羊乳脂球膜蛋白研究的新進(jìn)展

張娜娜 李萬宏 李發(fā)弟 翁秀秀 樂祥鵬*

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州730020；2.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，反芻動物研究所，蘭州730020)

羊乳脂球膜蛋白研究的新進(jìn)展

張娜娜1,2李萬宏1,2李發(fā)弟1,2翁秀秀1,2樂祥鵬1,2*

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州730020；2.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，反芻動物研究所，蘭州730020)

乳蛋白是乳中重要的組成成分，是衡量乳品質(zhì)的重要指標(biāo)，主要由酪蛋白、乳清蛋白和乳脂球膜蛋白等組成。乳脂球膜蛋白是乳蛋白的一個特殊亞群，具有抑制癌細(xì)胞、抗病毒感染、增強機體免疫等功能。此外，乳脂球膜蛋白與多發(fā)性硬化癥、自閉癥、冠心病等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。本文主要對羊乳脂球膜蛋白的組成及其在不同羊品種、不同泌乳時期、急性期與正常期以及不同物種間的差異性方面的研究進(jìn)行歸納總結(jié)，以助于全面認(rèn)識乳脂球膜蛋白的組成與功能，了解其分泌機制，為制訂合理的羔羊斷奶方案和開發(fā)科學(xué)的羔羊代乳粉配方奠定一定的理論依據(jù)。

羊乳；乳脂球；乳脂球膜蛋白；泌乳；差異

乳脂是乳中重要的營養(yǎng)成分，一般以脂肪球的形式分散于乳中，其表面被一層薄膜包裹，稱為乳脂球膜(milk fat globule membrane，MFGM)，其功能是保護(hù)脂肪球不發(fā)生聚合或酶退化[1]。乳脂球膜上含有25%～70%的蛋白質(zhì)[2]，即為乳脂球膜蛋白(milk fat globule membrane proteins，MFGMPs)。MFGMPs盡管僅占乳蛋白總含量的1%～4%，但是卻具有最多樣性的生物功能，在新生兒的細(xì)胞生長過程及防御機能中都發(fā)揮著重要的作用[3]。有研究表明在嬰幼兒每天的輔食中添加MFGMPs可減少腹瀉的發(fā)生[4]。羊乳作為羔羊早期唯一的食物來源，對其生長發(fā)育以及后期的生長都具有重要的意義。因此，對MFGMPs的組成和生物學(xué)功能，以及它們?nèi)绾问芷贩N、泌乳時期、飼養(yǎng)條件、健康狀況等影響的研究將有助于我們在羔羊飼養(yǎng)管理中制訂科學(xué)、合理的斷奶方案和代乳粉配方。本文將針對上述幾個方面對前人的研究進(jìn)行歸納總結(jié)，以期為后期的研究提供思路，為羊乳的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 MFGMPs的結(jié)構(gòu)與功能

1.1 MFGMPs的結(jié)構(gòu)及分布特征

乳脂球膜是厚度為10～20 nm的3層有序膜結(jié)構(gòu)[5]。乳脂球膜最內(nèi)層是由被脂肪小滴包圍著的極性脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成的單層膜，緊接著是位于雙分子層膜內(nèi)表面的高密度蛋白質(zhì)層，最后形成真正的極性脂和蛋白質(zhì)雙層膜[6]。細(xì)胞質(zhì)在內(nèi)部高密度蛋白質(zhì)層和外部雙膜層之間形成“細(xì)胞質(zhì)新月”結(jié)構(gòu)[7]。乳脂球膜中的蛋白質(zhì)成分主要位于外部的雙層膜，呈現(xiàn)不對稱分布，與甘油三酯有很強親和力的脂肪分化相關(guān)蛋白(adipophilin，ADPH)位于極性脂質(zhì)單層膜上，黃嘌呤氧化脫氫酶(xanthine oxidoreductase，XOR)附著在單層膜的內(nèi)表面，并與外層膜的跨膜蛋白嗜乳脂蛋白(butyrophilin，BTN)以及ADPH緊密連接，在脂雙層中形成超分子結(jié)構(gòu)，對乳脂球膜的裝配和穩(wěn)定起著重要的作用[8]。其他膜蛋白部分鑲嵌或松散結(jié)合在脂雙層上。然而，Robenek等[9]研究認(rèn)為乳脂球膜中ADPH、BTN和XOR三者彼此之間并無緊密連接結(jié)構(gòu)，ADPH和BTN在單層膜和雙層膜上都有分布，ADPH主要位于雙層膜的內(nèi)表面，小部分位于單層膜上；而BTN主要位于單層膜上，小部分位于雙層膜的外表面；XOR廣泛分布在單層膜上。之后，Vanderghem等[10]研究發(fā)現(xiàn)XOR在乳脂球膜外面也有分布，進(jìn)而重新構(gòu)建了MFGMPs分布模型。

1.2 MFGMPs的功能

目前，通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法在羊乳脂球膜中總共鑒定出約500種蛋白[11]，主要包括黏液蛋白1(mucin 1，MUC1)、乳凝集素(lactadherin，LDH)、XOR、BTN和ADPH等。

MUC1是一種高分子質(zhì)量的糖蛋白，屬黏蛋白家族，因其cDNA在目前已知的9種黏蛋白中第1個被克隆而得名[12]。MUC1除了存在于乳中，也出現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中，可作為乳腺癌診斷學(xué)中的一種潛在蛋白質(zhì)分子標(biāo)記物。此外，MUC1在抑制幽門螺旋桿菌、艾滋病毒及對抗輪狀病毒感染等方面發(fā)揮著重要的作用[13-15]。

LDH又稱為乳脂肪球表面生長因子8(milk fat globule-epidermal growth factor 8，MFG-E8)，是乳脂球膜中的一種主要糖蛋白[8]。LDH在乳腺泌乳晚期及衰退過程中起著關(guān)鍵性的作用，能識別凋亡細(xì)胞，激活吞噬細(xì)胞吞噬凋亡的上皮細(xì)胞，避免乳腺炎癥的產(chǎn)生[16]。此外，LDH還具有介導(dǎo)精卵結(jié)合，促進(jìn)血管壁的發(fā)育和血管重建，修復(fù)和維持腸上皮細(xì)胞，促進(jìn)乳腺分支形態(tài)發(fā)生，對抗輪狀病毒感染等一系列生物學(xué)功能[17-21]。

XOR占MFGMPs總量的20%，屬于鐵-硫-鉬黃素羥化酶家族[22]，是黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)和黃嘌呤還原酶(xanthine dehydrogenase，XDH)的統(tǒng)稱。XDH能夠催化黃嘌呤轉(zhuǎn)變成體內(nèi)重要的抗氧化劑——尿酸，從而保護(hù)組織免受氧化損傷的壓力[23]。XOR具有抗菌作用，主要是通過影響乳中過氧化氫的形成或刺激乳過氧化物酶系統(tǒng)來抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌等細(xì)菌的生長[24]。XOR主要參與乳腺上皮細(xì)胞中乳脂球的分泌，也可對炎癥、免疫應(yīng)答和轉(zhuǎn)錄因子起到調(diào)節(jié)作用，維持機體的正常生化反應(yīng)[25-26]。

BTN是免疫球蛋白家族的成員，是乳腺中唯一的一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，主要集中在乳腺上皮細(xì)胞的頂端質(zhì)膜上[1]，控制著乳脂球的分泌[27]。此外，BTN對腦脊髓炎具有自身免疫功能，還可能參與自閉癥、多發(fā)性硬化癥的免疫調(diào)節(jié)[28-29]。

ADPH是脂滴表面蛋白PAT家族中的一員。ADPH不僅可刺激纖維母細(xì)胞中脂質(zhì)的聚集和脂滴的形成[30]，促進(jìn)長鏈脂肪酸的攝取[31]，而且參與巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)代謝及肺泡Ⅱ型細(xì)胞與纖維母細(xì)胞間的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移[32-33]。Paul等[34]研究發(fā)現(xiàn)載脂蛋白E缺陷小鼠體內(nèi)脂肪分化相關(guān)蛋白基因的失活能減少動脈粥樣硬化斑塊中泡沫細(xì)胞內(nèi)的脂滴數(shù)量，從而防止小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生；且將ADPH缺失的骨髓衍生細(xì)胞移植入載脂蛋白E缺陷小鼠體內(nèi)，能有效抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展。還有研究發(fā)現(xiàn)高脂膳食能通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)促進(jìn)ADPH的表達(dá)，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生脂肪肝[35]。因此，ADPH與動脈硬化性疾病和脂肪肝的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

2 羊MFGMPs組成研究

2.1 山羊MFGMPs

Zamora等[36]運用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)研究了山羊MFGMPs的組成，共檢測出32條蛋白質(zhì)帶，與牛相比，山羊MFGMPs含有更多的XO以及微量蛋白，且在不同山羊個體之間表現(xiàn)出較大的差異性，并表明MFGMPs的數(shù)量及各蛋白之間的相互關(guān)系與MFGMPs所發(fā)揮的生理作用有密切聯(lián)系。Cebo等[37]采用肽質(zhì)量指紋圖譜基質(zhì)輔助激光解吸/電離串聯(lián)飛行時間技術(shù)(PMF MALDI-TOF)研究了山羊乳中的主要MFGMPs，發(fā)現(xiàn)山羊乳中MFGMP主要由脂肪酸合酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)、嗜乳脂蛋白(butyrophilin，BT)、XO、LDH和ADPH組成，與牛MFGMPs存在2點突出差異：其一，山羊LDH由1條多肽鏈組成，而牛LDH由2條多肽鏈組成；其二，山羊乳脂球膜上有酪蛋白結(jié)合，而牛乳脂球膜上無酪蛋白。該研究首次提供了山羊脂肪酸合酶和黃嘌呤氧化酶O-糖基化的證據(jù)，且首次提供了包括MFGMPs總碳水化合物組成在內(nèi)的山羊MFGMPs的全面描述，為更深入的了解MFGMPs在乳脂球分泌機制中的具體作用提供了參考依據(jù)。

2.2 綿羊MFGMPs

Pisanu等[38]采用SDS-PAGE分離技術(shù)結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法(GeLC-MS/MS)對綿羊MFGMPs進(jìn)行了研究，鑒定得到140個綿羊蛋白點，獲得4種豐度較大的MFGMPs，分別為嗜乳脂蛋白亞科1成員A1(BTN1A1)、XOR、LDH、ADPH。該研究優(yōu)化了MFGMPs的提取方法，提供了一個詳細(xì)的綿羊MFGMPs參考圖譜?；诖嗽囼炛械腗FGMPs提取方法，Pisanu等[39]采用雙向凝膠電泳結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜法(2-DE/MS)，獲得了第1個羊MFGMPs雙向凝膠電泳(2-DE)圖譜，成功地從61個蛋白點中鑒別出29種MFGMPs。

2.3 山羊初乳和常乳中MFGMPs的差異性研究

Lu等[40]利用過濾器輔助樣品前處理法結(jié)合質(zhì)譜方法研究了山羊初乳和常乳中MFGMPs的差異，總共鑒別出423種MFGMPs，其中189種蛋白的豐度在初乳和常乳中存在顯著差異，并且參與補體系統(tǒng)，黏著連接和糖代謝過程的MFGMPs僅在初乳中存在。急性期蛋白的豐度在初乳中較高，脂筏蛋白(stomatin，STOM)、黏液素15(mucin15，MUC15)及XDH等的豐度在常乳中較高。此外，在初乳和常乳中都富集大量的保守蛋白和長期抑郁蛋白。這種長期抑郁蛋白也許可以作為山羊分娩后抑郁癥狀的一種潛在的生物標(biāo)記物。該研究為探討泌乳早期與泌乳中期羊乳的營養(yǎng)價值及山羊生理狀態(tài)的差異提供了參考依據(jù)。今后的研究應(yīng)該將新生兒體內(nèi)存在的長期抑郁蛋白作為一個主要關(guān)注點，減少長期抑郁蛋白的數(shù)量也許可以作為提高山羊福利的途徑之一。有關(guān)綿羊不同泌乳時期MFGMPs的差異性研究尚未見報道，而在牛上的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，與初乳相比，常乳中ADPH、BTN、XDH等26種MFGMPs的表達(dá)量上調(diào)，而阿樸脂蛋白A、阿樸脂蛋白E等19種MFGMPs的表達(dá)量下調(diào)，同時泌乳中期的牛MFGMPs總量以及XO和BTN的百分?jǐn)?shù)均低于泌乳早期和泌乳晚期[41-42]。由此可見，不同的物種在不同泌乳時期的MFGMPs存在物種特異性，需要對不同的物種進(jìn)行深入的分析。因此，今后的研究應(yīng)著手于綿羊MFGMPs在整個泌乳階段的差異性研究，以期為揭示泌乳階段對泌乳羊MFGMPs表達(dá)的影響機制提供理論依據(jù)。

2.4 羊患病前后MFGMPs的差異性研究

乳房炎是哺乳動物泌乳期常見的一種疾病，動物在患乳房炎后往往會導(dǎo)致乳蛋白的數(shù)量和種類發(fā)生變化。Addis等[43]在綿羊乳房內(nèi)注射無乳支原體，首次研究了羊在感染乳腺炎時MFGMPs表達(dá)變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羊在感染乳房炎后，參與炎癥反應(yīng)和宿主防御的蛋白、皮層細(xì)胞骨架蛋白、熱休克蛋白以及與氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白等多種MFGMPs的數(shù)量增加，而參與乳脂球代謝和分泌的膜蛋白的豐度顯著降低。這些差異蛋白可作為感染支原體診斷時的參照物，同時可為尋找監(jiān)測臨床和亞臨床乳房炎的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物奠定基礎(chǔ)。Chiaradia等[44]對被葡萄球菌感染而患有亞臨床乳房炎的綿羊乳脂球膜蛋白組成進(jìn)行了分析，檢測到了一些蛋白質(zhì)標(biāo)記物，有助于疾病的早期診斷。

2.5 不同羊品種間MFGMPs的差異性研究

雖然品種之間絕大多數(shù)MFGMPs是相似的，但仍有一些MFGMPs在不同品種之間呈現(xiàn)差異。Pisanu等[45]對世界著名的薩能山羊和撒丁島Sarda山羊的MFGMPs進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Sarda山羊乳脂球平均直徑[(2.73±0.15) μm]顯著小于薩能山羊乳脂球直徑[(3.63±0.27) μm]，且Sarda山羊乳脂球粒徑分布更均勻。拉曼光譜法分析顯示，相同品種羊，乳脂球直徑大小不同，所對應(yīng)的脂質(zhì)圖譜不同；而不同品種羊，乳脂球直徑大小相同，所對應(yīng)的脂質(zhì)圖譜卻極度相似；此外，2個羊品種MFGMPs表達(dá)水平存在顯著差異，薩能山羊乳脂球中的膜蛋白表達(dá)水平較高，而Sarda山羊乳脂球中細(xì)胞質(zhì)蛋白表達(dá)水平較高。上述研究表明MFGMPs和脂質(zhì)的組成存在品種差異，可能與乳脂球的粒徑分布有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)土著品種和被忽視品種往往擁有一些有價值的屬性，強調(diào)了研究生物多樣性的重要性。彭先文等[46]采用SDS-PAGE技術(shù)研究了波爾山羊、成都麻羊、安哥拉山羊×藏山羊F1、建昌黑山羊、安哥拉山羊×建昌黑山羊F15個不同類群的山羊乳MUC1多態(tài)性進(jìn)行了分析，顯示山羊乳MUC1基因和基因型分布存在品種的差異，僅成都麻羊MUC1無多態(tài)性，該結(jié)果為認(rèn)識不同物種或品種的親緣關(guān)系、遺傳結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系提供了一條新的途徑。

3 羊與其他物種間的MFGMPs差異性分析

Cebo等[47]的研究結(jié)果顯示馬、山羊、綿羊、駱駝和牛乳中LDH多肽鏈組成數(shù)量分別為4、1、1、2和2條，體現(xiàn)了LDH的分子多樣性。結(jié)合LDH的生物學(xué)功能，表明LDH的糖基化水平不僅會影響上皮細(xì)胞的生物活性，而且會使得動物的健康受到一定的影響。Yang等[11]采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù)對荷斯坦牛乳、娟姍牛乳、牦牛乳、水牛乳、山羊乳、駱駝乳、馬乳和人乳中的MFGMPs成分進(jìn)行分析，總共鑒別出520種蛋白，其中僅有18種蛋白在物種之間呈現(xiàn)差異，包括黃嘌呤氧化脫氫酶、β-酪蛋白、LDH樣蛋白、膽鹽依賴性酶異構(gòu)體、α蛋白、酪蛋白、BTN1A1、FAS等。根據(jù)主成分分析和系統(tǒng)聚類法可將不同物種乳分為四大類：荷斯坦牛乳、娟姍牛乳和牦牛乳聚為一類；牦牛乳和山羊乳聚為一類；荷斯坦牛乳、娟姍牛乳、水牛乳、牦牛乳和山羊乳聚為一類；駱駝乳、馬乳和人乳聚為一類。這些發(fā)現(xiàn)為探討不同哺乳動物中乳脂球膜的形成機制奠定了理論基礎(chǔ)。Lu等[48]研究了人乳與一些常見的人乳替代品——奶牛乳、牦牛乳和山羊乳中的MFGMPs，發(fā)現(xiàn)人乳與牛乳和山羊乳之間存在2個主要差異蛋白：人乳脂球膜中羧基酯脂肪酶和乳運鐵蛋白的豐度顯著高于牛乳和山羊乳；山羊乳和牛乳之間存在4個主要差異蛋白：山羊乳中XOR和STOM的豐度高于牛乳，而牛乳中ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白G超家族成員2(ATP-binding cassette sub-family G member 2，ABCG2)和BTN的豐度高于山羊乳；奶牛乳和牦牛乳中存在1個主要差異蛋白：牦牛乳脂球膜中CD36蛋白的豐度高于奶牛乳。這種差異MFGMPs的存在有助于了解不同物種的泌乳生理以及不同乳源的營養(yǎng)價值，為嬰幼兒配方奶粉的開發(fā)建立理論基礎(chǔ)。

4 小 結(jié)

目前對不同泌乳時期、不同生理、不同品種羊MFGMPs研究的較多，而高壓、加熱、冷凍等不同環(huán)境條件下對羊MFGMPs的影響研究甚少；對一些羊MFGMPs的命名及作用機制尚不清楚；羊MFGMPs在功能性乳制品和嬰幼兒配方奶粉的應(yīng)用上尚有欠缺。針對羊MFGMPs的上述現(xiàn)狀及一系列問題有待未來進(jìn)一步探討。

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*Corresponding author, associate professor, E-mail: lexp@lzu.edu.cn

(責(zé)任編輯 菅景穎)

New Progress of Milk Fat Globule Membrane Proteins Research for Sheep and Goats

ZHANG Nana1,2LI Wanhong1,2LI Fadi1,2WENG Xiuxiu1,2YUE Xiangpeng1,2*

(1.StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-Ecosystems,CollegeofPastoralAgriculturalScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China; 2.TheInstituteofRuminant,CollegeofPastoralAgriculturalScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China)

Milk protein, consists of caseins, whey proteins, milk fat globule membrane proteins (MFGMPs) and other ingredients, is one of the most important components of the milk and is a major index for evaluating milk quality. MFGMPs is a special sub-unit of milk protein, which has the functions of anti-cancer, anti-virus infection, increasing immunity, etc. Additionally, MFGMPs has a close relationship with the occurrence of multiple sclerosis, autism, coronary heart disease. This paper mainly reviewed the components of MFGMPs in sheep and goat milk and its differential components among different breeds, different lactation stages, different species, and between acute phase and normal phase, which could facilitate us to understand the components, functions and secretion mechanism of MFGMPs better, and thus provide theoretic references for making reasonable weaning strategy for lambs and developing optimal formula of lambs’ milk replacer.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(4)：1117-1123]

sheep milk; milk fat globule; milk fat globule membrane protein; lactation; difference

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.04.005

2016-10-09

國家科技支撐計劃(2015BAD03B05)；甘肅省科技重大專項計劃(1602NKDH020)；甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)專項(GNSW-2015-24)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項(lzujbky-2015-42)；蘭州大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助(lzujbky-2014-198)

張娜娜(1991—)，女，甘肅靜寧人，碩士研究生，研究方向為反芻動物營養(yǎng)學(xué)。E-mail: zhangnn15@lzu.edu.cn

*通信作者：樂祥鵬，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: lexp@lzu.edu.cn

S852.2

A

1006-267X(2017)04-1117-07