馬鞭草中總黃酮的超聲波輔助提取及其抗氧化活性研究

卞杰松，馮紀(jì)南，譚巧燕，鄧斌*

(1.湘南學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)系，湖南 郴州423000;2.湘南學(xué)院 財(cái)務(wù)處，湖南 郴州423000)

0 引言

馬鞭草(Verbena Officinalis L.)又叫鐵馬鞭、自馬鞭、瘧馬鞭，皆以穗類鞭鞘而得名.為馬鞭草科(Verbenaceae)多年生草本植物馬鞭草的全草或根.常生于河岸、草地、荒地、路邊、田邊及草坡等處，全國(guó)各地均有分布［1］.馬鞭草在我國(guó)作為一種傳統(tǒng)的中藥，具有清熱解毒、利尿消腫、活血通經(jīng)等功效，廣泛用于治療傷風(fēng)感冒、水腫、痢疾、黃疸等疾病，被醫(yī)學(xué)專家譽(yù)為21世紀(jì)最具前途的綠色中草藥物之一，全草含有黃酮類、甾醇、氨基酸、內(nèi)酯或酯類和酚性成分［2，3］.鑒于黃酮類物質(zhì)具有抗心腦血管病、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗過(guò)敏、免疫調(diào)節(jié)等作用，馬鞭草黃酮類化合物的研究日益引起了人們的重視［4，5］.黃酮類化合物常用提取方法為有機(jī)溶劑回流提取等，但存在提取時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn).而超聲輔助提取作為一種優(yōu)良的提取方法，具有操作簡(jiǎn)便快捷、提取時(shí)間短及提出率高等特點(diǎn)，目前己廣泛應(yīng)用在生物活性物質(zhì)的提取方面［6，7］.為進(jìn)一步研究馬鞭草黃酮類化合物的功效，充分利用馬鞭草資源，本實(shí)驗(yàn)以馬鞭草中總黃酮提取率為考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的方法對(duì)超聲波輔助提取馬鞭草總黃酮的工藝條件進(jìn)行探討，確定其最佳提取工藝，并對(duì)馬鞭草黃酮類化合物物的抗氧化性進(jìn)行測(cè)定，以期為馬鞭草功能性成分的研究開(kāi)發(fā)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鞭草購(gòu)于郴州市老百姓大藥房，置于烘箱中80℃烘干，粉碎、過(guò)60目篩后置于干燥器中備用.無(wú)水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、鄰苯三酚、Tris、鹽酸(以上試劑均為分析純);蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)10080－200306)，中國(guó)藥品生物研究所.

1.2 儀器與設(shè)備

UV－7502PC型紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司;DHG－9143BS－III型數(shù)顯電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;FA2104N型電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司;KQ－500BE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;SHB－IV雙A型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;SENCO R201L型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申生科技有限公司;DS－1型高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠.

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用無(wú)水乙醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，得到0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液.分別精密吸取 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于 10 mL 比色管中，加無(wú)水乙醇至 5.0 mL，加入質(zhì)量濃度 5g/100 mL NaNO2溶液0.3 mL，搖勻放置6 min，再加入質(zhì)量濃度10 g/100mL Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻放置6 min，最后加1 mol/L NaOH溶液4 mL，用無(wú)水乙醇溶液補(bǔ)至刻度，搖勻放置10 min后，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)比，在510 nm處測(cè)定其吸光度，吸光度(A)與溶液質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A=10.993C+0.0011，R=0.9997.

1.3.2 馬鞭草中總黃酮的提取及含量測(cè)定

稱取處理好的馬鞭草粉末2.000 g于錐形瓶中，在不同條件下進(jìn)行超聲波輔助提取，提取液經(jīng)抽濾后用相同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液定容至一定體積，準(zhǔn)確吸取一定體積的提取液，加0.05 g/mL亞硝酸鈉溶液0.2 mL，搖勻后放置6 min，加0.1 g/mL硝酸鋁溶液0.2 mL，搖勻后放置6 min，加1.0 mol/L氫氧化鈉溶液2.0 mL，再加乙醇定容至10 mL，搖勻，放置15 min，510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，根據(jù)回歸方程由吸光度求出各處理一定體積的提取液中黃酮的含量，并按照(1)計(jì)算出黃酮類化合物提取率.在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取4因素3水平進(jìn)4行L9(34)正交試驗(yàn)，確定最佳提取工藝.

1.3.3 馬鞭草中黃酮類化合物對(duì)羥基自由基的清除率測(cè)定

參照文獻(xiàn)［8］的方法.取5 支具塞試管依次向其中各加入 2.0 mmol/L FeSO42.0 mL、1.0 mmol/L H2O22.0 mL，振蕩，搖勻.再加入6.0 mmol/L水楊酸3.0 mL，搖勻，于37℃水浴加熱15 min.加熱完畢于510 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度A0.之后分別向 5 支試管中加入待試樣品(馬鞭草的乙醇提取物，黃酮含量為 0.4312 mg/mL)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，接著再分別添加超純水 0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 mL，搖勻，繼續(xù)水浴加熱 15 min，待加熱完畢后再次分別測(cè)其吸光度 Ax.對(duì)照實(shí)驗(yàn):用 2.0 mL 蒸餾水取代H2O2溶液，嚴(yán)格重復(fù)上述過(guò)程，測(cè)吸光度Ax0，則樣品對(duì)羥自由基的清除率計(jì)算見(jiàn)式(2).

1.3.4 馬鞭草中黃酮類化合物對(duì)超氧陰離子自由基的抗氧化作用

1.3.4.1 對(duì)超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)［9，10］的方法.取6 支試管，分別編號(hào)為 0、1、2、3、4、5，各加入4.5 mL pH8.2 的50 mmol/LTris－HC1 緩沖液，再分別加入質(zhì)量濃度為 0.4335 mg/mL 的黃酮提取液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，然后依次加蒸餾水 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 mL，混勻后在25℃恒溫水浴中保溫20 min，取出后立即加入在25℃預(yù)熱過(guò)的3.0 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL(以10.0 mmol/LHCl溶液配制)啟動(dòng)反應(yīng).5 min后加4滴10.0 mol/L鹽酸終止反應(yīng).同時(shí)另取 6支試管，分別編號(hào)為 0’、1’、2’、3’、4’、5’，按上述步驟依次加入 Tris－HCl緩沖液、黃酮類化合物提取液和蒸餾水，然后分別加10.0 mmol/L鹽酸0.3 mL，5 min后加4滴10.0 mol/L鹽酸終止反應(yīng).在325 nm 處用管0調(diào)零，測(cè)管0’的吸光度，為A對(duì)照;用管1調(diào)零，測(cè)管1’的吸光度，為A加藥1，再依次用管 2、3、4、5 調(diào)零測(cè)管 2’、3’、4’、5’的吸光度，得 A加藥2、A加藥3、A加藥4、A加藥5.按照式(3)計(jì)算各質(zhì)量濃度黃酮類化合物提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率.

1.3.4.2 對(duì)超氧陰離子自由基生成速度的抑制率測(cè)定

按照上述(黃酮類化合物提取液對(duì)超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定)的反應(yīng)體系，反應(yīng)啟動(dòng)后，每30 s測(cè)一相應(yīng)的A值，至5 min止.將所得的A值與時(shí)間進(jìn)行回歸分析，其斜率為超氧陰離子自由基的生成速度V.然后按公式(4)計(jì)算出各質(zhì)量濃度黃酮類化合物提取液對(duì)超氧陰離子自由基生成速度的抑制率.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)馬鞭草總黃酮提取效果的影響

在超聲提取溫度為60℃、超聲提取時(shí)間20 min、超聲波功率400 W、固液比1∶30(g/mL)的條件下，分別考察體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80% 的乙醇溶液對(duì)馬鞭草總黃酮提取效果的影響，結(jié)果如圖1所示.

從圖1可以看出，提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而提高，當(dāng)乙醇濃度上升至70%以后，總黃酮的提取率提高幅度趨于平穩(wěn)，雖然在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，用80%乙醇作為提取劑時(shí)，得到的提取率最高，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此時(shí)提取出的非黃酮類干擾物質(zhì)也越多，同時(shí)考慮到經(jīng)濟(jì)效益、提取成本等問(wèn)題，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)在60% ～70%范圍內(nèi)是適宜的.

2.1.2 超聲提取時(shí)間對(duì)馬鞭草總黃酮提取效果的影響

在超聲提取溫度為60℃、超聲波功率400 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、固液比1∶30(g/mL)條件下，分別考察超聲提取時(shí)間為5 min、10 min、15 min、20 min、25 min條件下，超聲輔助提取對(duì)馬鞭草中總黃酮提取效果的影響，結(jié)果如圖2所示.

從圖2可以看出，超聲提取時(shí)間在5～20 min之間提取率變化較大，在20 min達(dá)到最大值，然后提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)開(kāi)始下降，這可能是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，黃酮類物質(zhì)易于分解，且時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溫度容易偏高，使細(xì)胞內(nèi)蛋白凝固，黃酮類物質(zhì)不易溶出.因此超聲提取時(shí)間控制在20 min左右較佳，有鑒于此，在以下的正交實(shí)驗(yàn)中提取時(shí)間不再作為一個(gè)主要因素予以考察.

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)馬鞭草中總黃酮提取率的影響

圖2 超聲提取時(shí)間對(duì)馬鞭草中總黃酮提取率的影響

2.1.3 超聲波功率對(duì)馬鞭草總黃酮提取效果的影響

在超聲溫度60℃、超聲時(shí)間20 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、固液比1∶30(g/mL)的條件下，分別考察超聲功率為300 W、400 W、500 W、600 W、700 W時(shí)，提取工藝對(duì)馬鞭草總黃酮提取效果的影響，結(jié)果如圖3所示.

圖3 超聲波功率對(duì)馬鞭草中總黃酮提取率的影響

圖4 超聲提取溫度對(duì)馬鞭草中總黃酮提取率的影響

由圖3可知，隨著超聲功率的提高，總黃酮的提取率逐漸增加，在超聲功率為500 W時(shí)達(dá)到最大，之后反而降低，因此選擇500 W功率為適宜超聲功率.

2.1.4 超聲提取溫度對(duì)馬鞭草總黃酮提取效果的影響

在超聲功率400 W、超聲時(shí)間20 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、固液比1∶30(g/mL)條件下，分別考察超聲提取溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃時(shí)對(duì)馬鞭草總黃酮提取效果的影響，結(jié)果如圖4所示.

從圖4可以看出，隨著提取溫度的升高，總黃酮的提取率也隨之升高，當(dāng)溫度達(dá)到60～70℃時(shí)總黃酮提取率處于較高值，當(dāng)溫度高于75℃以后，總黃酮的提取率隨著溫度升高而開(kāi)始降低，這是因?yàn)闇囟冗^(guò)高時(shí)，乙醇(沸點(diǎn)78℃)對(duì)提取物質(zhì)間的氫鍵的締合力降低，溶解度減小，故總黃酮的提取率減小，提取效果降低.因此，可將超聲輔助提取溫度控制在70℃附近為宜.

2.1.5 固液比對(duì)馬鞭草黃酮類化合物提取效果的影響

在超聲功率400 W、超聲時(shí)間20 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、超聲溫度60 ℃條件下，分別考察固液比為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)時(shí)對(duì)馬鞭草黃酮類化合物提取效果的影響，結(jié)果如圖5所示.

由圖5可知，隨著固液比的增大，總黃酮提取率逐步升高，當(dāng)固液比達(dá)到1∶40后，進(jìn)一步提高固液比，提取率增加趨于緩慢，考慮提取效益、溶劑成本及回收問(wèn)題，選取固液比為1∶40(g/mL)是適宜的.

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，利用極差法確定出乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時(shí)間、固液比、超聲提取溫度為影響馬鞭草中總黃酮提取效果的主要因素，對(duì)上述4個(gè)因素以總黃酮提取率為評(píng)判指標(biāo)，選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)選方案設(shè)計(jì)，其因素水平設(shè)置見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示.

圖5 固液比對(duì)馬鞭草中總黃酮提取率的影響

表1 因素水平設(shè)計(jì)表

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2結(jié)果可知，影響馬鞭草中總黃酮提取率4個(gè)主要因素的主次順序?yàn)?D＞B＞A＞C，即固液比＞超聲波功率＞提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù).通過(guò)極差分析，結(jié)果表明，正交試驗(yàn)得到的最佳提取工藝為:A3B2C3D3，即在提取時(shí)間20 min，選用固液比為1∶40(g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，超聲輔助提取溫度為70℃，超聲波功率為500 W.采用上述最佳提取工藝條件進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到的馬鞭草中黃酮類化合物提取率分別為2.88%、2.87%、2.86%，進(jìn)而得出黃酮類化合物提取率的平均值為2.87%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.121%.由此可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選出來(lái)的馬鞭草中總黃酮提取工藝條件是最優(yōu)的組合，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，具有良好的可操作性和重現(xiàn)性.

2.3 鞭草中黃酮類化合物對(duì)羥自由基的抗氧化性

近來(lái)大量研究成果表明，黃酮類化合物一方面通過(guò)其清除自由基的作用，直接抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、從而提高機(jī)體免疫力而實(shí)現(xiàn)抗癌、防癌的作用，另一方面，該類化合物還能有效地阻止脂質(zhì)過(guò)氧化引起的細(xì)胞破壞，起到天然抗氧化劑的功效［11］.由圖6可以看出，馬鞭草中黃酮類化合物對(duì)羥自由基有很高的清除率，在一定范圍內(nèi)隨著黃酮質(zhì)量濃度的增大，清除率逐漸增大，最高可達(dá)90%以上，也即清除率與黃酮的用量存在著一定的量效關(guān)系.

圖6 馬鞭草黃酮質(zhì)量濃度對(duì)羥基自由基清除率的影響

圖7 馬鞭草黃酮質(zhì)量濃度對(duì)超氧陰離子自由基清除率和抑制率的影響

2.4 馬鞭草中黃酮類化合物對(duì)超氧陰離子自由基的抗氧化性

由圖7可以看出，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，馬鞭草黃酮對(duì)鄰苯三酚自氧化體系所產(chǎn)生的超氧陰離子自由基同樣具有良好的消除和抑制作用，且馬鞭草黃酮清除和抑制超氧陰離子自由基的能力隨著黃酮加入量的增加而明顯上升，即清除和抑制率與黃酮的用量存在著一定的量效關(guān)系.

3 結(jié)論

(1)超聲波提取方法具有操作簡(jiǎn)便、無(wú)需加熱、提取率高、速度快、效果好、提取物結(jié)構(gòu)不被破壞等優(yōu)點(diǎn)，該研究通過(guò)超聲波輔助提取馬鞭草中總黃酮的單因素和正交試驗(yàn)確定了總黃酮提取的最優(yōu)條件:乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)70%、固液比1∶40(g/mL)、超聲功率500 W、超聲溫度70℃條件下提取20 min，在此條件下提取率可達(dá)2.87%.

(2)抗氧化性實(shí)驗(yàn)表明，馬鞭草中黃酮類化合物具有良好的清除羥自由基、超氧陰離子自由基的能力，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，可作為食品功能因子，在醫(yī)藥和保健食品工業(yè)中有著很好的應(yīng)用前景.

［1］張立衛(wèi)，羅玉梅.馬鞭草臨床應(yīng)用近況［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23(03):351－353.

［2］陳改敏，張建業(yè)，洪廣峰，等.馬鞭草中總黃酮的含量測(cè)定［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2006，23(8):798－799.

［3］肖培根.新編中藥志(第三卷)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2002.32.

［4］孟良玉，蘭桃芳，盧佳琨，等.敗醬草中黃酮類化合物的提取及其抗氧化活性［J］.食品科學(xué)，2010，31(24):214－217.

［5］卞杰松，鄧斌，王存嫦，等.超聲波提取馬鞭草中黃酮類化合物的工藝研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20(6):1420－1421.

［6］嚴(yán)偉，李淑芬，田松江.超聲波協(xié)助提取技術(shù)［J］.化工進(jìn)展，2002，21(9):469－651.

［7］趙兵，王玉春，歐陽(yáng)潘，等.超聲波在植物提取中的應(yīng)用［J］.中草藥，1999，30(9):1－3.

［8］曹曉霞，李翠芹，王喆之.翅莖香青中黃酮類物質(zhì)的提取及其抗氧化性研究［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，8(4):692－694.

［9］秦小明，林華娟，寧恩創(chuàng)，等.金花茶葉水提物的抗氧化活性研究［J］.食品科技，2008(2):189－191.

［10］章愛(ài)華，鄧斌，蔣剛彪，等.馬齒莧黃酮提取液抗氧化活性的初步研究［J］.食品科技，2008(8):140－145.

［11］烏蘭格日樂(lè)，白海泉，翁慧.黃酮抗氧化活性研究進(jìn)展［J］.內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，23(3):277－280.