RP-HPLC和紫外分光光度法測(cè)定薇菜黃酮含量的參數(shù)優(yōu)化

李鳳霞,陳珠鈺,孫文笑

(安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院,安徽鳳陽(yáng)233100)

RP-HPLC和紫外分光光度法測(cè)定薇菜黃酮含量的參數(shù)優(yōu)化

李鳳霞,陳珠鈺,孫文笑

(安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院,安徽鳳陽(yáng)233100)

本文選取AlCl3分光光度法和反相高效液相色譜法測(cè)定薇菜黃酮的含量,旨在確定兩種方法的最佳檢測(cè)條件參數(shù)。通過(guò)對(duì)兩種方法涉及的關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化,確定AlCl3分光光度法的最佳條件:以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,在357 nm下測(cè)定,測(cè)得薇菜中黃酮的含量為0.746 mg·g-1;反相高效液相色譜法最佳條件:以甲醇-0.04%磷酸(40∶60/v∶v)為流動(dòng)相,等度洗脫,360 nm下測(cè)定,測(cè)得薇菜中黃酮的含量為0.798 mg·g-1。反相高效液相色譜法測(cè)定精度高,重現(xiàn)性好,但儀器和試劑價(jià)格昂貴;AlCl3分光光度法雖然專一性稍差,但它不需要價(jià)格昂貴的儀器和試劑,一般實(shí)驗(yàn)室均可完成。

薇菜;黃酮;分光光度法;反相高效液相色譜法

薇菜是紫萁科紫萁屬多年生草本蕨類植物,資源非常豐富,主要產(chǎn)于皖南山區(qū)和大別山區(qū)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1],黃酮類化合物是一類低分子量的、廣泛分布于植物界的天然植物成分,主要成分是蘆丁。大量研究證明[2],黃酮類化合物具有抗癌、抗病毒、抗菌、抗炎、抗過(guò)敏、抗血管脆性和血小板聚集及抗糖尿病并發(fā)癥等多種生理活性與藥理作用。黃酮類化合物在人體內(nèi)不能直接合成,只能從食品中獲得,因此近十多年來(lái)各國(guó)科學(xué)家積極研究如何從植物體中提取純度高、活性強(qiáng)的天然黃酮成分,并進(jìn)一步加工成具特異功能的保健食品和藥品等。因此,能夠準(zhǔn)確測(cè)定薇菜中黃酮的含量是對(duì)薇菜黃酮深入研究的必要條件之一。

目前,測(cè)定黃酮總含量的方法主要有分光光度法[3-6]、高效液相色譜法[7-10]、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法。本研究擬采用AlCl3分光光度法和反相高效液相色譜法來(lái)測(cè)定薇菜中總黃酮的含量,為薇菜黃酮總含量的測(cè)定提供技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

用最小二乘法計(jì)算回歸方程:Y=11.0285X+ 0.0111(Y代表吸光度,X代表濃度)。

1.5.2 反相高效液相色譜法

1.5.2.1 色譜條件

色譜柱:ZORBAX SB-C18(4.6×250mm 5μm);流動(dòng)相:甲醇-0.04%磷酸(40∶60/v∶v),等度洗脫,水為超純水,波長(zhǎng)360nm,流速1mL· m in-1,柱溫35℃,進(jìn)樣量20μL,手推進(jìn)樣,Waters 2487紫外檢測(cè)器。

1.5.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0023g,放入25mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,經(jīng)0.45微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣,待色譜分析,色譜圖見(jiàn)圖1。

1.1 原料

將采摘后的新鮮薇菜切段,曬干。將曬干后成段的薇菜經(jīng)數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱烘干直至恒重,經(jīng)過(guò)粉碎機(jī)粉碎,過(guò)30目篩成薇菜粉末,備用。

1.2 試劑

三氯化鋁(AR);無(wú)水乙醇(AR);磷酸(AR);蘆丁:中國(guó)藥品生物制品檢定所(純度≥95%);甲醇(色譜純,美國(guó)TED IA)。

1.3 儀器

UV-250島津紫外分光光度計(jì);高效液相色譜儀:Waters 1525 BinaryhPLC Pump。

1.4 薇菜黃酮的提取

薇菜中黃酮的提取參考文獻(xiàn)[11]。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 AlCl3分光光度法

1.5.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0079g,放入25mL容量瓶中,用70%的乙醇定容至刻度,吸取母液5mL,放入25mL容量瓶中,再用70%乙醇定容至刻度,得0.0632mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5.1.2 最大波長(zhǎng)的確定

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液放入1cm石英比色皿中,在UV-250島津紫外分光光度計(jì)從200nm掃描到700nm,掃描出最大波長(zhǎng)為357nm。

1.5.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00和5.00 mL放入10 mL容量瓶中,分別加入70%乙醇至5mL,再用1%AlCl3定容至刻度,分別放入1cm石英比色皿中在UV-754分光光度計(jì)上,波長(zhǎng)為357nm處測(cè)定吸光度值。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

由圖1可以看出,色譜圖上有一個(gè)很明顯的峰,但考慮到標(biāo)準(zhǔn)品的純度問(wèn)題,把出峰時(shí)間延長(zhǎng)至20m in。從圖上看來(lái),效果較好。但這個(gè)色譜峰是由兩個(gè)峰組成的,表明標(biāo)準(zhǔn)品有兩個(gè)組分組成,另一個(gè)組分為蘆丁的異構(gòu)體,由于要測(cè)定的是總黃酮的含量,因此,這對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響,可以用這個(gè)峰表示蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰進(jìn)行定性定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AlCl3分光光度法測(cè)定薇菜中黃酮

精密吸取提取后的薇菜溶液0.5mL放入50mL容量瓶中,用70%乙醇定容至刻度,得樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液,吸取樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液5份,每份1mL,按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備操作,空白溶液為參比,測(cè)定吸光度值,并代入回歸方程,計(jì)算出黃酮含量表1。

表1 分光光度法的測(cè)定結(jié)果

由結(jié)果可以看出,加入1%AlCl3減少花色素等酚類物質(zhì)的干擾,從而可以提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于提取后的薇菜溶液中黃酮含量太大,可能導(dǎo)致分光光度法測(cè)定時(shí)結(jié)果不精確,因此,將薇菜溶液稀釋了100倍,這樣在計(jì)算薇菜溶液中黃酮含量時(shí),應(yīng)該乘以這個(gè)稀釋的倍數(shù),最后計(jì)算出薇菜溶液中黃酮含量的平均值為0.746 mg·g-1。

2.1.1 精密度試驗(yàn)

2.1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液精密度

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0mL(空白溶液)和1.00mL 4份,以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備,結(jié)果見(jiàn)表2。

2.1.1.2 樣品溶液精密度

精密吸取樣品溶液1.00mL 5份,以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備,其中1份不加AlCl3試液作空白,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2顯示了蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的精密度和樣品溶液的精密度,從這個(gè)表可以看出,標(biāo)準(zhǔn)品的精密度的RSD=2.6(n=4),樣品溶液的精密度RSD= 3.1(n=4),這兩組數(shù)據(jù)可以表明AlCl3分光光度法的精密度很高,專屬性很強(qiáng),適合總黃酮含量的測(cè)定。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

為了確定AlCl3分光光度法對(duì)測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性,進(jìn)行了一次穩(wěn)定性試驗(yàn),精密吸取樣品溶液1mL 2份,其中一份不加AlCl3試液作空白,以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備,間隔一定時(shí)間測(cè)定吸光度值,結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可以看出,樣品溶液在20m in內(nèi)的RSD=1.5(n=5),說(shuō)明這種方法的穩(wěn)定性很好,只要在20m in內(nèi)測(cè)定結(jié)果都比較穩(wěn)定。

2.1.3 加樣回收試驗(yàn)

為了證明紫外分光光度法測(cè)定薇菜中黃酮含量的準(zhǔn)確性,做了加樣回收試驗(yàn)。精密吸取樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL 3份,分別加入1mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備,以空白溶液作參比。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

表3 樣品溶液的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 樣品加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)以上加樣回收試驗(yàn),測(cè)得平均回收率為96.67%,RSD=1.6(n=3),從結(jié)果可以看出,回收效果很好,適用于總黃酮的測(cè)定。

2.2 反相高效液相色譜法測(cè)定薇菜黃酮

將同期樣品經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣,經(jīng)色譜分析后,結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 RP-HPLC測(cè)定結(jié)果

從樣品的色譜圖來(lái)看,樣品中含有多個(gè)組分,因此,用分光光度法測(cè)定時(shí),這些組分對(duì)測(cè)定的干擾很大。為保證測(cè)定的準(zhǔn)確性,把出峰時(shí)間延長(zhǎng)到20m in。從6m in到12m in開(kāi)始積分,算出峰面積,一共出現(xiàn)了五個(gè)峰,只有峰4和標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間接近,因此可判斷峰4即可代表樣品中黃酮的總組分,可以用于定性定量的分析。

表6 標(biāo)準(zhǔn)溶液精密度試驗(yàn)結(jié)果

圖2 樣品色譜圖

表7 樣品溶液精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表5看出,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的出峰時(shí)間很接近,根據(jù)峰面積的比值可以計(jì)算出樣品溶液中黃酮的含量,由于提取后的薇菜溶液中黃酮含量太大,將薇菜溶液稀釋100倍后測(cè)定。通過(guò)計(jì)算得出薇菜溶液中黃酮含量為0.798 mg·g-1。

2.2.1 精密度試驗(yàn)

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液精密度

吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液,重復(fù)進(jìn)樣5次,按上述色譜條件分析,測(cè)其峰面積,結(jié)果見(jiàn)表6。標(biāo)準(zhǔn)溶液的RSD(%)=1.22(n=5),表明反相高效液相色譜法的精密度很好,受雜質(zhì)干擾小,準(zhǔn)確性好,儀器靈敏度高。

2.2.1.2 樣品溶液精密度

吸取稀釋后的樣品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,按上述色譜條件分析,測(cè)其峰面積,結(jié)果見(jiàn)表7。

表8 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

從表7可知,RSD(%)=2.40(n=5),說(shuō)明這種方法精確度高,適合薇菜中黃酮含量的測(cè)定。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取稀釋后的樣品溶液,每間隔2h進(jìn)樣一次,連續(xù)進(jìn)樣3次,按上述色譜條件進(jìn)樣分析,結(jié)果表明,薇菜中總黃酮峰面積的積分值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)=1.2(n=3),證明反相高效液相色譜法對(duì)測(cè)定薇菜樣品溶液中的總黃酮含量的穩(wěn)定性好,受其他物質(zhì)干擾少,不用重復(fù)試驗(yàn),因此,可以大大節(jié)省處理時(shí)間,測(cè)定精確度高,適合薇菜中總黃酮含量的測(cè)定。

2.2.3 加樣回收試驗(yàn)

吸取稀釋后的樣品溶液,加入定量標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣,結(jié)果見(jiàn)表8。

由表8可知,加樣回收試驗(yàn)的平均回收率為99.4%,RSD=1.3(n=3),可見(jiàn)回收效果很好,該方法適合薇菜中總黃酮的測(cè)定。

3 討論

3.1 檢測(cè)器與流動(dòng)相的選擇

示差折光檢測(cè)器對(duì)流動(dòng)相的流速、組成、柱溫等的穩(wěn)定性要求較高,儀器本身和外界環(huán)境的變化對(duì)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,重現(xiàn)性影響較大,因此,本研究選用紫外檢測(cè)器檢測(cè),效果較好。以甲醇-0.04%磷酸(40∶60/v∶v)組成的流動(dòng)相[12],流動(dòng)阻力小,柱平衡時(shí)間短,分離效果好,保留時(shí)間適中,磷酸的加入也可以抑制黃酮類化合物的酚羥基的電離。從色譜效果圖看,非常理想。

3.2 最佳波長(zhǎng)選擇

在波譜掃描中樣品在316nm處有一強(qiáng)吸收峰,通過(guò)多次預(yù)備性試驗(yàn),從圖2可以看出色譜圖效果良好,因此,反相高效液相色譜分析時(shí)選擇最佳的測(cè)定波長(zhǎng)為360nm。

3.3 兩種方法的可行性

AlCl3分光光度法與反相高效液相色譜法相比穩(wěn)定性稍差[13],且受花青素等一些多酚物質(zhì)的干擾,所以測(cè)定的總含量相對(duì)反相高效液相色譜法偏低。但是兩者相比,反相高效液相色譜法對(duì)樣品的處理比較簡(jiǎn)單,省卻了顯色反應(yīng)的操作步驟,從而也減少了顯色劑和顯色體系的干擾,測(cè)定結(jié)果相比之下,更為準(zhǔn)確。反相高效液相色譜法相對(duì)AlCl3分光光度法而言,測(cè)定精度高,重現(xiàn)性好[14],且用反相高效液相色譜法測(cè)定樣品時(shí),不需要柱前的預(yù)處理,大大節(jié)省了時(shí)間,但儀器和試劑價(jià)格昂貴,而且要有合適的標(biāo)準(zhǔn)品,AlCl3分光光度法雖然專一性稍差,但它適合測(cè)定樣品中總黃酮的含量,且不需要價(jià)格昂貴的儀器和試劑,一般實(shí)驗(yàn)室均可完成。

4 結(jié)論

(1)AlCl3分光光度法的最佳測(cè)定條件是以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品357nm下測(cè)定,薇菜中黃酮的含量為0.746 mg·g-1。

(2)反相高效液相色譜法的最佳測(cè)定條件是以甲醇-0.04%磷酸(40∶60/v∶v)為流動(dòng)相,等度洗脫,360nm下測(cè)定薇菜中黃酮的含量為0.798 mg·g-1。

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新型“TwisterBand TB30”拖鏈系統(tǒng)

現(xiàn)今,易格斯公司開(kāi)發(fā)出了一款創(chuàng)新的緊湊型拖鏈系統(tǒng),可實(shí)現(xiàn)3000度旋轉(zhuǎn)運(yùn)行,且只需極小的安裝空間。這款新型“TwisterBand TB30”拖鏈?zhǔn)状卧?010年北京機(jī)床展上亮相,便吸引了眾多關(guān)注。據(jù)生產(chǎn)商介紹,它可以很好地為能量、數(shù)據(jù)和介質(zhì)提供導(dǎo)向和保護(hù),僅有很小的磨損,具有極高的性價(jià)比。在高速旋轉(zhuǎn)時(shí),各種管線緊緊靠在軸上。

通常在高負(fù)載旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的時(shí)候,易格斯雙彎曲半徑(RBR)拖鏈系統(tǒng)是一種很好的選擇?；诖讼到y(tǒng),最高可實(shí)現(xiàn)540度旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。然而,其所需安裝空間通常很大。作為易格斯公司旋轉(zhuǎn)拖鏈系列中的中型尺寸解決方案,另一種選擇是“TwisterChain”拖鏈系統(tǒng)。這種堅(jiān)固、運(yùn)行順暢的拖鏈同樣也是為高動(dòng)態(tài)一圈半旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)設(shè)計(jì)的。

對(duì)于那些對(duì)安裝空間有著極高限制的情況,我們就需要另外一種全新、緊湊、方便填充的微型解決方案。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的開(kāi)發(fā),易格斯設(shè)計(jì)師展示了其最新解決方案。這種新型“TwisterBand TB30”系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)快速旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng),最大可實(shí)現(xiàn)3000度或更大角度的旋轉(zhuǎn),這主要取決于拖鏈長(zhǎng)度或旋轉(zhuǎn)軸的設(shè)計(jì)高度。由于周長(zhǎng)更小,所以離心力也更小,從而可實(shí)現(xiàn)更高的旋轉(zhuǎn)速度,最高可達(dá)720度/秒。由于其很小的安裝尺寸和緊湊的設(shè)計(jì),此拖鏈系統(tǒng)可安全地用于各種安裝位置(垂直,水平和高空)。

此款塑料拖鏈非常輕,且方便使用。其單組件注塑帶擁有多個(gè)內(nèi)腔,同易格斯公司的專有“方便型”拖鏈設(shè)計(jì)概念相似。無(wú)需打開(kāi)和關(guān)閉鏈接,用戶可方便地把各種線纜放入內(nèi)腔。設(shè)計(jì)師擁有多達(dá)950種“Chainflex”高柔性電纜可供選擇,適用于各種應(yīng)用,同時(shí)可選擇單個(gè)采購(gòu),或以預(yù)裝配接頭形式進(jìn)行采購(gòu)。

這個(gè)新系統(tǒng)的管線是連續(xù)不斷的,可以是電、氣和介質(zhì)管。系統(tǒng)擁有不同的空間分別適合于不同的管線,例如:伺服/動(dòng)力電纜,控制、總線或FOC電纜,以及氣管和油管。據(jù)易格斯公司介紹,一種型號(hào)已經(jīng)可以供貨,更多尺寸和型號(hào)也在計(jì)劃中。

這種小巧設(shè)計(jì)的旋轉(zhuǎn)拖鏈系統(tǒng)主要用于機(jī)器人領(lǐng)域(供應(yīng)一軸和六軸),以及特殊機(jī)器生產(chǎn),例如:雷達(dá)和望遠(yuǎn)鏡等。狹窄空間的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)也常發(fā)生在各種物流,提升和裝配,以及測(cè)試和檢測(cè)中。另一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域則是風(fēng)能系統(tǒng)中。

(吳偉)

The Optim um Cond ition to Determ ine The Flavones Con ten t of The Osmund Through RP-HPLC and The Ultrav iolet Spectrophotom etr ic Method

L IFeng-xia,CHEN Zhu-yu,SUN Wen-xiao
(Anhui Science and Technology University,Fengyang 233100,China)

To selectthe op timum detection condition,thispaperchose AlCl3spectrophotometric and RPHPLC methods to detect the contentof the osmund flavones.The results showed that the op timal conditions of the AlCl3spectrophotometric method are based on rutin as standard,and detection wavelength is 357nm.Under these conditions,the flavanone contentof the osmund is 0.746 mg·g-1;the op timal conditions of REHPLC are the methylalcohol-0.04%phosphoric acid(40∶60/v∶v)for flows,and same density eluted under360nm.Under these conditions,the flavones contentof the osmund is 0.798 mg·g-1.The accurary is very high by RP-HPLC method,and thismeans has better rep roducibility,butRP-HPLC method needs expensive apparatus or regents;The AlCl3spectrop hotometric method haspoor specificity,but itdoes not require expensive equipmentand regents,so many laboratories can p rovide the requirmentfor the method.

osmund;flavonoids;spectrophotometric;RP-HPLC

book=11,ebook=63

TS255

A

1005-1295(2010)04-0011-05

10.3969/j.issn.1005-1295.2010.04.003

2010-03-17;

2010-04-26

安徽省高等學(xué)校優(yōu)秀青年人才基金(2009SQRZ108);安徽科技學(xué)院引進(jìn)人才項(xiàng)目(ZRC2007145)。

李鳳霞(1978-),女,碩士,講師,從事農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工方面的研究。