核桃楸葉提取物不同極性部位的抗菌活性研究*

孫慶靈 霍金海 謝 健 王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·150036）

核桃楸（Juglans mandshurica Maxim）為胡桃科胡桃屬落葉喬木，是東北著名的三大硬闊之一，為珍貴的用材樹種。核桃楸的不同部位均有一定的藥用價值：其未成熟果實或果皮（青龍衣），具有明顯的鎮(zhèn)痛，清熱，解毒，止痢，明目的功效，用于鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等癥；其種仁可以斂肺定喘，溫腎潤腸，用于體質(zhì)虛弱，肺虛咳嗽，腎虛腰痛，便秘等癥；其樹皮可以清熱解毒，用于細菌性痢疾，骨結(jié)核，麥粒腫等癥[1-2]。

核桃葉的藥理功能我國民間早有記載，能改善新陳代謝，促進肌體強壯[3-4]。核桃葉制劑對患維生素缺乏癥、喉頭炎、淋巴結(jié)、甲狀腺腫大、結(jié)核病、黃疸病、婦科病、皮膚病等均有較好療效[5-7]。葉的提取物對炭疽桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌及傷寒桿菌、大腸桿菌、白喉桿菌有一定的殺菌作用[8-9]。

但核桃楸葉不同極性部位對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的抑制作用尚未見報道，本文對核桃楸葉提取物的不同極性部位進行體外抗菌試驗研究，本實驗采用平板打孔抑制法測定核桃楸葉提取物不同極性部位對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌三種供試菌的抑菌作用，以及其最低抑菌濃度。以期明確其有效部位，為充分利用核桃楸葉藥用資源開發(fā)制劑，資源可持續(xù)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 實驗材料

核桃楸葉于2012年09月采于哈爾濱市賓縣，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)研究院初東君主任藥師鑒定為核桃楸(Juglans mandshurica Maxim) 的葉，陰干后粉碎。

供試菌種：金色葡萄球菌（Staphylococcus coureus），G+ (批號：ATCC25923)

大腸桿菌（Escherichia coli），G-(批號：ATCC25922)

綠膿桿菌（Pseudomonsa aeruginosa），G-(批號：ATCC27853)

菌種均由黑龍江省臨床檢驗中心提供。

1.2 實驗試劑

無菌生理鹽水：氯化鈉注射液（哈藥集團制藥六廠，批號：13030303-1）

MH（A）培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：20120519）

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：20120602）

營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：02-013）

乙醇，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，均為分析純；牛肉膏，蛋白胨，瓊脂粉均為生化用品，純凈水為實驗室自制。

1.3 實驗儀器

BP211D型電子天平（Sartorius公司），RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），BCM-1000型生物潔凈工作臺（上海卓爵儀器設(shè)備有限公司），LDZX-75KB型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），BSC-250型培養(yǎng)箱（上海昂尼儀器儀表有限公司）。

2 實驗方法

2.1 粗提物的制備

核桃楸葉粗粉1Kg，95%乙醇回流提取2次，每次2小時，過濾，合并濾液，減壓回收至無醇味后加入蒸餾水，充分溶解后石油醚萃取3次，合并萃取液；再依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液減壓濃縮，真空干燥（60℃），分別得石油醚萃取物15.23g，乙酸乙酯萃取物17.59g，正丁醇萃取物13.28g，將其配制成10mg/ml藥液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾滅菌。

2.2 粗提物抗菌活性測定

樣品：核桃楸葉水提物，石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物，正丁醇萃取物；菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），大腸桿菌（Escherichia coli），綠膿桿菌（Pseudomonsa aeruginosa）。

2.3 培養(yǎng)基制備

2.3.1 MH（A）培養(yǎng)基的配制 取MH（A）培養(yǎng)基36.5g，加入1000mL蒸餾水中加熱煮沸溶解，分裝，121℃高壓滅菌15min備用。

2.3.2 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配制 取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基38g，加入1000mL蒸餾水中，加熱煮沸溶解，分裝，121℃高壓滅菌15min，在無菌操作臺趁熱將滅菌后培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，自然冷卻后，密封，置于4℃冰箱中備用。

2.3.3 營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基的配制 取營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基18g，加入1000mL蒸餾水中，加熱煮沸溶解，分裝，121℃高壓滅菌15min，在無菌操作臺趁熱將滅菌后培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，自然冷卻后，密封，置于4℃冰箱中備用。

2.4 菌懸液的制備

取含有無菌生理鹽水的離心管，用接種環(huán)在以培養(yǎng)好的劃線菌種平面上刮取一定量的單個菌落，然后將接種環(huán)在生理鹽水中沖洗干凈，震蕩均勻，以無菌生理鹽水作對照，制成濃度大約在105-106cfu/mL的菌懸液。

2.5 提取物的抑菌試驗

在潔凈工作臺內(nèi)，用無菌棉簽蘸取菌懸液在已配制好的MH（A）培養(yǎng)基表面均勻涂布，用以做滅菌處理的打孔器，在MH（A）培養(yǎng)基上打5個直徑3mm的光滑小孔，其中1個小孔內(nèi)打入無菌生理鹽水作為空白對照，其余小孔分別加入不同濃度的供試樣品，生理鹽水作為陽性藥對照組（直徑3mm）。

2.6 最低抑菌濃度測定

測量各細菌的抑菌圈直徑，取所測各不同濃度供試樣品的抑菌圈直徑的平均值，以大于空白的抑菌圈直徑所對應(yīng)的濃度(μg/mL)為最低抑菌濃度(MIC)，并對所得結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差。

表1 核桃楸葉不同部位對不同細菌的抑菌效果

表2 核桃楸葉不同部位提取物對供試菌的最小抑菌濃度

3 結(jié)果與分析

3.1 提取物對供試菌的抗菌活性

核桃楸葉不同極性部位的抑菌效果見表1、表2，核桃楸葉提取物有機相部位對供試菌均有不同程度的抑制作用，抑菌圈比較結(jié)果顯示，核桃楸葉提取物的抑菌效果：正丁醇相＞乙酸乙酯相＞石油醚相，水相無抑菌作用。

3.2 核桃楸葉不同極性部位的最低抑菌濃度

由表2可知核桃楸葉不同極性部位對供試菌的最低抑菌濃度，最低抑菌濃度的測定結(jié)果進一步說明，核桃楸葉提取物的有機相部位對供試菌有較好的抑菌作用。

4 討論

孫墨瓏[10]對核桃楸葉乙醇提取物進行分離，其有效成分5-羥基-1,4-萘醌(胡桃醌)、D-阿洛糖、5,8-二羥基-1, 4-萘醌、1,5-萘二酚、2,3-二氫苯并呋喃、7-甲氧基-1-四氫萘酮等對樟子松枯梢病菌和楊樹葉枯病菌有抑制作用。本實驗探究核桃楸葉提取物不同極性的抑菌作用，結(jié)果表明，核桃楸葉提取物不同極性部位除水相外均有不同程度的抑菌作用，其中有機相對革蘭氏陰性菌大腸桿菌、綠膿桿菌有明顯的抑菌作用，且隨極性的增大抑制程度增強；而有機相對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑制作用無明顯差別。綜合最低抑菌濃度和抑菌圈結(jié)果，明確了有機相部位為核桃楸葉抗菌的活性部位，說明其中存在有效的抗菌成分，接下來有必要對該部分做進一步的研究，最終分離出具有抗菌活性的單體成分。

體外抑菌實驗結(jié)果表明核桃楸葉的藥用價值是值得研究、開發(fā)、利用的。隨著研究的深入，充分利用核桃楸葉藥用資源，對保護嚴重不足的野生核桃楸資源以及其可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

[1]翟梅枝，李曉明，林奇英，等．核桃葉抑菌成分的提取及其抑菌活性[J]．西北林學(xué)院學(xué)報，2003，18(4)：89—91．

[2]聞平，陳蕾．胡桃楸提取物對白色念珠菌生長的抑制作用[J]．中國微生態(tài)學(xué)雜志，2005，17(5)：335—338．

[3]宛蕾，陳秀芬，杜江．胡桃青皮抗炎及鎮(zhèn)痛作用的研究[J]．中藥藥理與臨床，1999，15(2)：29—30．

[4]陳奇．中藥藥理研究方法學(xué)[M]．人民衛(wèi)生出版社，2006(Ⅱ)：264．

[5]周光宇．中國菌種目錄[M]．化學(xué)工業(yè)出版社，生物、醫(yī)藥出版分社，2007：649—686．

[6]南京中醫(yī)藥大學(xué)．中藥大辭典[M]．上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006(下)：2183．

[7]貝時章．中國大百科全書[M]．中國大百科全書出版社，1980(Ⅱ)：1132．

[8]魏麗麗．核桃楸的藥理作用研究[J]．黑龍江醫(yī)藥，2009，22(4)：532—534．

[9]姚振生，葉荷平，陳杰，等．野核桃葉提取物的體外抗菌作用[J]．江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2000，13(3)：122—126．

[10]孫墨瓏，宋湛謙，方桂珍．核桃楸葉乙醇提取物的抑菌活性及活性成分分析[J]．林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)2007，10（27）：81-84