三種雞胚絨膜尿囊膜移植瘤模型對(duì)比分析

費(fèi)東亮，胡 影，岳金金，馬鳴瀟

(錦州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院， 錦州 121001)

研究報(bào)告

三種雞胚絨膜尿囊膜移植瘤模型對(duì)比分析

費(fèi)東亮，胡 影，岳金金，馬鳴瀟*

(錦州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院， 錦州 121001)

目的 通過比較三種不同癌細(xì)胞株在雞胚絨毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane，CAM)上的生長(zhǎng)情況，從中篩選最佳移植癌細(xì)胞株，建立移植瘤模型并觀察生物學(xué)特性。方法 分別將人肺癌A549株、舌鱗癌TCA8113株與人肝癌QGY7703株接種于7日齡雞胚CAM上，對(duì)各自雞胚成活率、瘤株成活、成瘤率和誘導(dǎo)血管生成情況等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，并觀察篩選移植瘤模型生長(zhǎng)特性。結(jié)果 與人肺癌A549株和肝癌QGY7703株接種組相比，舌鱗癌TCA8113株接種組成瘤率最高(P< 0.05)，為最佳移植癌細(xì)胞株，最佳接種癌細(xì)胞數(shù)量為8.0×106/個(gè)，接種后瘤體最佳生長(zhǎng)周期為4 ～ 8 d，最佳實(shí)驗(yàn)時(shí)間為接種后第7 天。結(jié)論 篩選建立了舌鱗癌TCA-CAM移植瘤模型，為深入研究腫瘤生長(zhǎng)生物學(xué)特性、血管生成機(jī)制、侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制和篩選抗腫瘤藥物提供了良好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

雞胚絨毛尿囊膜；移植瘤；A549細(xì)胞株；TCA8113細(xì)胞株；QGY7703細(xì)胞株

在腫瘤治療研究中，F(xiàn)olkman于1972年首次提出了血管增生抑制抗腫瘤理論[1]。血管增生是毛細(xì)血管萌生新生和從已有血管中形成心血管網(wǎng)的過程，在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[2]。根據(jù)這一理論，抗腫瘤血管生成已成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)之一[3]。而雞胚絨毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane，CAM)在發(fā)育初期，伴隨著旺盛的新生血管的產(chǎn)生及動(dòng)靜脈血管網(wǎng)形成,同時(shí)尚未形成完整的免疫系統(tǒng)，大大降低了因排異反應(yīng)造成的瘤體或組織不易形成和生長(zhǎng)，成為研究血管生成及抑制的理想體內(nèi)模型[4]。自1977年Kinighon等建立CAM模型以來，因其取材方便、操作簡(jiǎn)單、便于動(dòng)態(tài)觀察等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于腫瘤模型制備、血管生成及抗血管生成藥物等方面的研究[5]。本研究通過選取舌鱗癌TCA8113、肺癌A549、肝癌QGY7703細(xì)胞株作為CAM移植對(duì)象，進(jìn)行瘤模型對(duì)比研究，篩選得到最佳的CAM移植瘤株，建立一種模擬體內(nèi)腫瘤血管新生的方法，以期為抗腫瘤藥物的篩選提供良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與主要試劑

舌鱗癌TCA8113株、肺癌A549株與肝癌QGY7703細(xì)胞株由錦州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院凍存，SPF雞胚由遼寧益康生物制品廠提供【SCXK(遼)2011-0001】；小牛血清(Hyclone公司)，DMEM 培養(yǎng)液(Gibco 公司)，胰酶(上海生工生物工程有限公司)，SZX7體視顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)。

1.1.2 細(xì)胞株培養(yǎng)及雞胚孵育

將復(fù)蘇凍存的人舌鱗癌TCA8113株、肺癌A549株、肝癌QGY7703株3種細(xì)胞分別置于含10 mL/L胎牛血清(FBS)的DMEM養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，用胰酶消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞備用。受精種蛋用酒精消毒后置于37℃、相對(duì)濕度60%～80%的恒溫孵育箱中孵育至7日齡，氣室端向上，呈45度傾斜，每天翻動(dòng)3次。

1.2 方法

1.2.1 CAM的制備及癌細(xì)胞接種

參照文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行CAM制備。在超凈工作臺(tái)上用照卵燈確定氣室的具體位置，75%乙醇消毒后將胚蛋置于操作蛋架上，在氣室上方開直徑約3 mm小孔，在用洗耳球?qū)⒌袈湓跉馐覂?nèi)殼膜上的蛋殼碎片吹出，開口直徑約1.5 cm大小，在開窗處分離殼摸。然后，將選取的癌細(xì)胞株分別接種于雞胚的CAM膜上相對(duì)無血管區(qū)。接種后用無菌透明膠帶封閉窗口，繼續(xù)孵育。

1.2.2 最佳移植瘤株的優(yōu)選

取孵育良好的7日齡胚蛋45只，隨機(jī)分為3組，每組15只。將培養(yǎng)好的3種腫瘤細(xì)胞數(shù)調(diào)整為每40 μL含6×106個(gè)，分別接種于前期處理好的雞胚的CAM相對(duì)無血管區(qū)，用無菌膠布封閉窗口，繼續(xù)孵育7～10 d，對(duì)雞胚存活、瘤株成活、成瘤率和誘導(dǎo)血管生成情況進(jìn)行觀察，其中以肉眼見移植瘤直徑 ≥ 2 mm者為成瘤陽(yáng)性，計(jì)算成瘤率。同時(shí)，CAM移植瘤標(biāo)本用4%多聚甲醛原位固定后，將其取出。在解剖顯微鏡下觀察腫瘤區(qū)新生血管情況，并計(jì)算出以腫瘤組織為中心直徑0.5 cm范圍內(nèi)呈放射狀網(wǎng)狀分布的血管數(shù)量[7]。

1.2.3 最佳接種腫瘤細(xì)胞數(shù)的確定

取生長(zhǎng)良好的7日齡雞胚99只，隨機(jī)分為9組，其中8個(gè)細(xì)胞組和1個(gè)陰性對(duì)照組(PBS組)，每組11個(gè)。用PBS緩沖溶液將腫瘤細(xì)胞調(diào)整為每20 μL分別含有1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、1×107、1.2×107、1.4×107個(gè)。然后參照1.3中的方法，在暴露出雞胚尿囊膜的相對(duì)無血管區(qū)接種20 μL細(xì)胞懸液，封閉后繼續(xù)培養(yǎng)7 d，觀察指標(biāo)同上。

1.2.4 移植瘤生物學(xué)特性觀察

將舌鱗癌TCA8113株細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為8×106/20 μL接種于7日齡雞胚30個(gè)后，每天取出4個(gè)，在體視顯微鏡下觀察移植瘤生長(zhǎng)情況并拍照(×20倍)，然后用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤長(zhǎng)、短徑，計(jì)算其體積[V=1/2(長(zhǎng)徑×短徑2)]，繪制生長(zhǎng)曲線。取移植瘤樣本，經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、切片及HE染色后光鏡下觀察。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 最佳移植瘤優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 接種不同瘤株后雞胚的存活和成瘤情況

3種腫瘤細(xì)胞分別以每20 μL含4×106個(gè)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行接種，7日齡的雞胚接種后孵育8 d的CAM存活及成瘤情況見表1。接種孵育8 d后，三組雞胚都存活良好，各組間雞胚存活率差異不是特別明顯。從成瘤雞胚數(shù)來看，人肺癌A549株成瘤雞胚數(shù)最少，為4枚；人肝癌QGY7703株成瘤雞胚數(shù)為6枚；舌鱗癌TCA8113株8113株成瘤雞胚數(shù)為7枚。從成瘤率來看，肺癌A549組成瘤率最低為30.8%，肝癌QGY7703組成瘤率為42.9%，舌鱗癌TCA8113組雞胚成瘤率最高為53.8%，且與肝癌QGY7703組和肺癌A549組間差異顯著(P< 0.05)。

表1 不同瘤株接種于CAM 后的雞胚存活率和成瘤率情況

2.1.2 接種3種瘤株后CAM上誘導(dǎo)血管生成情況

將3種癌細(xì)胞按照每20 μL含4×106個(gè)細(xì)胞數(shù)分別進(jìn)行接種于7日齡雞胚，然后繼續(xù)孵育8天后，3種瘤株誘導(dǎo)CAM血管生成情況見圖1和表2。從表2可知，其中舌鱗癌TCA8113株誘導(dǎo)血管生成能力最強(qiáng)(52.83±8.17)，人肺癌A549株誘導(dǎo)血管生成能力次之(47.88±7.52)，而人肝癌QGY7703株誘導(dǎo)血管生成能力最弱(38.54±4.68)。TCA8113組與A549組相比，差異有顯著性(P< 0.05)，而與QGY7703組差異無顯著性(P> 0.05)。

表2 3種不同瘤株接種于CAM后誘導(dǎo)血管生成數(shù)統(tǒng)計(jì)表(n=6)Tab.2 Statistical analysis of the number of blood vessels induced by CAM inoculated with the three types of tumor cells

2.2 最佳接種腫瘤細(xì)胞數(shù)試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同腫瘤細(xì)胞數(shù)接種CAM后雞胚存活及成瘤情況

接種1×106～1.4×107個(gè)/只舌鱗癌TCA8113株細(xì)胞與存活雞胚數(shù)和成瘤雞胚數(shù)的關(guān)系見表3。從雞胚存活率與接種細(xì)胞數(shù)量來看，呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)接種細(xì)胞數(shù)量大于1.0×107后，雞胚存活率明顯降低。與B組相比，E、F、G組差異有顯著性(P< 0.05)。舌鱗癌TCA8113株移植瘤成瘤率與細(xì)胞接種數(shù)量呈正相關(guān)：在接種細(xì)胞數(shù)低于2.0×106時(shí)，成瘤率較低，與對(duì)照組差異無顯著性(P> 0.05)。隨著接種瘤細(xì)胞數(shù)的增加，成瘤率也相應(yīng)增加，在接種瘤細(xì)胞數(shù)大于8.0×106時(shí)，與接種B組、組和D組差異有顯著性(P< 0.05)。當(dāng)接種瘤細(xì)胞數(shù)達(dá)到1.4×107時(shí)，成瘤率為100%，與A組、B組、C組和D組，差異有顯著性(P< 0.05)，而與E組、F組、G組差異無顯著性(P< 0.05)。結(jié)合存活雞胚數(shù)，將最佳接種細(xì)胞數(shù)確定為8.0×106個(gè)。

表3 不同細(xì)胞數(shù)的舌鱗癌TCA8113株接種于CAM 后的雞胚存活及成瘤情況(n=11)

注：a：舌鱗癌TCA8113株；b：肺癌A549細(xì)胞株；c：肝癌QGY7703細(xì)胞株。圖1 不同瘤株接種于CAM后的移植瘤形態(tài)圖Note. a: Tongue squamous cell line TCA8113; b: Lung cancer cell line A549; c: Human liver cancer cell line QGY7703.Fig.1 Morphology of the transplanted tumors after CAM inoculation

注：a：H.E染色(×200倍)；b：H.E染色(×400倍)。圖3 舌鱗癌TCA-CAM移植瘤HE染色Note. a: H.E staining ×200; b: H.E staining ×400.Fig.3 Histology of the transplanted tumor induced by TCA-CAM cells

2.3 移植瘤對(duì)血管生成的誘導(dǎo)作用

在7日齡CAM上接種TAC細(xì)胞后，接種后第2 天出現(xiàn)細(xì)小的血管向瘤體方向靠近、彎曲；接種第3 天，瘤體周圍血管逐漸變粗，且新生毛細(xì)血管增多，呈放射狀向瘤體部位集中；接種第5 天，新生血管長(zhǎng)入移植瘤內(nèi)，且整個(gè)瘤體及其周圍可見大量血管分布；對(duì)照組(PBS)接種部位血管與未接種區(qū)域血管相比無差別，均呈樹枝狀，血管舒展平滑。由CAM移植瘤瘤體生長(zhǎng)曲線可知，在接種第1 ～ 3天，移植瘤生長(zhǎng)緩慢；從第4 天開始，移植瘤生長(zhǎng)速度迅速加快，在第7 天時(shí)候達(dá)到高峰(見圖2)。

2.4 移植瘤的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)

肉眼觀舌鱗癌TCA8113株雞胚移植瘤為乳白色，與雞胚絨毛尿囊膜邊界清晰，形態(tài)不太規(guī)則，新生血管長(zhǎng)入移植瘤內(nèi)。瘤組織質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，切面呈灰紅色(圖3)。光鏡下，可見雞胚移植瘤組織瘤細(xì)胞形態(tài)和排列多樣，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核大而濃染，核仁顯著，細(xì)胞質(zhì)少，且異型性明顯，可見異常核分裂相，與人TAC組織結(jié)構(gòu)相似。

圖2 舌鱗癌TCA-CAM移植瘤不同時(shí)間誘導(dǎo)血管生成情況觀察Fig.2 Angiogenesis induced by TCA-CAM transplanted tumor at different time

3 討論

在抗腫瘤研究領(lǐng)域，抑制腫瘤血管生成是當(dāng)今國(guó)際抗腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。研究表明，惡性腫瘤生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要通過新生血管來運(yùn)輸，在沒有血管提供營(yíng)養(yǎng)的情況下，腫瘤組織直徑不會(huì)超過2 mm[8]。因此，尋找能夠阻斷腫瘤血管的生成的藥物和方法，為抗腫瘤治療研究提供了新的途徑。雞胚的CAM含有豐富的毛細(xì)血管叢，利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換，可以模擬腫瘤在侵襲過程中的基底膜作用，同時(shí)雞胚在發(fā)育初期的免疫系統(tǒng)尚不健全，異種排斥反應(yīng)很小，有利于腫瘤的生長(zhǎng)[9]。近年來，以雞胚絨毛尿囊膜為研究對(duì)象建立的腫瘤移植模型已經(jīng)廣泛應(yīng)用于新生血管生成、微循環(huán)、抗腫瘤藥物研發(fā)等方面的研究[10-15]。

本研究通過將舌鱗癌TCA8113、肺癌A549與肝癌QGY7703 三種癌細(xì)胞株接種到CAM上，繼續(xù)孵育7 d后，結(jié)果表明三組間雞胚存活率和誘導(dǎo)CAM血管生成差異無顯著性(P> 0.05)，但舌鱗癌TCA8113組成瘤率最高，故選擇舌鱗癌TCA8113株細(xì)胞為最佳移植瘤株。在最佳接種細(xì)胞數(shù)量上，將舌鱗癌TCA8113株細(xì)胞以1×106～1.4×106個(gè)/胚接種與7日齡雞胚，經(jīng)孵育后發(fā)現(xiàn)成瘤率與接種腫瘤細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，其中1.4×107個(gè)/胚的接種量成瘤率能夠達(dá)到100%，但雞胚成活率較低，同時(shí)所需細(xì)胞數(shù)量很大，增加了成批建模時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)的工作量和難度，而8.0×106個(gè)/胚的細(xì)胞接種量成瘤率和存活率相對(duì)較高，也適于成批建模。因此， 8.0×106個(gè)/胚的接種細(xì)胞數(shù)量相對(duì)更加合適。在本試驗(yàn)中建立的模型中，發(fā)現(xiàn)在接種后第4 天，接種區(qū)域周圍血管增粗增多，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)接種區(qū)域附件血管可明顯的向腫瘤組織彎曲，表明接種的舌鱗癌TCA8113株腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的誘導(dǎo)血管生成作用。腫瘤細(xì)胞接種雞胚后血管生成的對(duì)數(shù)期越長(zhǎng)，可干預(yù)的窗口越大，對(duì)抗腫瘤藥物研究也更有價(jià)值，從舌鱗癌TCA8113株雞胚腫瘤模型的血管生長(zhǎng)曲線來看，選擇接種7 d為移植瘤的最佳實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

舌鱗癌TCA-CAM腫瘤模型的建立，有助于我們對(duì)腫瘤生長(zhǎng)生物學(xué)特性、血管生成機(jī)制、侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制和篩選抗腫瘤藥物深入研究。但同時(shí)也應(yīng)注意，雞胚的各個(gè)組織器官尚未發(fā)育完全，其結(jié)構(gòu)與代謝功能上，與人類腫瘤組織存在許多不同，需要研究中應(yīng)該充分考慮這一客觀因素。

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Contrastive Analysis of three transplanted tumor models in chick embryo chorioallantoic membrane

FEI Dong-liang, HU Ying, YUE Jin-jin, MA Ming-xiao*

(Institutes of Biological Sciences, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China)

Objective To compare the growth of three different cancer cell lines on chick chorioallantoic membrane (CAM), to select the best transplanted cancer cell line for establishing a transplanted tumor model and to observe the biological characteristics. Methods The human lung cancer cell line A549, human tongue cancer cell line TCA8113 and human liver cancer cell line QGY7703 were respectively inoculated into CAM at the 7th day of age. The chick embryo survival rate, tumor survival rate, tumor formation rate and induced angiogenesis were detected and the growth characteristics of the transplanted tumor model were observed. Results Compared with the groups inoculated with A549 cells and QGY7703 cells, the tumor formation rate of TCA8113 cells was the highest (P< 0.05), to be the best cancer cell line for transplanted tumor. The optimal inoculated number of cells was 8.0×106/chick embryo, the optimal growth period of the tumor was 4～8 d, and the best experiment time was 7 d after inoculation. Conclusion The TCA-CAM transplanted tumor model of tongue squamous cell cancer is successfully established for further study of the biological characteristics and mechanisms of tumor growth, angiogenesis, invasion and metastasis, and provide a good experimental animal model for anti-tumor drug screening.

Chick chorioallantoic membrane; Transplanted tumor; A549 cell line; TCA8113 cell line; QGY7703 cell line

遼西地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公共服務(wù)平臺(tái)的推廣及應(yīng)用(2014408003)。

費(fèi)東亮，男，副教授，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿硬《緦W(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。E-mail：dlfei7712@126.com

馬鳴瀟,男，教授，博士，研究方向?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物、分子病毒學(xué)。E-mail:495218701@qq.com

R-33

A

1671-7856(2017) 03-0047-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.03.009

2016-07-24