雙蒸水，靜置10 min。

(8)13 000 r/min，離心3 min，管底即為純化產物，取3 μL電泳檢測。

將測序得到的序列采用 NCBI 數據庫中的BLAST軟件與GenBank 中的核酸序列進行比對分析，檢索同源性高的菌株用于系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結果與分析

2.1 蘋果樹腐爛病拮抗放線菌菌株的篩選

供試土壤樣品中共分離70株放線菌菌株，經初篩和復篩獲得拮抗性較好的有4株：CH10、P4-A7、BE44-B1(A)、BE3-B6(A)。

在 PDA 平板對峙試驗中，這4株放線菌對腐爛病菌菌絲產生較好的抑菌作用，拮抗菌邊緣的病原菌生長速度減緩或停止，形成一個明顯的抑菌圈。其中菌株CH10對8種常見作物病原菌的拮抗效果最好。因此，選取拮抗菌 CH10作進一步研究。圖1

圖1 拮抗菌篩選圖

Fig.1 The screening of antagonistic actinomycetes

2.2 菌株對8種果樹病原菌的抑制作用

以上篩選出4個菌株對供試病原菌均有不同程度的抑制作用，抑菌率在 18.75%～62..50%，表現出良好的抑菌性。表3，表4

表3 放線菌拮抗圈直徑(mm)

Table 3 Diameter of antagonistic actinomycetes

拮抗菌Antagonist病原菌 Pathogens蘋果樹腐爛病菌ValsamaliAkesu(mm)大麗輪枝桿菌VerticilliumdahliaShihezi(mm)色二孢屬真菌Diplodiaseriata(mm)擬分枝孢鐮孢菌Fusariumsporotrichioides(mm)立枯絲核Solani(mm)蘋果樹腐爛病菌ValsamaliQingdao(mm)蘋果擬莖點霉Escherichiahermannii(mm)鏈格孢Alternariaalternata(mm)CH1034603050245518711664157714211940P4-A731502898278828421685245028422788BE44-B1(A)27402628214323941870302120802270BE3-B6(A)28152892213018541932177323552018

表4 放線菌拮抗效果

Table 4 Antagonistic effection of actinomycetes

拮抗菌Antagonist病原菌 Pathogens蘋果樹腐爛病菌ValsamaliAkesu(mm)大麗輪枝桿菌VerticilliumdahliaShihezi(mm)色二孢屬真菌Diplodiaseriata(mm)擬分枝孢鐮孢菌Fusariumsporotrichioides(mm)立枯絲核Solani(mm)蘋果樹腐爛病菌ValsamaliQingdao(mm)蘋果擬莖點霉Escherichiahermannii(mm)鏈格孢Alternariaalternata(mm)CH1062505125375026252269212518752750P4-A753754750449046152305374146154490BE44-B1(A)43754125312536252625265330053375BE3-B6(A)45524734310225942734245335472891

2.3 拮抗菌株 CH10的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征及生理生化特性

在高氏培養(yǎng)基上CH10菌落呈白色， 邊緣光滑，菌落卵圓形且緊貼培養(yǎng)基，濕潤、不透明，菌體呈線狀。CH10的適宜生長溫度為28～32 ℃，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)及顯微鏡100倍油鏡下觀察。圖2

2.3.2 16S rDNA 序列分析

通過 PCR 擴增菌株 CH10 的 16S rDNA，得到1條大約 1 500 bp 的片段，測序結果表明該區(qū)段長度為1 459 bp。將該序列與NCBI數據庫Blast進行比對(登錄號為KT986228)。圖3，圖4

2.3.3 分子鑒定結果

測序比對測序結果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上BLAST比對，利用MEGA5.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示，在以16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中菌株CH10與婁徹氏鏈霉菌(StreptomycesrocheiNBRC12908T)、和淡紫褐鏈霉菌(StreptomycesenissocaesilisNRRLB-16365T)、褶皺鏈霉菌(StreptomycesplicatusNBIC13071T)位于系統(tǒng)進化樹上同一分支，其序列的同源性都高達99%，表明它們的親緣關系較近。結合形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特性比較，因此將菌株CH10初步鑒定為鏈霉菌屬。圖5

圖2 CH10的形態(tài)特征

Fig.2 Morphological character of CH10

圖3 DNA電泳

Fig.3 Electrophoretic pattern of DNA

注：maker為2000,1600,1000,750,500,250,100bp

圖4 PCR電泳檢測

Fig.4 Electrophoresis detection of PCR

圖5 依據菌種CH1016S rDNA序列的N-J法構建的系統(tǒng)進化樹

Fig.5 Phylogenetic tree of strain CH10 based on 16S rDNA sequences

3 討 論

植物根際土壤和植物內部存在大量微生物，這些微生物在長期的進化中與植物和病原菌形成了彼此密切關系，其中一些微生物對病原菌產生抑制作用[19]。劉琴[20]、柳成賓[21]、張麗[22]分別分離出的鏈霉菌SR-1102、鏈霉菌TRM42561、婁徹氏鏈霉菌YL-2粗提取液，分別對黃瓜枯萎病(F.oxysporumf.sp.cucumerinum)、棉花黃萎病(Verticilliumdahliae)、稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)都有較好的抑菌作用。該實驗通過簡單、直觀、快速的對峙培養(yǎng)法，通過觀察拮抗圈的大小，在一定時間內就可以對很多放線菌菌株進行篩選，以期為該病害的防治提供參考。

4 結 論

4.1 研究通過初篩和復篩，從來自新疆高放射區(qū)土壤中的70株放線菌中篩選得到4株對蘋果樹腐爛病菌具有顯著拮抗作用的菌株，其中 CH10拮抗效果最好。

4.2 經菌落形態(tài)培養(yǎng)觀察、生理生化鑒定以及 16S rDNA 序列分析，最終確定菌株CH10為鏈霉菌屬。

4.3 菌株CH10對蘋果采摘后貯藏保鮮的作用、發(fā)酵濾液的抑菌作用和拮抗物質、對蘋果樹腐爛病的具體生防效果有待進一步研究。

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ZHANG Li, JI Ming-shan, YU Zhi-guo, et al.(2014).lAntifunga activities and stability of metabolites from Streptomyces rochei against Pyricularia oryzae [J].JournalofShenyangAgriculturalUniversity, 45(2):143-146. (in Chinese)

Fund project:Supported by Key Projects in the National Science & Technology Pillar Program during the Twelfth Five-year Plan Period. (2012BAD42B02); The project of the introduction of the higher-grade talented persons of the Xinjiang Uygur Autonomous Region(2015-2017)

The Screening and Identification of Antagonistic Actinomycetes Strains from the High Radiation Soil

LI Yang1,2， LI Jian-qiang3,4， SONG Su-qin3，WANG Jing1， CHU Min3

(1.CollegeofFoodandPharmaceuticalSciences,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China； 2.XinjiangInstituteofLightIndustryTechnology,Urumqi830021；3.ResearchInstituteofAppliedMicrobiology,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China；4.DepartmentofPlantPathology,BeijingEngineeringResearchCenterofSeedandPlantHealth,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)

【Objective】 This project aims to isolate and screen 70 actinomycetes strains from the high radiation soil of Xinjiang by antagonistic effect of 8 kinds of pathogenic bacteria such as theValsamaliMiyabeetYamada.【Method】By the plate confrontation culture method, and through initial screening and repeated screening of antagonistic effect of 8 kinds of pathogenic bacteria, and according to the morphological characteristics of the strains of CH10, the physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence went through identification and analysis.【Result】The results showed that 8 kinds of important pathogens of Xinjiang crops, such as theValsamaliMiyabeetYamada, were screened out from 70 kinds of actinomycetes, which had good antagonistic effect called CH10.【Conclusion】Strain CH10 belongs to the genus streptomyces and it has good antagonistic effect on theValsamaliMiyabeetYamada, which has provided a foundation for the biological control of the disease.

antagonistic actinomycetes; pathogenic bacteria; 16S rDNA identification; streptomyces

2016-09-22

新疆科技援疆項目(201491150)；高層次引進人才(2015-2017)

李陽(1985-)，女，助教，碩士研究生，研究方向為植物生理學，(E-mail)1501740810@qq.com

宋素琴(1976-)，女，副研究員，碩士，研究方向為微生物活性產物和植物病理學，(E-mail)suqin_song@163.com 王靜(1978-)，女，副教授，博士研究生，研究方向為果蔬貯藏保鮮，(E-mail)1944142847@qq.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.01.017

S182

A

1001-4330(2017)01-0132-08